王凱利 傅 鷹 周明兵,2

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300； 2. 浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州 311300)

SBP(SQUAMOSA promoter-binding-protein，SQUA啟動(dòng)子結(jié)合蛋白)-box基因家族編碼一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子——SBP轉(zhuǎn)錄因子(辛婧， 2006)，由于SBP轉(zhuǎn)錄因子能夠識(shí)別并結(jié)合MADS-box基因SQUAMOSA(SQUA)啟動(dòng)子，所以又被稱為SQUA啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(辛婧， 2006； Chenetal.， 2010)。SBP基因首先在金魚草(Antirhinummajus)中發(fā)現(xiàn)(Kleinetal.， 1996)，近年來，在越來越多的植物中發(fā)現(xiàn)了SBP基因，如，擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Cardonetal.，1997)、水稻(Oryzasativa)(Shaoetal.，1999)、番茄(Lycopersiconesculentum)(Salinasetal.， 2012)、葡萄(Vitisvinifera)(Houetal.， 2013)、大白菜(Brassicarapasubsp.pekinensis)(Tanetal.， 2015)、梅(Prunusmume)(Xuetal.， 2015)、甜瓜(Cucumismelo)(Maetal.， 2015)、菊花(Chrysanthemummorifolium)(Songetal.， 2016)、玉米(Zeamays)(Zhangetal.， 2016)等。但是關(guān)于毛竹(Phyllostachysedulis)中SBP家族基因的分析還未見報(bào)道。

SBP基因編碼的植物SBP轉(zhuǎn)錄因子參與了植物營養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的調(diào)控。Martin等(2010)發(fā)現(xiàn)AtSBP13會(huì)影響擬南芥第1片真葉的發(fā)生，Wu等(2006)發(fā)現(xiàn)AtSBP3與擬南芥芽的發(fā)育有關(guān)。在生殖生長(zhǎng)階段，SBP家族基因還與果實(shí)的成熟有關(guān)(Prestonetal.， 2013)。Jung等(2011)研究發(fā)現(xiàn)AtSBP3，AtSBP4與AtSBP5參與調(diào)控?cái)M南芥營養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換。AtSBP8在植物中可以影響花粉囊與雌蕊群的發(fā)育(Unteetal.， 2003； Xingetal.， 2013)。Yu等(2010)研究發(fā)現(xiàn)AtSBP3，AtSBP9，AtSBP10和AtSBP13可以影響擬南芥花中毛狀體的分布狀況。Teotia等(2015)發(fā)現(xiàn)SBP家族基因是植物開花過程中的年齡基因，并且它們的反饋?zhàn)饔每梢哉{(diào)節(jié)植物開花的時(shí)期。此外，SBP家族基因還廣泛參與植物對(duì)非生物與生物脅迫的應(yīng)答(Houetal.， 2013)。Hou等(2013)發(fā)現(xiàn)葡萄的VvSBP6基因?qū)ν饨绶巧锩{迫應(yīng)答明顯，在高鹽處理與干旱處理時(shí)均出現(xiàn)明顯增高狀態(tài)。SBP基因還參與了對(duì)抗銅(Erikssonetal.， 2004)與真菌毒素脅迫(Stoneetal.， 2005)等應(yīng)答反應(yīng)。SBP家族基因在進(jìn)化上高度保守，具有保守的典型SBP結(jié)構(gòu)域(Tanetal.， 2015)。SBP轉(zhuǎn)錄因子的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有大約76～79個(gè)氨基酸殘基(Cardonetal.，1999； Kleinetal.，1996)，可結(jié)合順式作用元件TNCGTACAA(N表示任意堿基)(Cardonetal.，1997； 1999； Kropatetal.， 2005)，它包括2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。2個(gè)鋅-結(jié)合位點(diǎn)蛋白序列為C-C-C-H 和 C-C-H-C，均具有3個(gè)反平行β折疊片。第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域C端具有1個(gè)NLS結(jié)構(gòu)域(nuclear localization signal)(Yamasakietal.， 2004； Xuetal.， 2015)。2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域各司其職，Yamasaki等(2006)發(fā)現(xiàn)，第1個(gè)鋅-結(jié)合位點(diǎn)的功能為維持SBP轉(zhuǎn)錄因子三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，若缺失位于C端結(jié)合區(qū)的Cys64則SBP轉(zhuǎn)錄因子不能結(jié)合在啟動(dòng)子上，第2個(gè)鋅-結(jié)合位點(diǎn)則引導(dǎo)C端loop環(huán)正確進(jìn)入DNA大溝，進(jìn)行DNA結(jié)合。

