甄 貞 高學(xué)軍 張明輝

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，哈爾濱 150030）

轉(zhuǎn)基因生物（GMO，genetically modified organism）是利用基因重組技術(shù)引入其他生物或物種的基因而培育出來的生物新品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)使農(nóng)作物獲得自身不具有的抗病、抗蟲、耐除草劑、抗逆境和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等特性。轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物自1996年商品化以來，種植面積不斷擴(kuò)大，目前全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已達(dá)到2億多hm2，主要品種為大豆、玉米、棉花、油菜等[1-2]。1996-2016年全球共有30多個國家種植轉(zhuǎn)基因作物，目前我國獲批商品化種植的轉(zhuǎn)基因作物只有抗蟲棉花、抗病番木瓜，種植面積為2.8億hm2，其他轉(zhuǎn)基因作物尚未實(shí)現(xiàn)商品化種植[3-4]。

轉(zhuǎn)基因作物在商品化種植前均經(jīng)過安全評價(jià)，尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物存在安全風(fēng)險(xiǎn)。歐盟委員會歷時(shí)25年，通過130多項(xiàng)研究得出的結(jié)論是：生物技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)，并不比傳統(tǒng)育種技術(shù)危險(xiǎn)。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，目前尚未顯示廣大民眾使用轉(zhuǎn)基因食品后對人體健康產(chǎn)生了任何影響。但由于食用安全評估的長期性和復(fù)雜性，目前也無法定論轉(zhuǎn)基因食品的安全問題，始終爭議較大。為了對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植、種子生產(chǎn)與經(jīng)營、產(chǎn)品加工等環(huán)節(jié)進(jìn)行有效管理，保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，以及進(jìn)一步規(guī)范農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究、試驗(yàn)等活動，我國已制定了相關(guān)法律法規(guī)和檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，由農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因檢測專門機(jī)構(gòu)對相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行檢測。

目前國內(nèi)針對轉(zhuǎn)基因作物種子監(jiān)管、標(biāo)識的要求，主要是基于外源DNA分子特征進(jìn)行定性和定量檢測，以及基于外源蛋白特征進(jìn)行試紙條快速檢測。本文對我國主要農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因檢測方法實(shí)際應(yīng)用情況進(jìn)行了介紹，包括種子產(chǎn)品抽樣、核酸定性、定量檢測（通用元件檢測、品系特異性檢測等）和蛋白檢測（試紙條快速檢測等）方法。為有關(guān)農(nóng)作物種子生產(chǎn)與經(jīng)營、產(chǎn)品加工和管理及研發(fā)人員提供技術(shù)信息。

1 農(nóng)作物種子產(chǎn)品抽樣

在進(jìn)行農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因檢測前需對種子產(chǎn)品進(jìn)行抽樣。通過抽樣檢測實(shí)現(xiàn)從田間作物到農(nóng)產(chǎn)品終端進(jìn)行追溯，從而實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管。目前沒有國際范圍內(nèi)可接受的GMO抽樣標(biāo)準(zhǔn)。如在加拿大和美國，沒有單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品抽樣標(biāo)準(zhǔn)，歐盟、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）和中國分別針對GMO的抽樣制訂了法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)[5]。我國已發(fā)布實(shí)施的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品抽樣標(biāo)準(zhǔn)有：GB/T 19495.7-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測取樣和制樣方法、農(nóng)業(yè)部2031號公告-19-2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抽樣和SN/T 1194-2014植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測抽樣和制樣方法[6-7]。農(nóng)業(yè)行政管理部門根據(jù)檢驗(yàn)性質(zhì)、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)規(guī)范或下達(dá)任務(wù)部門的要求制定詳細(xì)的抽樣計(jì)劃。根據(jù)不同的檢驗(yàn)?zāi)康?，運(yùn)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法制定抽樣計(jì)劃，確保抽樣的合法性和所抽樣品的有效性、代表性和原始性。接收樣品時(shí)應(yīng)檢查并記錄樣品狀態(tài)，建立樣品的唯一識別系統(tǒng)，進(jìn)行分類編號；應(yīng)有專用且適宜的樣品貯存環(huán)境；對被檢方和委托方的樣品及有關(guān)信息妥善保存和保密。制定的抽樣方案應(yīng)包括以下內(nèi)容：抽樣依據(jù)、單位產(chǎn)品的質(zhì)量特性、產(chǎn)品質(zhì)量水平、檢測等級以及抽樣時(shí)間、地點(diǎn)和人員。目前國家和各省農(nóng)業(yè)行政主管部門每年進(jìn)行主要農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因檢測監(jiān)管工作，抽樣覆蓋了絕大部分種植面積，保障了農(nóng)作物的種植安全。

