張小莉

（陜西省咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000）

藥品質(zhì)量評價標準除理化指標外，還有生物學指標。生物學檢驗包括少數(shù)制劑（如注射劑、植入劑及部分眼用制劑）的無菌檢查和絕大部分非無菌藥品的微生物限度檢查。藥品微生物限度檢查法是指非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。1972年版《中國藥典》開展了藥品微生物限度檢查[1]，但直到1995年版才正式收載此方法。藥品微生物限度是對生產(chǎn)單位所用的藥品原料、器具設備、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生評價的綜合依據(jù)[2]。藥品一旦受到微生物污染，將造成藥品變質(zhì)，主成分分解而失效，也可能分解產(chǎn)生毒素，造成機體反應，引起疾病甚至威脅生命。本研究中從人、機、料、法、環(huán)5個途徑查找藥品受到微生物污染的可能途徑，以尋找控制污染之法。

1 污染途徑分析與控制

1.1 人員

供試液制備過程為主要影響因素，由于供試液制備由實驗人員完成，因此，微生物實驗的操作人員是主要影響因素[3－4]。實驗者因?qū)嵺`經(jīng)驗、理論專業(yè)和文化水平的差異而對同一標準理解不同，操作和檢驗方法選擇不同，可能因操作產(chǎn)生差異而造成最終結(jié)果錯誤。

人員素質(zhì)：操作人員應有極高的職業(yè)素質(zhì)，要有責任心，才能按要求[5]嚴格控制實驗環(huán)境；還要有專業(yè)素質(zhì)，即操作規(guī)范、熟練。人員操作過程保證真實的藥品污染狀態(tài)[6]，不殺死微生物，也不污染樣品，避免因操作不當樣品污染實驗環(huán)境，且嚴格控制檢驗時間（不超過 1 h）。

無菌觀念：微生物實驗室不同于一般理化實驗室，對環(huán)境控制很嚴格，工作人員必須有無菌觀念。首先，進入實驗室的器具應采用適當方法滅菌；其次，工作人員須身體健康，不能帶某些傳染?。ㄈ绺忻埃┻M入實驗室，保證實驗室不被污染；再次，人員裝束符合微生物實驗室要求（如不能佩戴飾物，要求穿潔凈服）[7]；最后，完成實驗及時清理實驗垃圾，以免滋生微生物而污染環(huán)境。

相關規(guī)定：按 2015年版《中國藥典（四部）》通則9203（《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》(以下簡稱通則9203)和通則9205《藥品潔凈室微生物監(jiān)測和控制指導原則》(以下簡稱通則9205）中要求執(zhí)行，其中，通則9203規(guī)定了操作環(huán)境的標準，通則9205規(guī)定了控制環(huán)境頻次的最低要求。

1.2 設備

儀器核檢：包括所用設備檢定[壓力容器、天平、冰箱和培養(yǎng)箱用的溫度監(jiān)測儀、空氣檢測設備（如測定浮游菌、懸浮粒子）]或校準（烤箱、培養(yǎng)箱、加液槍、分液器或刻度吸管）。超凈臺或生物安全柜也要按規(guī)程檢定。環(huán)境處理過程所用的高效過濾器、超凈臺或生物安全柜，檢驗過程的天平，培養(yǎng)過程的培養(yǎng)箱，一方面定期核查，保證運行正常，另一方面定期處理，保證不污染樣品。

設備和耗材優(yōu)化：選用適于本實驗室且易于操作的設備，過去用刻度吸管采樣，現(xiàn)在可用加液槍（加液槍換槍頭比換刻度吸管方便）；配備勻漿儀和水域震蕩儀加速樣品的釋放；渦旋震蕩儀混勻樣品。也可使用一次性耗材，提高工作效率，縮短實驗時間，減少污染。

1.3 物料

檢驗對象：因樣品污染的不均勻性，正確的抽樣方法（抽樣代表性、抽樣環(huán)境）很重要[8]。

培養(yǎng)基：所用培養(yǎng)基須經(jīng)過適用性檢查?，F(xiàn)在，一般實驗室使用商品培養(yǎng)基，且按照藥典或培養(yǎng)基使用說明要求進行配制和嚴格滅菌，既不破壞成分，又可保證滅菌徹底。培養(yǎng)基要求參見通則9203中對培養(yǎng)基的要求。注意高壓后培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH[9]，以保證培養(yǎng)基的靈敏度。保存依賴于其質(zhì)量、貯存條件和培養(yǎng)基種類。制備好的培養(yǎng)基一般可于2～8℃冰箱保存30～60 d[10－11]。