SBP基因是miR156的靶基因(Songetal.， 2016)。水稻有19條SBP基因，其中有11條具有miR156位點(diǎn)(Xieetal.， 2006)。miR156不僅可以結(jié)合在基因的編碼區(qū)也可以結(jié)合在 3′UTR區(qū)(3′非翻譯區(qū))(Houetal.， 2013; Lietal.， 2013)。例如，梅有15條SBP基因，有8條SBP基因的編碼區(qū)為miR156的靶點(diǎn)，3條SBP基因的3′UTR為miR156靶點(diǎn)，余下的4條未檢測(cè)到miR156結(jié)合位點(diǎn)。大白菜的miR156可以調(diào)節(jié)SBP家族基因編碼區(qū)或者3′UTR區(qū)(Tanetal.， 2015)。在葡萄(Houetal.， 2013)、擬南芥(Gandikotaetal.， 2007)等其他物種中也有類似的報(bào)道。

miR156是SBP家族基因表達(dá)調(diào)控的重要成員，高鹽脅迫可以引起miR156的表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而抑制SBP基因的表達(dá)(Sunetal.， 2012)。Teotia等(2015)發(fā)現(xiàn)，miR156是擬南芥成花誘導(dǎo)5大途徑(年齡途徑、赤霉素途徑、光周期途徑、春化途徑、自主途徑)中年齡途徑中的一個(gè)關(guān)鍵microRNA。在植物開花過程中，SBP家族基因表達(dá)受到miR156在RNA水平上的調(diào)節(jié)，同樣，某些SBP轉(zhuǎn)錄因子會(huì)反饋調(diào)節(jié)miR156的表達(dá)水平，例如，Wei等(2012)發(fā)現(xiàn)，AtSBP15以結(jié)合miR156B啟動(dòng)子的方式抑制其表達(dá)，而Wu等(2009)發(fā)現(xiàn)AtSBP9與AtSBP10促進(jìn)miR156表達(dá)。

毛竹在我國分布廣泛，依據(jù)第八次全國森林資源清查報(bào)告，我國毛竹林面積為443萬hm2，占竹林總面積的74%(郭起榮等， 2015)。Peng等(2013)公布了毛竹基因組草圖與數(shù)據(jù)，這為毛竹的研究提供了可靠的基因組數(shù)據(jù)支持。自然狀態(tài)下毛竹開花周期長(zhǎng)、結(jié)籽率低(Geetal.， 2017； 張瑩等， 2016)，因此研究毛竹開花相關(guān)基因?qū)τ诿耖_花分子機(jī)制的解析具有重要意義。

本文主要對(duì)與毛竹開花密切相關(guān)的SBP家族基因進(jìn)行全基因組鑒定，并通過生物信息學(xué)工具對(duì)其結(jié)構(gòu)和進(jìn)化模式開展系統(tǒng)的調(diào)查，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析毛竹SBP基因在毛竹的不同組織部位及在鹽脅迫過程中的表達(dá)模式，為毛竹SBP家族基因功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛竹的SBP家族基因序列的獲得、篩選及進(jìn)化樹的構(gòu)建

為了鑒定毛竹的SBP家族基因序列，首先在PlanTFDB數(shù)據(jù)庫(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)下載擬南芥和水稻SBP家族基因蛋白序列，然后在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.bamboogdb.org/index.jsp)下載毛竹基因組蛋白序列。以擬南芥和水稻的SBP家族基因序列為query，通過blastp檢索毛竹SBP家族基因蛋白序列(E<-10)。為了剔除假陽性序列，利用MEME軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)檢索毛竹SBP家族基因蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域。

將毛竹SBP家族基因序列命名為PeSBP-N(N為序號(hào))。

鑒定出的陽性毛竹SBP家族基因蛋白序列，利用MEGA6.0軟件，通過最大似然法(maximum likelihood，ML)分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的最佳模型。根據(jù)分析出的最佳進(jìn)化模型構(gòu)建毛竹SBP家族基因蛋白進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2 毛竹、擬南芥和水稻SBP家族基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

將擬南芥、禾本科(Gramineae)植物水稻與毛竹SBP基因家族蛋白序列通過MEGA 6.0 軟件比對(duì)，通過最大似然法(maximum likelihood，ML)分析構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹的最佳模型。根據(jù)分析出的最佳進(jìn)化模型構(gòu)建3個(gè)物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.3 毛竹SBP家族基因結(jié)構(gòu)分析

在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.bamboogdb.org/index.jsp)下載SBP家族基因?qū)?yīng)的DNA序列，并在scaffold的位置，利用Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)軟件分析毛竹SBP家族基因結(jié)構(gòu)。

1.4 毛竹SBP家族基因miR156靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.bamboogdb.org/index.jsp)下載毛竹miR156 基因序列，利用 psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?function=3)軟件檢索毛竹SBP家族基因中miR156靶位點(diǎn)。

1.5 毛竹SBP家族基因表達(dá)量分析

毛竹種子種植于泥炭∶蛭石∶珍珠巖體積比為1∶1∶1的人工培養(yǎng)基上，放置于溫室，16 h/8 h晝夜時(shí)數(shù)，23 ℃/18 ℃晝夜溫度，相對(duì)濕度控制在55%～60%(Wuetal.， 2015)。待株高達(dá)20～25 cm時(shí)，分別選取根、莖、葉(圖1A)立即放于液氮中速凍。

