李臻　潘教文　王慶國　劉煒

摘要：羧酸酯酶是一大類水解酶家族，催化短鏈脂肪酸酯鍵水解，在植物中參與除草劑代謝、信號分子激活、植物脅迫響應(yīng)等過程。前期通過感染黑條矮縮病水稻數(shù)字表達(dá)譜鑒定到一個在病毒侵染后表達(dá)明顯上調(diào)的羧酸酯酶基因。本研究以水稻中花11為材料克隆了該基因，將其命名為OsCDAP。生物信息學(xué)分析顯示，該基因?qū)儆隰人狨ッ讣易澹c煙草中羧酸酯酶Nthsr203J的相似性最高，可達(dá)95%。組織表達(dá)模式分析顯示，該基因在水稻莖中表達(dá)量最高，且為赤霉素誘導(dǎo)表達(dá)，并受赤霉素合成抑制劑PAC的抑制。該研究為進(jìn)一步解析羧酸酯酶基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；羧酸酯酶基因；OsCDAP；同源比對；組織表達(dá)；赤霉素

中圖分類號：S511：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0010-06

Abstract Carboxylesterases （CXE） belong to a large family of hydrolytic enzyme that catalyzed hydrolysis of short chain fatty acid ester. It were reported that CXE participated in herbicide metabolism， signal molecular activation and biotic stress responses in plants. In our previous research，a CXE gene was identified through RNA-seq， which could be induced to express under rice blacked streaked virus infection. In this research， the CXE gene named as OsCDAP was cloned from rice variety Zhonghua 11. Bioinformatics analysis showed that OsCDAP was homologous to the carboxylate enzyme Nthsr203J in tobacco with up to 95% identities. OsCDAP had the highest expression level in rice stem and was induced by GA and inhibited by GA inhibitor of PAC. This study laid the foundation for further analysis of CXE function.

Keywords Rice； Carboxylesterases gene； OsCDAP； Homologous comparison； Tissue expression； GA

羧酸酯酶（carboxylesterases， CXEs， e.c.3.1.1.2）是一大類水解酶家族，能催化短鏈脂肪酸三酯鍵水解，在動植物以及微生物中廣泛存在，屬于α/β水解酶折疊超家族[1]。該家族蛋白含有8個β折疊，及α螺旋和無規(guī)則環(huán)組成的保守核心區(qū)。CXEs包括穩(wěn)定底物-酶中間體的氧負(fù)離子縫隙的三個甘氨酸和催化三元結(jié)構(gòu)（絲氨酸、天冬氨酸和組氨酸），也具有保守的激素敏感結(jié)構(gòu)域HGG和GXSXG。

CXEs參與調(diào)控多種物質(zhì)活性，在動物中參與神經(jīng)的形成及發(fā)育調(diào)控、有毒物質(zhì)的降解、信息素及激素的降解等生物學(xué)過程，與昆蟲抗藥性的形成密切相關(guān)，因此得到廣泛關(guān)注。但是CXEs在植物中的鑒定及功能分析較少。Marshall等在擬南芥中鑒定了20個CXE基因，并分析了這些CXE基因的組織表達(dá)模式，同時結(jié)合已知的植物CXE基因序列，將CXE分為7類[2]；Newcomb在蘋果中鑒定了16個CXE基因[3]；Islam等從葡萄科植物葛藟中鑒定了6個CXE基因[4]。已有部分CXE基因的功能得到初步驗(yàn)證，其中煙草Nthsr203J[5]、甜椒PepEST[6]、二穗短柄草BdCXE29[7]等基因均參與植物與病原物的互作；擬南芥AtCXE12參與除草劑代謝，對植物毒素具有解毒作用；番茄Lehsr203J能夠通過水解茉莉酸甲酯和水楊酸甲酯成為有活性的茉莉酸和水楊酸，釋放信號分子，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[8]；輻射松PrMC3可能在細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮作用[9]。以上研究進(jìn)展顯示，CXEs在除草劑活性的調(diào)控、植物激素信號物質(zhì)的活化、植物響應(yīng)脅迫等過程中具有作用[10]。因此開展植物羧酸酯酶的研究，對于解析該類基因生物學(xué)功能具有重要意義。

課題組前期在水稻黑條矮縮病相關(guān)基因數(shù)字表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，鑒定到一個表達(dá)明顯上調(diào)的基因，功能注釋為羧酸酯酶17（CXE17）， KEGG預(yù)測其參與赤霉素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。本研究克隆了該基因，并將其命名為OsCDAP（LOC_Os11g04350），序列比對分析顯示，該基因含有羧酸酯酶保守序列。該基因在水稻莖中表達(dá)量最高，為赤霉素誘導(dǎo)表達(dá)，并受赤霉素合成抑制劑PAC的抑制，推測該基因可能通過參與對赤霉素的響應(yīng)從而參與水稻株高的調(diào)控。該工作對于完善羧酸酯酶家族研究，從而深入解析羧酸酯酶在植物中的功能具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料：水稻中花11種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

