李劍靜 （廣西岑溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 543200）

牛大腸桿菌病是由大腸桿菌引起牛腹瀉、腸炎、腸毒血癥和敗血癥的一種急性傳染病，甚至引起牛死亡。主要是通過消化道、子宮及臍帶等途徑傳播，患病牛和帶菌牛是最主要的感染源。該病的發(fā)生與舍棚衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)條件等因素有關(guān)。

2017年10月，廣西地區(qū)某牛場部分牛排稀水樣或血樣糞便、呼吸急促，養(yǎng)殖戶用抗生素和葡萄糖生理鹽水進(jìn)行用藥治療，未見效果，隨后有兩頭牛出現(xiàn)死亡。對病死牛進(jìn)行解剖，剖開可見肺出血，肝臟有壞死點(diǎn)、腸壁薄。經(jīng)臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測，確診該病例為大腸桿菌引起牛的死亡，現(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)室診斷

1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采取病死牛的肺臟、肝臟接種劃線于TSA板和麥康凱瓊脂平板，放置37℃培養(yǎng)12~48h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。挑取單個(gè)菌落劃線接種于伊紅美藍(lán)平板上，觀察菌落形態(tài)。

1.2 病原鑒定

采集病死牛的肺等器官，用RNA病毒抽提試劑盒進(jìn)行提取RNA，用特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒。

1.3 生化試驗(yàn)

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，再將菌接到生化微量管進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和H2S試驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

取健康小鼠16只，均分成兩組，一組為試驗(yàn)組8只，另一組為對照8只。試驗(yàn)組小鼠按劑量為 0.3ml/只 （1×109CFU/ml）進(jìn)行腹腔注射，對照組則接種同等劑量的生理鹽水。

1.5 藥敏試驗(yàn)

用生理鹽水稀釋分離株純培養(yǎng)物，吸取150μl稀釋過的培養(yǎng)物放到麥康凱瓊脂平板上，涂勻，用鑷子夾取藥敏紙片放入板內(nèi)并輕輕按壓，37℃培養(yǎng)12~24h后觀察藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

TSA平板和麥康凱瓊脂平板接種24h后，TSA板長出邊緣整齊、中等大小、半透明的菌落；麥康凱瓊脂板長出玫紅色菌落。在伊紅美藍(lán)平板，可見紫黑色的金屬光澤。革蘭氏染色鏡檢可見該菌為兩端鈍圓、革蘭氏陰性短桿菌，符合大腸桿菌的特征。

2.2 病原鑒定

病料經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、電泳，未發(fā)現(xiàn)有牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒。

2.3 生化試驗(yàn)

葡萄糖糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)為陽性；明膠試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)為陰性，符合大腸桿菌的特性。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

接種6h后，試驗(yàn)組小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、厭食等癥狀；24h后有5只小鼠出現(xiàn)死亡，死亡率為62.5% （5/8）；48h后，試驗(yàn)組小鼠共死6只，死亡率為75%。對照組小鼠正常。

對死亡小鼠剖檢，肺部有出血點(diǎn)、肝腫。無菌采集肺部接種于麥康凱瓊脂平板上，結(jié)果與病料分離菌一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)

該菌對頭孢曲松、頭孢噻肟、阿米卡星、卡那霉素敏感；對鏈霉素、利福平、慶大霉素、四環(huán)素、青霉素G、復(fù)方新諾明耐藥。

3 小結(jié)與討論

（1）通過臨床觀察、細(xì)菌分離鑒定、病原檢測、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)確診該病例是由大腸桿菌感染引起的死亡。

（2）拉水樣或血樣糞便的因素很多，主要有沙門氏菌、牛病毒性腹瀉病毒、大腸桿菌、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒感染以及動(dòng)物的飼舍環(huán)境和衛(wèi)生條件等引起。本次試驗(yàn)未分離到沙門氏菌，RT-PCR也未檢測到牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒和牛冠狀病毒，這說明該病例是由大腸桿菌感染引起。

（3）大腸桿菌廣泛存在于自然界，有些特殊抗原血清型的大腸桿菌具有致病性。 馬長賓等[1]報(bào)道血清型O101、O78、O141、O44、O15均可引起犢牛腹瀉。李玉等[2]報(bào)道血清型O35和O78也可使奶?；加腥榉垦?。此外，致病性的大腸桿菌除與O抗原有關(guān)外，還與K抗原、H抗原等有關(guān)。以O(shè)157：H7為代表的大腸桿菌引起的急性腎功能衰竭和溶血性尿毒綜合癥也受到廣泛關(guān)注。由于血清型的多樣性，各地區(qū)的優(yōu)勢血清型可能存在差異，因此篩選優(yōu)勢血清型是非常重要的。本次從病死牛病料中分離到1株具有致病性的大腸桿菌，究竟是由哪種血清型引起牛致病，還有待進(jìn)一步的研究。

近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷加大，動(dòng)物發(fā)病的幾率也越來越大。養(yǎng)殖戶在飼料中盲目加入抗生素防治細(xì)菌感染，加之大腸桿菌具有接觸傳播耐藥基因的特征，從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，甚至出現(xiàn)多重耐藥。尹澤東等[3]報(bào)道96株大腸桿菌均出現(xiàn)多重耐藥。Lee等[4]報(bào)道從韓國家畜糞便中分離株37株大腸桿菌對氨芐青霉素的耐藥性最高，四環(huán)素和鏈霉素次之。本次的試驗(yàn)中，大腸桿菌除了對頭孢曲松、頭孢噻肟、阿米卡星、卡那霉素敏感外，其余對鏈霉素、四環(huán)素等6種藥物具有耐藥性。因此，在治療的過程中要先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，再進(jìn)行用藥，以提高藥物的使用率，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。

[1]馬長賓,陳文武,王忠山,等.致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國動(dòng)物檢疫,2015,32（3）:78-82.

[2]李玉,敖日格樂,王純潔,等.臨床型乳房炎奶牛致病性大腸桿菌血清型研究[J].中國奶牛,2010（12）:40-42.

[3]尹澤東,肖康,金志強(qiáng),等.貴陽市散養(yǎng)戶豬、雞源性大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2010,29（1）:85-87.

[4]Lee J H.Antimicrobial resistance of Escherichia coli O26 and O111 isolates from cattle and their characteristics[J].Veteri-nary Microbiology,2009,135（3/4）:401-405.