2015年6—7月間在廣西靈川縣收集毛竹花序樣品，將毛竹花序發(fā)育分為4個(gè)階段： 花序形成初期(P1)、小穗的分化(P2)、穎花的分化(P3)和小穗的生長(zhǎng)(P4)(圖1B)(郭起榮等， 2015)。收集4個(gè)階段的花器官，迅速將樣品放入液氮速凍。

以上述相同的方法種植毛竹實(shí)生苗，待株高到達(dá)20～25 cm時(shí)，對(duì)照組澆灌無菌水，試驗(yàn)組澆灌等量200 mmol·L-1的NaCl溶液(張智俊等， 2011)，分別在第1天、第3天、第5天取毛竹葉片，對(duì)照組分別命名為CK1，CK2與CK3，試驗(yàn)組分別命名為T1，T2與T3，迅速將樣品放入液氮速凍。

所有樣品通過Trizol試劑(TaKaRa，日本)提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以毛竹NTB基因(Nucleotide Tract-Binding Protein)為內(nèi)參基因(Fanetal.， 2013)，通過Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)SBP家族基因引物(表1)。選用SYBR? Premix Ex TaqTMII定量試劑(TaKaRa 日本)，在 CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)上進(jìn)行擴(kuò)增： 95 ℃ 30 s預(yù)變性； 95 ℃ 5 s變性，55 ℃ 30 s復(fù)性延伸，40個(gè)循環(huán)； 最后得到熔解曲線。

表1 毛竹SBP家族基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 The primer sequences used in the quantitative real-time fluorescence PCR of Phyllostachys edulis SBP family genes

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹的SBP基因家族的鑒定與進(jìn)化關(guān)系分析

在PlanTFDB數(shù)據(jù)庫分別獲得15條擬南芥和19條水稻SBP家族基因序列，通過blastp比對(duì)獲得37條疑似毛竹SBP家族基因序列。通過MEME軟件獲得具有完整SBP結(jié)構(gòu)域的基因18條(表2，圖2 A，B)。毛竹中SBP結(jié)構(gòu)域自C-Q-V到R-R-R，共2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和1個(gè)核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域(NLS)，共有74個(gè)氨基酸殘基(圖2C)。

通過MEME軟件鑒定出的18個(gè)結(jié)構(gòu)域中，Motif 2和Motif 1組成完整的SBP結(jié)構(gòu)域(圖2A)。Motif 2是第1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(C-C-C-H)，Motif 1是第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(C-C-H-C)和NLS結(jié)構(gòu)域(核定位信號(hào))(圖2C)。18條SBP蛋白中Motif超過5個(gè)的有10條(圖2B)。

毛竹18條SBP家族基因蛋白序列最佳進(jìn)化樹分析模型為JTT+G+I，重復(fù)1 000次，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)近可分為6組(圖2B)。

表2 毛竹SBP家族基因信息Tab.2 The information of Phyllostachys edulis SBP family genes

圖2 毛竹SBP家族基因蛋白序列保守結(jié)構(gòu)鑒定Fig.2 Characterization of conserved motifs of amino acid sequences of Phyllostachys edulis SBP family genesA. 毛竹SBP家族基因蛋白序列18個(gè)保守結(jié)構(gòu)域； B. 毛竹SBP家族基因保守基序分布圖，每一個(gè)Motif都分別以不同的彩色背景與數(shù)字標(biāo)注，左側(cè)為進(jìn)化樹； C. 毛竹SBP 蛋白序列SBP結(jié)構(gòu)域，利用DNAMAN獲得多序列比對(duì)結(jié)果，2個(gè)鋅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域與NLS已經(jīng)標(biāo)注。氨基酸的高度表示此處氨基酸的保守性。A. Eighteen motifs of SBP transcription factor. B. Motif distribution of P. edulis SBP family genes. Each motif is represented by a colored block with a number. The left is phylogenetic tree of P. edulis SBP family genes. C. Multiple sequence alignment and sequence logo of the P. edulis SBP domain. Multiple sequence alignment was performed using DNAMAN. The two conserved zinc finger and NLS are indicated. The overall height of the stack indicates the sequence conservation at that position.

2.2 毛竹、擬南芥和水稻SBP基因親緣關(guān)系分析

擬南芥、水稻與毛竹3個(gè)物種SBP家族基因蛋白序列最佳進(jìn)化模型為JTT+G，重復(fù)1 000次。54條SBP蛋白序列可以分為12組(Clade1-Clade12)(圖3)。毛竹SBP家族基因與水稻SBP家族基因親緣關(guān)系最近，每一條毛竹中的SBP蛋白序列均能找到進(jìn)化關(guān)系相近的水稻SBP轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 擬南芥、水稻與毛竹中SBP 家族基因進(jìn)化關(guān)系Fig.3 Unrooted phylogenetic tree of SBP family genes from Phyllostachys edulis，Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.3 毛竹SBP基因結(jié)構(gòu)