菌株與載體：農(nóng)桿菌菌種LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)購自Transgen公司（山東濟(jì)南雨同生物科技有限公司）；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa（日本）公司；植物雙元表達(dá)載體p1301-bar-UBI由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫孚江教授惠贈，該載體是以pCAMBIA1301為骨架改造而成，含有除草劑Basta篩選基因和單子葉植物Ubiqutin啟動子。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase以及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 均購自TaKaRa公司（大連寶生物）；植物RNA提取試劑盒TransZol Plant （Code： ET101-01） 以及Taq DNA Polymerase購自Transgen公司；質(zhì)粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒購自博大泰克公司；熒光定量PCR所用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Code：13135900）試劑購自羅氏公司；除草劑PPT購自Sigma公司；除草劑Basta（有效成分PPT=18%）購自日本農(nóng)藥株式會社；所用引物均由上海英濰捷基公司合成；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照TransZol Plant試劑盒說明書提取水稻組織總RNA，并參照TaKaRa PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將檢測合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 OsCDAP基因克隆及生物信息學(xué)分析

以反轉(zhuǎn)錄的水稻葉片單鏈cDNA為模板，根據(jù)OsCDAP基因的核苷酸序列（NCBI登陸號：XP_015615813.1），設(shè)計(jì)并合成特異性引物，OsCDAPF：5′-GCCAAGATAGCAAGAGAGTCC-3′； OsCDAPR：5′-GATAGCTGCACTCTGCACATG-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 10 min；94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。獲得的DNA片段連入克隆載體pMD18-T中，經(jīng)酶切鑒定后，陽性質(zhì)粒由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測序室進(jìn)行序列測定。

利用水稻基因組注釋網(wǎng)站Rice Genome Annotation Project （http：//rice.plantbiology.msu.edu）對OsCDAP的基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白基本信息進(jìn)行分析。利用DNAMAN對該基因與已知CXE基因進(jìn)行同源比對及保守區(qū)分析，利用BLAST進(jìn)行序列比對；對獲得的同源性較高的物種氨基酸序列，利用ClustalX進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，進(jìn)而利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.4 OsCDAP組織表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

水培條件下生長4周的水稻幼苗，分別取其葉片、莖、根，大田中取水稻小穗和成熟種子，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內(nèi)參，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsCDAP基因在不同組織中的表達(dá)模式。

用10-6 mol/L的赤霉素噴施3周大的幼苗葉片，在處理后0、2、6 h和12 h分別剪取水稻葉片提取總RNA，另外用10-5 mol/L的赤霉素合成抑制劑PAC噴施3周大的幼苗葉片，在處理后0、6、12 h分別剪取水稻葉片提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內(nèi)參，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsCDAP基因?qū)A及其抑制劑的響應(yīng)模式。所用引物如下，OsACTINF：5′-TCGGCTACAACCCTGACAA-3′，OsACTINR：5′-CAAACTTGACGGCAATGTGG -3′；qCDAPF：5′-GTACCATTGGGGATGAACAA-3′，qCDAPR：5′-ACGGCGAAGAAGTTGAGATA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsCDAP基因克隆及生物信息學(xué)分析

本研究以水稻中花11單鏈cDNA為模板，克隆了水稻羧酸酯酶家族基因OsCDAP。該基因全長1 071 bp，不含有內(nèi)含子，編碼357個氨基酸，等電點(diǎn)5.25，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為48，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為34，不穩(wěn)定系數(shù)是46.07，屬不穩(wěn)定蛋白。該蛋白含有一個水解酶結(jié)構(gòu)域，不含跨膜區(qū)，序列前端沒有信號肽。與已知的擬南芥羧酸酯酶基因AtCXE17、煙草Nthsr203J、番茄Lehsr203J以及擬南芥赤霉素受體AtGID1A、AtGID1B、AtGID1C編碼蛋白進(jìn)行序列比對顯示，OsCDAP編碼蛋白含有羧酸酯酶的保守結(jié)構(gòu)域HGG和GXSXG，以及絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸組成的催化三元結(jié)構(gòu)，不具有赤霉素受體中GA結(jié)合所必須的精氨酸（R），說明OsCDAP編碼具有水解活性的羧酸酯酶，但不屬于GA受體（圖1）。

同源比對分析顯示OsCDAP編碼蛋白與煙草中羧酸酯酶Nthsr203J的相似性最高，達(dá)到95%；進(jìn)化樹分析顯示，OsCDAP編碼蛋白與谷子和高粱中可能的CXE17的親緣關(guān)系較近（圖2）。

2.2 OsCDAP基因在水稻不同組織中的表達(dá)模式

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內(nèi)參，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析基因OsCDAP的表達(dá)模式。以基因在葉中的相對表達(dá)量為參照，OsCDAP莖中的表達(dá)量相對較高，為43.72，其次在根中的表達(dá)量也較高，是葉中表達(dá)量的21.74倍，但是在種子中基本沒有表達(dá)（圖3）。結(jié)果顯示，OsCDAP不是組成型表達(dá)。