抽樣是準(zhǔn)確檢測和進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的先決條件，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度起到了至關(guān)重要的作用。農(nóng)作物種子抽樣方法可以根據(jù)具體情況選用簡單隨機(jī)抽樣法、系統(tǒng)隨機(jī)抽樣法和分層隨機(jī)抽樣法。抽取樣本時(shí)需查看樣品狀況（包裝、外觀、數(shù)量、型號規(guī)格、特性與狀態(tài)、等級、保存要求等），并記錄相關(guān)信息[8]。

最低樣本量的確定必須滿足檢測方法的極限要求。目前通用的定性PCR方法檢測極限一般為0.1%，即1000粒種子中有1粒轉(zhuǎn)基因種子就可以準(zhǔn)確檢測出來，低于這個含量將不準(zhǔn)確。最低抽樣量可以用種子粒數(shù)表示，根據(jù)農(nóng)業(yè)部頒布的標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 673-2003轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣》規(guī)定，一般情況下，農(nóng)作物種子的最低抽樣量需達(dá)到1萬粒種子，對應(yīng)種子重量至少大豆1.1kg、玉米1.8kg、水稻0.2kg、油菜0.014kg和棉花0.8kg[9]。在實(shí)際操作應(yīng)用中，一般最低取樣量以重量為單位進(jìn)行抽取。GB/T 19495.7標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定農(nóng)作物種子最低檢測量為500g，分2個包裝。在實(shí)際農(nóng)產(chǎn)品種子轉(zhuǎn)基因檢測過程工作中一般要求至少每個樣品需有500g。

2 基于外源DNA分子特征進(jìn)行定性和定量檢測

目前國內(nèi)在農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因檢測中最常用的是以外源基因的特定DNA序列為對象的PCR檢測技術(shù)，分為通用元件特異性PCR檢測、轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測、品系特異性PCR檢測等。通過普通定性PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體攜帶的啟動子、終止子、標(biāo)記基因、外源目的基因等特定序列，判斷其是否為轉(zhuǎn)基因作物[10-11]。應(yīng)用有關(guān)檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測時(shí)，定性PCR方法檢測低限一般為1%，定量PCR方法檢測低限一般為0.1%。歐盟規(guī)定所有轉(zhuǎn)基因成分含量超過0.9%的食品和飼料都必須進(jìn)行強(qiáng)制性標(biāo)識，澳大利亞等國家規(guī)定的閾值為1%，韓國、馬來西亞等國家為3%，日本等國家規(guī)定的標(biāo)識閾值為5%[12]。中國目前采取的是零容忍的強(qiáng)制性標(biāo)簽制度，沒有設(shè)定具體的閾值，只要是符合2002年頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》中規(guī)定的5類17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識。

通用元件特異性PCR主要擴(kuò)增啟動子、終止子和遺傳標(biāo)記基因。啟動子和終止子包括花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、玄參花葉病毒FMV35S啟動子、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS啟動子、NOS終止子和CaMV35S終止子。遺傳標(biāo)記基因包括膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因bar或pat、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTII、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPT、6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因PMI、大腸桿菌中uidA（β-葡萄糖苷酶）基因GUS、綠色熒光蛋白基因GFP等。利用通用元件特異性PCR（執(zhí)行檢測標(biāo)準(zhǔn)：農(nóng)業(yè)部1782號公告-3-2012、農(nóng)業(yè)部1782號公告-6-2012、農(nóng)業(yè)部1782號公告-2-2012、農(nóng)業(yè)部2122號公告-3-2014等），可以初步確定農(nóng)作物種子是否含有轉(zhuǎn)基因成分。

轉(zhuǎn)化事件特異性PCR用于確定農(nóng)作物種子含有哪些外源基因成分[2]，用于轉(zhuǎn)入的抗草甘膦、抗蟲等外源基因的特定DNA序列，例如檢測5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因CP4-EPSPS、Bt殺蟲基因Cry1Ac等，以確定樣品中是否含有這些外源基因，即樣品是否含有相關(guān)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)品。

品系特異性PCR用于擴(kuò)增特定轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品種的特定序列，以確定樣品是否屬于某種轉(zhuǎn)基因品系。在農(nóng)作物種子檢出通用元件后，通常再利用品系特異性PCR進(jìn)一步檢測該農(nóng)作物屬于何種轉(zhuǎn)基因品系。由于通用元件在自然界可能存在少量的基因漂移，造成農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因假陽性，因此利用品系特異性PCR確定轉(zhuǎn)基因品系才能更準(zhǔn)確地確定樣品是否含有轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子。目前國內(nèi)常用的農(nóng)作物種子品系特異性PCR有：轉(zhuǎn)基因大 豆 GTS40-3-2、MON89788、Mon87705、A2704-12、W62等；轉(zhuǎn) 基 因 玉 米 MON810、MON89034、MON88017、TC1507、GA21、Bt10、Bt176、NK603、T25、MIR162等；轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、KF6、KF8、KMD1等；轉(zhuǎn) 基 因 油 菜 GT73、MS1、MS8、RF1、Oxy235等；轉(zhuǎn)基因棉花MON1445/1698、MON15985、MON88913等。通過對這些農(nóng)產(chǎn)品種子的轉(zhuǎn)基因檢測，對國內(nèi)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的非法種植進(jìn)行有力的追溯和進(jìn)一步監(jiān)管。