通過Gene Structure Display Server 2.0軟件分析，得到毛竹SBP家族基因DNA序列中內(nèi)含子、外顯子、 5′UTR和 3′UTR的分布情況(圖4 A)。18條SBP家族基因的平均長(zhǎng)度為5 464 bp。Group1、Group4與Group5相比于Group2、Group3和 Group6 SBP家族基因DNA序列較長(zhǎng)。PeSBP2、PeSBP5和PeSBP14的內(nèi)含子與外顯子最多，均有10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子；PeSBP13僅有1個(gè)內(nèi)含子與外顯子。

2.4 毛竹SBP家族基因miR156靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫里共找到miR156序列7條，分別為Pe-miR156b以及Pe-miR156e-1-Pe-miR156e-6。經(jīng)過DNAMAN比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，Pe-miR156e-1-Pe-miR156e-6序列完全一致，序列為UGACAGAAGAGAGUGAGCACA，共21 nt； 而Pe-miR156b為GACAGAAGGGAGUGAGCACA，共有20 nt，相比較Pe-miR156e，缺失第1個(gè)堿基U并且第10位堿基為G，而Pe-miR156e第10位堿基為A(圖4B)。

將7條miR156序列與毛竹SBP基因序列比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)，有10條SBP家族基因序列有miR156靶位點(diǎn)，9條基因的miR156靶位點(diǎn)位于基因的編碼區(qū)，1條位于3′UTR 區(qū)(圖4B)。PeSBP8，PeSBP10，PeSBP11，PeSBP17與PeSBP18的miR156靶位點(diǎn)位于各自第4外顯子處，PeSBP15，PeSBP16 miR156靶位點(diǎn)位于各自第3外顯子處，PeSBP9 miR156靶位點(diǎn)位于其第7外顯子處，PeSBP12 miR156靶位點(diǎn)位于其第4內(nèi)含子處，僅PeSBP13的miR156靶位點(diǎn)位于3′UTR區(qū)。并且miR156靶位點(diǎn)均位于基因接近尾部的位置(圖4A)。

圖4 毛竹SBP家族基因結(jié)構(gòu)及miRNA靶位點(diǎn)Fig.4 The structure of Phyllostachys edulis SBP family genes and target sites of miRNAA. 毛竹SBP家族基因內(nèi)含子、外顯子、5′與3′UTR分布圖。黑色直線表示內(nèi)含子，左側(cè)藍(lán)色圓柱形表示5′UTR，右側(cè)藍(lán)色圓柱形表示3′UTR，黃色圓柱形表示外顯子。紅色標(biāo)記為miR156位置。標(biāo)尺標(biāo)注了基因的長(zhǎng)度。B. 毛竹miR156序列與毛竹SBP 家族基因 DNA序列比對(duì)圖，數(shù)字表示堿基位置。A. Exon-intron structures of P. edulis SBP family genes. Phylogenetic tree was constructed based on P. edulis SBP protein sequences. UTR, exons and introns are indicated by blue rounded rectangles, yellow rounded rectangles, and black lines, respectively. Red line indicated the miR156 position. The scale represents the lengths of the genes. B. Multiple sequence alignment of Ph-miR156 complementary sequences with P. edulis SBP family genes. Numbers indicate the position of the nucleotide sequences.

2.5 毛竹SBP家族基因表達(dá)量分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了毛竹SBP 家族基因在毛竹實(shí)生苗根、莖、葉中的表達(dá)情況。在根中，PeSBP16相對(duì)表達(dá)量最高，PeSBP9相對(duì)表達(dá)量較高，其他PeSBP基因在根中的表達(dá)量較低。在莖中，PeSBP11相對(duì)表達(dá)量最高，PeSBP5，PeSBP9和PeSBP10有較高的表達(dá)量，而其他PeSBP基因在莖中相對(duì)表達(dá)量較低。在葉中，PeSBP5相對(duì)表達(dá)量最高，PeSBP6在葉中的相對(duì)表達(dá)量高于其在根和莖中的相對(duì)表達(dá)量(圖5)。

圖5 毛竹不同組織SBP家族基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Phyllostachys edulis SBP family genes in different organs

本研究分析了毛竹SBP家族基因自花序形成初期(P1)經(jīng)過小穗的分化(P2)和穎花的分化(P3)到小穗的生長(zhǎng)(P4)4個(gè)階段表達(dá)模式的變化(圖1B； 圖6)。在毛竹花序發(fā)育的4個(gè)時(shí)期，毛竹SBP家族基因相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化，根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)，可以將SBP家族基因分成5類。第1類： 無明顯表達(dá)量，且表達(dá)趨勢(shì)變化不明顯，包括有PeSBP1，PeSBP2，PeSBP3，PeSBP7，PeSBP15與PeSBP17共6個(gè)基因。第2類： 先降后升，P1-P3期PeSBP4與PeSBP13相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，在P3期到達(dá)最低點(diǎn)，P4期又重新上升。第3類： 先升后降，PeSBP10與PeSBP14相對(duì)表達(dá)量逐漸上升在P3期到達(dá)最高點(diǎn)，PeSBP12與PeSBP18相對(duì)表達(dá)量逐漸上升在P2期到達(dá)最高點(diǎn)，之后相對(duì)表達(dá)量均下降。第4類： 先升后降再升，P1-P2期PeSBP5，PeSBP9與PeSBP16 相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，P3期下降，到P4期相對(duì)表達(dá)量又上升。第5類： 先降后升再降，P1-P2期PeSBP6，PeSBP8與PeSBP11相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，P3期相對(duì)表達(dá)量上升，到P4期相對(duì)表達(dá)量又下降。