2.3 OsCDAP的誘導(dǎo)表達(dá)模式

用10-6 mol/L的赤霉素噴施3周大的幼苗葉片，隨著處理時間增加，OsCDAP的表達(dá)量逐漸增加，處理6 h后，基因的相對表達(dá)量為3.43；處理12 h時相對表達(dá)量為5.71（圖4）。用赤霉素抑制劑PAC處理3周大的幼苗葉片，隨著處理時間延長，OsCDAP的表達(dá)量逐漸下降，處理6 h，基因相對表達(dá)量為0.25；處理12 h時表達(dá)明顯下調(diào)，基因相對表達(dá)量為0.14（圖5）。結(jié)果顯示赤霉素可以誘導(dǎo)OsCDAP基因的表達(dá)，且其表達(dá)受赤霉素抑制劑的抑制，說明該基因受到赤霉素的正向調(diào)控。

3 討論

植物中CXEs蛋白存在保守的催化三元結(jié)構(gòu)，即絲氨酸、酸性氨基酸和組氨酸形成的活性位點(diǎn)。其中酸性氨基酸通常為天冬氨酸，也有個別基因在此位點(diǎn)為谷氨酸（Glu），例如擬南芥的AtCXE15[2]。本研究選取不同物種中CXEs相關(guān)序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，OsCDAP基因編碼蛋白在該活性位點(diǎn)為保守的天冬氨酸。組氨酸和絲氨酸比較保守，但是對擬南芥的分析發(fā)現(xiàn)其AtCXE10、AtCE14和AtCXE19三個蛋白的保守組氨酸位置和大多數(shù)CXE不同，離蛋白羧基端較遠(yuǎn)，最終將其鑒定為赤霉素受體蛋白GID1s[11，12]。雖然OsCDAP結(jié)構(gòu)域與GID1s的結(jié)構(gòu)域相似，但是其不含有GA受體與GA結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)Arg265，而含有組氨酸活性位點(diǎn)，因此認(rèn)為該基因是作為羧酸酯酶在植物體內(nèi)發(fā)揮作用。

組織表達(dá)模式分析能夠確定該基因的主要表達(dá)部位，從而為進(jìn)一步分析其功能提供線索。利用半定量方法分析擬南芥中鑒定的20個CXE基因，發(fā)現(xiàn)其組織表達(dá)模式有很大差異：20個基因中的13個基因在所有檢測組織中均有表達(dá)，另外7個基因中有4個基因（AtCXE7、AtCXE8、AtCXE13、AtCXE17）只在地上部分檢測到表達(dá)，在根中未檢測到表達(dá)；有2個基因AtCXE3、AtCXE9只在花和果實(shí)中表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)；只有AtCXE1在各個檢測組織中均未表達(dá)[2]。Souleyre等對蘋果中兩個CXE基因MdCXE1和MdCXE16在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MdCXE1在果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)量低，在果實(shí)成熟時其表達(dá)量達(dá)到頂峰，并且其表達(dá)不受乙烯誘導(dǎo)；MdCXE16在整個蘋果發(fā)育過程中表現(xiàn)為組成型表達(dá)，且受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)13]。Stuhlfelder等從番茄中克隆并純化了1個茉莉酸甲酯水解酶蛋白MJE，該蛋白在根和花中表達(dá)量較高，在莖和葉中表達(dá)量較低，當(dāng)植株外源噴施茉莉酸后，該蛋白在1 h時下調(diào)[8，14]?？傊参顲XEs組織表達(dá)模式復(fù)雜，有組成型，也有組織特異性的，顯示CXEs可參與植物多種生物學(xué)過程并發(fā)揮作用。本研究中OsCDAP在莖中表達(dá)量最高，為葉中的40多倍、小穗中的10倍、根中的2倍，推測該基因在莖的發(fā)育及伸長等過程中發(fā)揮作用。

酯的水解顯著影響植物體內(nèi)代謝物的生化活性，去酯化作用可以產(chǎn)生新的活性功能集團(tuán)，從而進(jìn)行后續(xù)化學(xué)修飾。許多植物信號分子在體內(nèi)都是以酯類非活性的共價物形式存在，當(dāng)植物需要時通過酯酶水解形成活性分子，CXEs蛋白就起到水解這些信號分子的作用，從而調(diào)節(jié)它們的活性，進(jìn)一步影響植物的發(fā)育[15]。例如，CXEs可以將甲基化的水楊酸和茉莉酸酯水解釋放出活性的水楊酸和茉莉酸[16]。玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，IAA-肌醇磷脂的形成和水解受到一個CXE的調(diào)節(jié)，對于維系內(nèi)源激素的動態(tài)平衡起重要作用[17]。赤霉素在植物體內(nèi)也常常以糖酯化形式存在，在玉米中也可以被CXE水解而活化[18]。而且，赤霉素在生物體內(nèi)也可以被甲基酯化，表明活性GA的產(chǎn)生也必須有甲酯酶的存在[19]。誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示，OsCDAP基因受赤霉素的誘導(dǎo)表達(dá)，受赤霉素合成抑制劑的抑制，顯示該基因與GA合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，它可能作為一種羧酸酯酶在赤霉素活性調(diào)控中發(fā)揮作用。相關(guān)功能待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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