其他：檢驗用水的水質(zhì)須符合實驗要求；實驗室所用消毒液定期更換，以免產(chǎn)生耐受菌株；實驗所用器具及物品應清洗干凈，不殘留抑菌物質(zhì)[12]；注意所用菌種生物特征是否典型。

1.4 方法

合理選擇檢驗方法：《中國藥典》從2005年版開始進行微生物方法學驗證，以保證選用方法準確、可靠。一般參照企業(yè)提供有可靠、準確方法和明確結(jié)論的資料，但也有部分例外，如某企業(yè)產(chǎn)品菌落計數(shù)中產(chǎn)品資料需氧菌總數(shù)僅 10－1用薄膜過濾法，10－2，10－3未說明，如直接選用平皿法，可能出現(xiàn)假陰性，造成漏檢。此時應先與企業(yè)溝通，無果時再選薄膜過濾法。又如食品標準中根據(jù)水來源不同分為生活飲用水、包裝飲用水和飲用天然礦泉水，3種水微生物指標均不同，如果用錯標準導致誤判，將造成浪費或不合格產(chǎn)品流入市場，甚至造成嚴重后果。

菌落計數(shù)誤差控制[13]及控制菌的培養(yǎng)時間：2015年版《中國藥典》選用的培養(yǎng)基應用范圍比以前更適合微生物生長，需氧菌總數(shù)選用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，比以前的營養(yǎng)瓊脂更適于微生物生長。統(tǒng)計霉菌和酵母菌總數(shù)時選擇的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基比玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基）計數(shù)范圍更廣，而且規(guī)定生長細菌也計數(shù)。筆者做某一外用藥物制劑方法適用性試驗時發(fā)現(xiàn)，外用藥金黃色葡萄球菌（30～35℃）預培養(yǎng)時間為18～24 h，按照規(guī)定培養(yǎng)24 h接種至瓊脂平板，陽性對照生長18 h生長良好，但供試品陽性對照培養(yǎng)72 h未生長。預培養(yǎng)時間延長至36 h，供試品陽性對照在瓊脂平板在72 h內(nèi)生長良好。其原因是金黃色葡萄球菌敏感，容易被抑制，由于受到供試液的干擾，微生物受損，修復較慢，延長預培養(yǎng)時間很有必要。

滅菌方法：壓力容器定期用生物指示劑進行滅菌驗證；每次用化學指示卡進行滅菌驗證，保證滅菌徹底。

判定標準掌控：2015年版《中國藥典》通則1107《非無菌藥品微生物限度標準》中有可接受范圍[14]，但如不嚴控生產(chǎn)質(zhì)量，就會造成微生物限度標準要求降低的錯覺。作為生產(chǎn)企業(yè)的標準，有內(nèi)控指標以保證貯存期藥品合格，不能考慮可接受范圍，否則進行檢驗結(jié)果偏差（OOS）調(diào)查[15]。

實驗細節(jié)：一是注意對照試驗，開展陰性對照試驗，以便確定樣品本身實際情況，避免環(huán)境或操作人員帶入，陽性對照（控制菌）實驗則可確認該方法是否適用于本實驗室；二是實驗前正確保存樣品，以避免開檢前污染，同時做好標記，以免混淆樣品。

1.5 環(huán)境控制

樣品檢驗環(huán)境：微生物實驗室藥品嚴于食品[16]，應符合實驗室設計要求，即通則9203對環(huán)境的總要求，實驗室參數(shù)[空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、無菌手套和無菌服的表面微生物和物理參數(shù)（溫度、相對濕度、換氣次數(shù)、氣流速度、壓差）]均須滿足實驗要求。且應依據(jù)通則9205定期監(jiān)測實驗室的空氣質(zhì)量（懸浮粒子、浮游菌、沉降菌）[17]。