圖6 毛竹花序發(fā)育過程SBP家族基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of Phyllostachys edulis SBP genes in the development of inflorescences

本研究也調(diào)查了毛竹SBP基因受鹽脅迫過程表達(dá)模式的變化，當(dāng)毛竹實(shí)生苗受高鹽脅迫后，毛竹所有SBP家族基因均發(fā)生了不同程度的表達(dá)量變化(圖7)。根據(jù)基因表達(dá)量變化趨勢(shì)可以將毛竹SBP家族基因分為3類。第1類： 基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，包括PeSBP1，PeSBP5，PeSBP6，PeSBP7，PeSBP13，PeSBP15，PeSBP16，PeSBP17與PeSBP18。第2類： 基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，包括PeSBP2，PeSBP3，PeSBP4，PeSBP8，PeSBP10，PeSBP11，PeSBP12與PeSBP14。第3類： 基因相對(duì)表達(dá)量先升后降，PeSBP9在高鹽脅迫的第1～3天(T1-T2期)相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，在第3天(T2期)到達(dá)最高點(diǎn)，在第5天(T3期)相對(duì)表達(dá)量下降并低于第1天(T1期)相對(duì)表達(dá)量。

圖7 鹽脅迫下毛竹SBP家族基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of Phyllostachys edulis SBP family genes under salinity treatment

3 討論

SBP家族基因編碼的SBP轉(zhuǎn)錄因子為植物所特有，此類家族基因具有高度保守性，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)階段，在花發(fā)育中的作用尤為重要。SBP基因在多種植物中均有發(fā)現(xiàn)，尤其在模式植物擬南芥中研究較為透徹，但在竹亞科(Bambusoideae)植物毛竹中卻未有報(bào)道。

3.1 毛竹SBP家族基因特性

本研究最初在毛竹中共發(fā)現(xiàn)37條疑似SBP家族基因序列，經(jīng)MEME檢索結(jié)構(gòu)域確認(rèn)， 18條SBP轉(zhuǎn)錄因子具有完整的74個(gè)氨基酸殘基的SBP結(jié)構(gòu)域。毛竹SBP家族基因蛋白序列中NLS序列為K-R-S-C-R-R-R-L-A-G-H-N-R-R-R-R，僅1個(gè)氨基酸殘基與梅(Yuetal.， 2010)中的NLS序列(K-R-S-C-R-R-R-L-A-G-H-N-E-R-R-R)不同。這18條基因被認(rèn)為是真正的SBP家族基因。構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，進(jìn)化關(guān)系相近的毛竹SBP轉(zhuǎn)錄因子的Motif和基因結(jié)構(gòu)均具相似性，例如，PeSBP11與PeSBP12親緣關(guān)系比較近，2條基因的Motif完全一致。組內(nèi)Motif數(shù)目也大致具有相似性，例如，Group3中PeSBP15與PeSBP16的Motif最多達(dá)到了10個(gè)，而PeSBP6、PeSBP7與PeSBP13僅有1個(gè)SBP結(jié)構(gòu)域。PeSBP2、PeSBP5和PeSBP14均有10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，PeSBP13僅1個(gè)內(nèi)含子與外顯子。擬南芥、水稻和毛竹SBP家族基因進(jìn)化樹分析得出，毛竹SBP家族基因與擬南芥SBP家族基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，毛竹SBP家族基因與水稻SBP家族基因進(jìn)化關(guān)系近，并且在水稻中都可以找到相應(yīng)的毛竹SBP同源基因，推測(cè)在進(jìn)化過程中毛竹基因組并未出現(xiàn)特異的SBP家族基因。也從側(cè)面證實(shí)了SBP家族基因在進(jìn)化上的保守性。10條毛竹SBP家族基因具有miR156靶位點(diǎn)，并且均靠近基因尾端，miR156既可以結(jié)合于基因編碼區(qū)也可以結(jié)合于基因UTR區(qū)(Houetal.， 2013; Lietal.， 2013)。

3.2 毛竹SBP家族基因具有多樣的表達(dá)模式

調(diào)查了毛竹SBP家族基因在毛竹實(shí)生苗根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量。PeSBP11和PeSBP16相對(duì)表達(dá)量分別在莖和根中最高，暗示它們分別在莖和根發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。PeSBP9在根中相對(duì)表達(dá)量較高(圖5)，可能參與了毛竹根的發(fā)育。PeSBP5，PeSBP9，PeSBP10與PeSBP11在莖和葉中均呈現(xiàn)出高相對(duì)表達(dá)量，表明這些基因可能參與了毛竹莖和葉的發(fā)育(Wangetal.， 2008； Martinetal.， 2010)。

