劉振峰 周國旗 陳偉 陳小英 鄒麗 蔡小燕 杜作麗 楊迅 曾慶松 金成靜 吳凡 張怡然
(1遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563000;2貴州中醫(yī)藥大學(xué))
重癥肺炎(SP)是一種進(jìn)展性肺部炎癥,可由局部感染快速演變?yōu)槿硇愿腥?、?yán)重膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)或多器官功能障礙綜合征(MODS)等〔1〕。在所有住院的肺炎患者中,SP的治療一直是學(xué)界研究熱點。近年來在治療上雖有較大進(jìn)展,但抗感染仍是治療SP的核心內(nèi)容,因此清除體內(nèi)感染致病菌和抑制炎癥反應(yīng)對提高SP的存活率尤為重要,研發(fā)一種能夠同時增強機體殺菌能力和抑制炎癥反應(yīng)的藥物是目前治療SP的熱點〔2〕。CTCE-0214 (CTCE)是一種基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1a的小肽類分子模擬物,SDF-1a作為趨化因子CXC家族成員之一,在體內(nèi)能夠激活和募集中性粒細(xì)胞并發(fā)揮抗炎作用,然而SDF-1a在血液中的半衰期很短,這使SDF-1a在體內(nèi)發(fā)揮作用有限〔3〕。CTCE在血液中較穩(wěn)定并能發(fā)揮SDF-1a相似的作用。本研究采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)模型SP小鼠,通過CTCE治療后觀察小鼠肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量、支氣管肺泡灌洗液(BAL)細(xì)胞數(shù)量和BAL中炎癥因子的表達(dá)水平,并探討CTCE對SP的保護作用機制,為SP的治療提供新的方向。
1.1實驗動物和試劑 健康、雄性、CD-1小鼠(7~8周齡),由遵義醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,體重(18±5)g。LPS購自Sigma-Aldrich公司;小鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-2和腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物購自上海生工生物科技有限公司;Trizol 購自美國Promega公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司;蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司;LPS、兔抗小鼠蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、Rac1和β-actin、CTCE、SDF-1a購自Sigma-Aldrich公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Abcam公司;miR-126 inhibitors購自美國Invitrogen公司。
1.2動物模型和分組 將實驗動物隨機分為正常對照組、LPS組、LPS+CTCE組、LPS+SDF-1α組各12只。LPS組小鼠氣管內(nèi)滴注LPS(5 mg/kg),正常組小鼠氣管內(nèi)滴注生理鹽水(5 mg/kg),LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組在小鼠滴注LPS(5 mg/kg)2 h 后通過尾靜脈注射CTCE或SDF-1α(10 mg/kg)。同時在進(jìn)一步實驗中將動物按照數(shù)字隨機分為LPS+CTCE組、LPS+CTCE+miR-126-NC組(陰性對照)和LPS+CTCE+ miR-126 inhibitors組。在LPS(5 mg/kg)造模24 h后處死小鼠并收集肺組織和BAL。
1.3小鼠肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量 各種小鼠在干預(yù)后從股靜脈以2 mg/kg劑量注射2%伊文藍(lán)溶液,分離肺組織,以1 ml/100 mg加入甲酰胺溶液,在酶標(biāo)儀620 nm處測吸光度值,計算肺組織伊文藍(lán)的含量,以此計算小鼠肺毛細(xì)血管通透性。采用干濕重的方法測右下肺濕干重比值計算肺含水量,肺含水量=(濕重量-干重量)/(濕重量)× 100%。將BAL細(xì)胞沉淀重懸于500 μl 1×紅細(xì)胞裂解緩沖液中,在600 r/min離心5 min。將細(xì)胞小丸重懸于500 μl PBS中,用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù),即為BAL細(xì)胞數(shù)量。
1.4BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α測定 采用ELISA測定BAL炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達(dá)水平,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,并在酶標(biāo)儀中測量吸光值。
1.5qRT-PCR 在不同組中,采用Trizol試劑從肺組織中提取總RNA,通過紫外分光光度儀測定OD260/280值,取用OD260/OD280比值在1.8~2.0之間的樣本。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后采用RNA擴增試劑盒通過實時定量PCR擴增cDNA。GAPDH為靶基因內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達(dá)量。
1.6Westrn印跡 在不同組中,采用蛋白提取試劑盒提取肺組織中的總蛋白,然后用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。以每孔加入50 μg的待測蛋白于十烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)-PAGE凝膠,110 V電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,分別加入兔抗小鼠AKT、p-AKT、Rac1和β-actin一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜3×10 min,二抗37℃ 孵育1 h,TBST洗膜3×30 min,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。運用Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值,以β-actin作內(nèi)參,計算相對表達(dá)量。
1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、LSD-t檢驗。
2.1各組肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量比較 與正常對照組比較,LPS組中肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量明顯增加(均P<0.05)。與LPS組比較,LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量明顯減少(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+ SDF-1α組肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(均P>0.05)。見表1。