3 基于外源蛋白特征進(jìn)行試紙條快速檢測

轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物外源目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可以利用以抗體、抗原為基礎(chǔ)的免疫學(xué)蛋白質(zhì)檢測方法進(jìn)行檢測。國外如美國Agdia公司已生產(chǎn)銷售轉(zhuǎn)基因快速檢測試紙條，國內(nèi)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所等研究單位和有關(guān)企業(yè)目前也已開發(fā)了用于農(nóng)作物植株和種子的轉(zhuǎn)基因快速檢測試紙條，用于快速檢測種子或植物葉片等樣品中的CP4-EPSPS、Bar、Bt Cry1Ab/1Ac等外源蛋白，以定性檢測作物是否為該類轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[12]。

試紙條快速檢測法采用雙抗體夾心法，試紙條含有偶聯(lián)了發(fā)光基團(tuán)的外源蛋白的抗體，當(dāng)外源蛋白存在時(shí)會與特異性抗體結(jié)合形成復(fù)合物，添加二抗后產(chǎn)生特異顏色，進(jìn)而顯示檢測結(jié)果為陽性。其具有成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、通用性廣和反應(yīng)速度快、耐儲存、易攜帶等優(yōu)勢。采用試紙條法檢測，測定時(shí)間15～20min，測試結(jié)果準(zhǔn)確率高。試紙條法適用于農(nóng)作物種子在種植、儲運(yùn)以及加工等環(huán)節(jié)的現(xiàn)場大量樣品的初篩檢測，可以有效擴(kuò)大監(jiān)測范圍，降低檢測成本[13]。目前國內(nèi)各省已開始大量推廣應(yīng)用試紙條進(jìn)行農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因初篩檢測工作，顯著降低了檢測成本和擴(kuò)大了監(jiān)測范圍，具有良好的應(yīng)用前景。

4 存在的問題和展望

基于DNA分子特征進(jìn)行定性和定量PCR檢測是目前農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因檢測中最常用的方法，但目前存在通量較小、操作步驟復(fù)雜、周期長、對操作人員的技術(shù)要求高、易污染出現(xiàn)假陽性等問題。另外品系特異性的篩查需要逐個測試各個品系是否陽性，工作量很大[14]。PCR檢測還需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前國內(nèi)外農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因檢測所需要的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不足，保存周期較短，量值表達(dá)方式和形態(tài)尚需優(yōu)化[15-16]。

試紙條法測試只針對某一個外源蛋白，并不是對所有的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物有用。利用試紙條法進(jìn)行檢測，需要采取逐個排除各種外源蛋白的方法來達(dá)到檢測目的，繁瑣、成本高，現(xiàn)有產(chǎn)品還不能完全適用于大批量的農(nóng)作物檢測?；诘鞍椎脑嚰垪l法也不適合檢測經(jīng)過加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。當(dāng)轉(zhuǎn)基因作物不含有相應(yīng)外源蛋白質(zhì)的時(shí)候，也無法采用試紙條法進(jìn)行檢測[17]。

隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種的不斷研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化，轉(zhuǎn)基因新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，越來越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子將逐步進(jìn)入市場，農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)正面臨著巨大挑戰(zhàn)，需要進(jìn)行不斷的升級進(jìn)步才能滿足市場的需要。自2008年我國實(shí)施轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)以來，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也得到了快速發(fā)展[2，18]。國際上也在不斷開展新的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的研究，轉(zhuǎn)基因檢測日趨多樣化、復(fù)雜化，研究快速、靈敏、自動化、低成本和高通量的新型檢測方法已經(jīng)成為國內(nèi)外當(dāng)今的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。已有很多新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP，loop-mediated isothermal amplification）法、數(shù)字PCR方法、多重巢式PCR方法、基因芯片法、PCR核酸試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA，enzyme linked immunosorbent assay）、電化學(xué)法、紅外光譜法、生物傳感器技術(shù)（biosensor）、Western blot檢測技術(shù)、質(zhì)譜（MS，mass spectrometry）等方法[19-22]。這些新技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善，以及新型檢測方法的不斷涌現(xiàn)，將為農(nóng)作物生產(chǎn)和食品安全提供更好的保障。

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