在花序發(fā)育過程的P1-P4期，有6個(gè)基因(PeSBP1，PeSBP2，PeSBP3，PeSBP7，PeSBP15與PeSBP17)表達(dá)量較低，且無明顯的表達(dá)量變化，暗示它們可能與花序發(fā)育關(guān)系不大。有7個(gè)毛竹SBP家族基因(PeSBP5，PeSBP9，PeSBP10，PeSBP12，PeSBP14，PeSBP16和PeSBP18)在P1-P2表達(dá)量上升，表明可能參與了早期的花序發(fā)育(王翊等， 2011)，其中PeSBP10與PeSBP14高表達(dá)延續(xù)到P3期。在P3期毛竹花序繼續(xù)伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)錐形成，雄雌蕊發(fā)育成花器官，第1朵小花形成。7個(gè)基因(PeSBP6，PeSBP8，PeSBP9，PeSBP10，PeSBP14，PeSBP16和PeSBP18)在P3期表達(dá)值較高，表明這7個(gè)基因可能參與了雄雌蕊發(fā)育(郭起榮等， 2015)。P4期側(cè)生與頂端小穗迅速生長(zhǎng)(郭起榮等， 2015)，毛竹SBP家族基因中有5個(gè)基因(PeSBP4，PeSBP5，PeSBP9，PeSBP13與PeSBP16)在P4期表達(dá)值較高，表明這5個(gè)基因可能參與了小穗的生長(zhǎng)(郭起榮等， 2015)。

AtSBP8可以影響花粉囊與雌蕊群的發(fā)育(Unteetal.， 2003； Xingetal.， 2013)。AtSBP8缺失突變體導(dǎo)致植物生育能力降低，它的敲除可能也會(huì)影響萼片上的毛狀體形成和雄蕊絲伸長(zhǎng)(Unteetal.， 2003)。擬南芥的花器官具有典型的花萼但是毛竹卻無明顯的花萼(田大剛等， 2011； 孫立方等， 2012)，與AtSBP8同源的PeSBP3在花發(fā)育4個(gè)時(shí)期相對(duì)表達(dá)量均比較低，可能與毛竹特有花序結(jié)構(gòu)有關(guān)。AtSBP9和AtSBP15在擬南芥由營養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換中起到了促進(jìn)作用(Schwarzetal.， 2008； Wangetal.， 2008)，與AtSBP9同源的PeSBP5，PeSBP6及與AtSBP15同源的PeSBP14在毛竹花發(fā)育的4個(gè)時(shí)期均有較為明顯的表達(dá)，暗示著這3個(gè)基因可能參與毛竹營養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的調(diào)控。

葡萄SBP家族基因在高鹽環(huán)境下表現(xiàn)出了不同的表達(dá)模式，參與了葡萄對(duì)于鹽脅迫的反應(yīng)(Houetal.， 2013)。在菊花的鹽脅迫中，CmSBP4，CmSBP9與CmSBP11對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)趨勢(shì)比其他9個(gè)菊花SBP家族基因反應(yīng)更為明顯(Songetal.， 2016)。高鹽脅迫環(huán)境下毛竹SBP家族基因表現(xiàn)出了3類不同的表達(dá)趨勢(shì)。第1類，PeSBP1，PeSBP5，PeSBP6，PeSBP7，PeSBP13，PeSBP15，PeSBP16，PeSBP17與PeSBP18隨著高鹽處理時(shí)間從第1～5天(T1-T3期)相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，可能是它們的表達(dá)受鹽脅迫反饋抑制(Houetal.， 2013； Songetal.， 2016)； 第2類，自高鹽脅迫第1天(T1期)開始隨著高鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PeSBP2，PeSBP3，PeSBP4，PeSBP8，PeSBP10，PeSBP11，PeSBP12與PeSBP14相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，暗示著這些基因可能在毛竹高鹽脅迫響應(yīng)的過程中起到了主要作用(Houetal.， 2013； Songetal.， 2016)； 第3類，相對(duì)表達(dá)量先升后降(PeSBP9)，表明PeSBP9在高鹽脅迫第1～3天(T1-T2期)參與了鹽脅迫的響應(yīng)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)又被抑制。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定了毛竹18條SBP家族基因，證明了毛竹18條SBP家族基因具有完整的SBP結(jié)構(gòu)域并且非常保守。毛竹與水稻SBP家族基因進(jìn)化關(guān)系較近。在18條毛竹SBP家族基因中有10條基因在靠近基因尾端有miR156識(shí)別的靶位點(diǎn)。SBP家族基因參與了毛竹營養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)的調(diào)控，PeSBP5，PeSBP9，PeSBP10與PeSBP11對(duì)葉的發(fā)育具有重要的影響，PeSBP8，PeSBP9，PeSBP10，PeSBP11，PeSBP12，PeSBP13，PeSBP16與PeSBP18可能在毛竹花序發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。在毛竹高鹽脅迫處理中，SBP家族基因均表現(xiàn)出了相對(duì)表達(dá)量的變化，大部分基因參與了毛竹對(duì)高鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