表1 各組肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量比較
2.2各組BAL中炎癥因子表達(dá)水平比較 與正常對照組比較,LPS組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。與LPS組比較,LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)。見表2。
2.3各組miR-126、AKT、p-AKT和Rac1表達(dá)水平比較 與正常對照組比較,LPS組miR-126表達(dá)水平明顯降低,p-AKT和Rac1表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。與LPS組比較,LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組miR-126表達(dá)水平明顯升高,p-AKT和Rac1表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組miR-126、p-AKT和Rac1表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)。AKT在各組間的表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)。見表2。
2.4低表達(dá)miR-126對CTCE干預(yù)SP小鼠后肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量的影響 與LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組比較,LPS+CTCE+miR-126 inhibitors組中肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量明顯增加(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組肺毛細(xì)血管通透性、肺含水量和BAL細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(均P>0.05)。見表3。
2.5低表達(dá)miR-126對CTCE干預(yù)SP小鼠后miR-126、AKT、p-AKT和Rac1表達(dá)水平的影響 與LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組比較,LPS+CTCE+miR-126 inhibitors組miR-126表達(dá)水平明顯降低,p-AKT和Rac1表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組miR-126、p-AKT和Rac1表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)。AKT在各組間的表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)。見表3。
2.6低表達(dá)miR-126對CTCE干預(yù)SP小鼠后BAL中炎癥因子表達(dá)水平的影響 與LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組比較,LPS+CTCE+miR-126 inhibitors組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達(dá)水平無明顯升高(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)。見表4。
SDF-1a能通過小肽類激動劑模擬其功能,CTCE作為SDF-1a的一種多肽類模擬物,具有更好的穩(wěn)定性和更長的半衰期〔4〕。CTCE的性質(zhì)類似于CXCL12,在體內(nèi)能夠發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究顯示,在LPS誘導(dǎo)的多器官功能障礙綜合征中,CTCE能夠明顯降低IL-6和TNF-α表達(dá)水平〔5〕。同時在LPS 誘導(dǎo)的急性內(nèi)毒素血癥中,CTCE具有抗氧化、抗感染和細(xì)胞保護作用〔5〕。這體現(xiàn)CTCE在抑制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果提示CTCE和SDF-1α均能夠治療SP并抑制炎癥因子,并且CTCE和SDF-1α發(fā)揮的作用未見明顯差異。
miRNAs是一類非編碼的小RNA,長度只有20~24 nt,在生物體基因組中普遍存在〔6〕。目前研究證實,miRNAs只占所有RNA的1.0%左右,但能夠調(diào)控機體30%~50%的基因表達(dá)〔7〕。miRNAs在體內(nèi)參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲、凋亡和炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞生物學(xué)功能〔8〕。隨著對miRNAs研究的深入,越來越多的證據(jù)表明,miRNAs參與SP中發(fā)揮重要作用〔9,10〕。研究顯示,CTCE能夠通過調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126、miR-125b、miR-34a和miR-155的表達(dá)水平抑制敗血癥的進(jìn)展〔11〕。本研究結(jié)果提示CTCE或SDF-1α能夠明顯提高SP中miR-126的表達(dá)量而發(fā)揮作用。然而其作用機制尚未完全明確。
AKT是磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路中重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,在細(xì)胞生長、增殖、遷移和分化中發(fā)揮重要作用〔12〕。Racl是Rho超家族主要成員中的Rac亞家族,AKT是Racl上游分子,AKT/Rac1信號通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要左右〔13,14〕。研究顯示,miR-126能夠通過調(diào)控AKT/Rac1信號通路參與敗血癥中的炎癥反應(yīng)〔15〕。本研究結(jié)果說明在SP中AKT/Rac1通路被激活。為分析在SP中miR-126對AKT/Rac1信號通路的調(diào)控作用,在LPS+CTCE組中加入miR-126 inhibitors進(jìn)行干預(yù),結(jié)果提示CTCE通過促進(jìn)miR-126的表達(dá)水平發(fā)揮SP保護作用和抑制SP中炎癥因子,miR-126能夠抑制AKT/Rac1信號通路的激活。
綜上,SDF-1a模擬物CTCE能夠通過上調(diào)miR-126的表達(dá)來抑制AKT/Rac1信號通路,進(jìn)而對SP發(fā)揮保護作用。CTCE可能成為SP治療的重要藥物。