檢驗前藥品儲存環(huán)境：保持樣品原有狀態(tài)，做好標記，并保證藥品不受污染和不過度滅菌。

供試品培養(yǎng)環(huán)境：保持培養(yǎng)箱和培養(yǎng)室潔凈。

2 值得探討的問題

除上面提到的問題及相應的控制方法外，在實踐中還遇到以下問題值得探討。

樣品稀釋液選擇：為了讓微生物盡快修復但不是繁殖，一般制樣選擇pH＝7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，但有耐膽鹽革蘭陰性菌檢查項目選擇稀釋劑胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），應觀察菌落計數(shù)是否增加。

制劑與稀釋劑產(chǎn)生反應：如某口服液10 mL加至pH＝7.0無菌氯化鈉蛋白胨100 mL或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL時有沉淀產(chǎn)生，靜置析出固體顆粒物。是否反應產(chǎn)生新物質(zhì)影響原液，有待考證。

培養(yǎng)基與樣品發(fā)生反應：某些成分復雜的中藥制劑如沙門菌的預培養(yǎng)物0.1 mL加至10 mL RV培養(yǎng)基后發(fā)生反應，顏色變成白色，類似于陽性對照培養(yǎng)后的顏色，干擾初步判斷。主要的分離增菌的培養(yǎng)基與樣品發(fā)生反應，造成培養(yǎng)基有效成分損失，可能降低沙門菌的生長能力，以至于影響檢出率。

菌落污染問題：藥品中污染的微生物菌落致病性強于藥典中規(guī)定的控制菌，這種情況下，即使發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)超標或控制菌檢查藥典以外的菌落，也要進行鑒定，確定藥品污染可能的途徑，以采取預防措施。

實驗中陽性對照菌株使用：某些情況下，企業(yè)選用菌種雖然一樣，但亞型不一樣，在第三方實驗室陽性對照不明顯（如沙門菌），不一定是方法問題。這值得注意。

其他：可開發(fā)控制菌鑒定培養(yǎng)基，以減少實驗步驟及微生物分離或鑒定儀器在實驗室的使用，進一步減少人為誤差。

參考文獻：

[1]嚴 佳，鐘桂香，賀全山，等.我國藥品微生物限度檢查的發(fā)展歷程[J].藥學實踐雜志，2010，289（3）：211 － 212.

[2]李佩蓉，范秋汝.藥品微生物限度檢驗的誤差影響因素[J].北方藥學，2011，8（3）：81.

[3]劉金鳳.分析藥品微生物限度檢驗誤差影響因素[J].中國當代醫(yī)藥，2011，18（4）：121.

[4]達朝榮，陳建強.藥品微生物限度檢驗誤差影響因素分析[J].北方藥學，2016，13（1）：177 － 178.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：389－393.

[6]文玉輝.藥品微生物限度檢查的探討[J].山西醫(yī)藥雜志，2003，32（5）：499.

[7]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京：科學出版社，2000：307.

[8]楊 立，陳歷剛.影響微生物限度檢查及方法驗證的影響因素[J].醫(yī)藥衛(wèi)生，2016，2（9）：125.

[9]黃 英.藥品微生物限度檢驗誤差分析[J].中國藥師，2005，8（2）：172 － 174.

[10]陳曉燕.藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基儲存期限的探討[J].中國醫(yī)藥指南，2014，12（19）：111 － 112.

[11]陳新顏.藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基質(zhì)量控制試驗和貯存條件及效期的探討[J].海峽藥學，2015，27（6）：77 －80.

[12]瑪爾江·木飲，薩麗塔娜提·居努司.影響藥品微生物限度檢查及方法驗證的影響因素[J].新疆畜牧業(yè)，2016，6（12）：36 － 37.

[13]楊 立，張 催.藥品在微生物限度檢驗中的誤差影響因素[J].養(yǎng)生保健指南，2016（33）：207.

[14]國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術(shù)指南[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2017：594.

[15]楊 燕，孫夢佳，蔣 波，等.藥品無菌檢查中微生物的鑒定與 OOS 調(diào)查 [J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47（12）：1559－1563.

[16]曹克任.藥品微生物限度檢查和食品微生物限度檢驗的異同[J].中國食品工業(yè)，2012，2（1）：37 －39.

[17]單蘭天，伏 琳，封公喜.藥品微生物限度檢驗誤差分析[J].科技創(chuàng)新與應用，2017（17）：79.