郭起榮，周建梅，孫立方，等．2015．毛竹的花序發(fā)育研究．植物科學(xué)學(xué)報(bào)，33(1): 19-24．

(Guo Q R, Zhou J M, Sun L F,etal. 2015. Development ofPhyllostachysedulisinflorescences. Plant Science Journal, 33(1): 19-24.[in Chinese])

孫立方，郭起榮，王 青，等． 2012．毛竹花器官的形態(tài)與結(jié)構(gòu)．林業(yè)科學(xué)，48(11): 124-129．

(Sun L F, Guo Q R, Wang Q,etal. 2012. Flower organs morphology and structure ofPhyllostachysedulis．Scientia Silvae Sinicae, 48(11): 124-129.[in Chinese])

田大剛，劉華清，蘇 軍，等．2011．水稻與擬南芥中控制花器官發(fā)育MADS-box基因的比較研究進(jìn)展．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，26(2): 309-320.

(Tian D G, Liu H Q, Su J,etal. 2011. Flower-development-controlling MADS-box genes in rice andArabidopsisthaliana. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 26 (2): 309-320[in Chinese])

王 翊，胡宗利，楊妤欣，等． 2011．水稻SBP基因家族的生物信息學(xué)分析．生物信息學(xué)，9(1): 82-87．

(Wang Y, Hu Z L, Yang Y X,etal. 2011. Bioinformatics analysis of SBP-box gene family in rice. China Journal of Bioinformatics, 9(1): 82-87.[in Chinese])

辛 婧．2006．SBP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，6(12): 140-142．

(Xin J. 2006. The structure and function of SBP transcription factors. Progress in Modern Biomedicine, 6(12): 140-142．[in Chinese])

張智俊，楊 洋，羅淑萍，等．2011．毛竹液泡膜Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍谆蚩寺〖氨磉_(dá)分析．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，19(1): 69-76．

(Zhang Z J, Yang Y, Luo S P,etal. 2011. Molecular cloning and expression analysis of a vacuolar Na+/H+antiporter gene in Moso bamboo. Journal of Agricultural Biotechnology, 19(1): 69-76．[in Chinese])

張 瑩，孫立方，冉 洪，等．2016．毛竹花粉的形態(tài)及雙受精過程研究．廣西植物，36(11): 1325-1329．

(Zhang Y, Sun L F, Ran H,etal. 2016. Pollen morphology and double fertilization ofPhyllostachysedulis. Guihaia, 36(11): 1325-1329.[in Chinese])

Cardon G H, H?hmann S, Nettesheim K,etal. 1997. Functional analysis of theArabidopsisthalianaSBP-box geneSPL3: a novel gene involved in the floral transition. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 12(2): 367-377.

Cardon G, H?hmann S, Klein J,etal. 1999. Molecular characterisation of theArabidopsis, SBP-box genes. Gene, 237(1): 91-104.

Chen X, Zhang Z, Liu D,etal. 2010.SQUAMOSApromoter-binding protein-like transcription factors: star players for plant growth and development. Journal of Integrative Plant Biology, 52(11): 946-951.

Eriksson M, Moseley J L, Tottey S,etal. 2004. Genetic dissection of nutritional copper signaling inChlamydomonasdistinguishes regulatory and target genes. Genetics, 168(2):795-807.

Fan C, Ma J, Guo Q,etal. 2013. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in bamboo (Phyllostachysedulis). PLoS One, 8(2): e56573. doi:10.1371/journal.pone.0056573.

Gandikota M, Birkenbihl R P, H?hmann S,etal. 2007. The miRNA156/157 recognition element in the 3′UTR of theArabidopsisSBP box geneSPL3 prevents early flowering by translational inhibition in seedlings. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 49(4): 683.

Ge W, Zhang Y, Cheng Z,etal. 2017. Main regulatory pathways, key genes and microRNAs involved in flower formation and development of Moso bamboo (Phyllostachysedulis). Plant Biotechnology Journal, 15(1): 82-96.

Hou H, Li J, Gao M,etal. 2013. Genomic organization, phylogenetic comparison and differential expression of the SBP-box family genes in grape. PLoS One, 8(3): e59358. doi:10.1371/journal.pone.0059358.

Jung J H, Seo P J, Kang S K,etal. 2011. miR172 signals are incorporated into the miR156 signaling pathway at theSPL3/4/5, genes inArabidopsis，developmental transitions. Plant Molecular Biology, 76(1): 35-45.

Klein J, Saedler H, Huijser P. 1996. A new family of DNA binding proteins includes putative transcriptional regulators of theAntirrhinummajusoral meristem identity gene SQUAMOSA. Mol Gen Genet, 250(1): 7-16.

Kropat J, Tottey S, Birkenbihl R P,etal. 2005. A regulator of nutritional copper signaling inChlamydomonasis an SBP domain protein that recognizes the GTAC core of copper response element. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(51): 18730 -18735．

Li J, Hou H M, Li X Q,etal. 2013. Genome-wide identification and analysis of the SBP-box family genes in apple (Malus×domesticaBorkh.). Plant Physiology and Biochemistry, 70(1): 100-114.

Ma Y, Guo J W, Bade R,etal. 2015. Genome-wide identification and phylogenetic analysis of the SBP-box gene family in melons. Journal of Plant Growth Regulation, 13(1): 8794-8806.

Martin R C, Asahina M, Liu P P,etal. 2010. The regulation of post-germinative transition from the cotyledon- to vegetative-leaf stages by microRNA-targetedSQUAMOSAPROMOTER-BINDINGPROTEINLIKE13 inArabidopsis. Seed Science Research, 20(2): 89-96.

Peng Z H, Lu Y, Li L B,etal. 2013. The draft genome of the fast-growing non-timber forest species Moso bamboo (Phyllostachysheterocycla). Nature Genetics, 45(4): 1-2.

Preston J C, Hileman L C. 2013. Functional evolution in the plantSQUAMOSA-PROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE(SPL) gene family. Frontiers in Plant Science, 4(80): 1-13．

Salinas M, Xing S, H?hmann S,etal. 2012. Genomic organization, phylogenetic comparison and differential expression of the SBP-box family of transcription factors in tomato. Planta, 235(6): 1171-1184.

Schwarz S, Grande A V, Bujdoso N,etal. 2008. The microRNA regulated SBP-box genesSPL9 andSPL15 control shoot maturation inArabidopsis. Plant Molecular Biology, 67(1): 183 -195.

Shao C X, Takenda Y, Hatano S,etal. 1999. Rice gene encoding the SBP domain protein, which is a new type of transcription factor controlling plant development. Rice Genet Newsl, 16: 114.

Song A P, Wu D, Fan Q Q,etal. 2016. Transcriptome-wide identification and expression profiling analysis ofChrysanthemumtrihelix transcription factors. Plant Physiology and Biochemistry, 102(2): 10-16.

Stone J M, Liang X W, Nekl E R,etal. 2005.ArabidopsisAtSPL14, a plant-specific SBP-domain transcription factor, participates in plant development and sensitivity to fumonisin B1. The Plant Journal, 41(5): 744-754.

Sun G L, Stewart C N, Xiao P,etal. 2012. MicroRNA expression analysis in the cellulosic biofuel crop switchgrass (Panicumvirgatum) under abiotic stress. PLoS One, 7(3): e32017. doi:10.1371/journal.pone.0032017.

Tan H W, Song X M, Duan W K,etal. 2015. Genome-wide analysis of the SBP-box gene family in Chinese cabbage (Brassicarapasubsp.pekinensis). Genome, 58(11): 463-477.

Teotia S, Tang G L. 2015. To bloom or not to bloom: role of microRNAs in plant flowering. Molecular Plant, 8(3): 359-377.

Unte U S, Sorensen A M, Pesaresi P,etal. 2003.SPL8, an SBP-box gene that affects pollen sac development inArabidopsis. Plant Cell, 15(4): 1009-1019.

Wang J W, Schwab R, Czech B,etal. 2008. Dual effects of miR156-targetedSPLgenes andCYP78A5/KLUHon plastochron length and organ size inArabidopsisthaliana. Plant Cell, 20(5):1231-1243.

Wei S, Gruber M Y, Yu B Y,etal. 2012.Arabidopsismutantsk156 reveals complex regulation ofSPL15 in amiR156-controlled gene network. BMC Plant Biology, 12(1): 49-54.

Wu G, Park M Y, Conway S R,etal. 2009. The sequential action of miR156 and miR172 regulates developmental timing inArabidopsis. Cell, 138(4): 750-759.

Wu G, Poethig R S. 2006. Temporal regulation of shoot development inArabidopsisthalianabymiR156 and its targetSPL3. Development, 133(18): 3539-3547.

Wu H, Lv H, Li L,etal. 2015. Genome-wide analysis of the AP2/ERF transcription factors family and the expression patterns ofDREBgenes in Moso bamboo(Phyllostachysedulis). PLoS One, 10(5): e0126657. doi: 10. 1371/journal. pone. 0126657.

Xie K B, Wu C Q, Xiong L Z. 2006. Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiology, 142(1): 280-293.

Xing S, Salinas M, Garcia-Molina A,etal. 2013.SPL8 and miR156-targetedSPLgenes redundantly regulateArabidopsisgynoecium differential patterning. Plant Journal, 75(4): 566-577.

Xu Z D, Sun L D, Zhou Y Z,etal. 2015. Identification and expression analysis of the SQUAMOSA promoter-binding protein (SBP)-box gene family inPrunusmume. Mol Genet Genomics, 290(5): 1701-1715.

Yamasaki K, Kigawa T, Inoue M,etal. 2004. A novel zinc-binding motif revealed by solution structures of DNA-binding domains ofArabidopsis, SBP-family transcription factors. Journal of Molecular Biology, 337 (1): 49-63.

Yamasaki K, Kigawa T, Inoue M,etal. 2006. AnArabidopsisSBP-domain fragment with a disrupted C-terminal zinc-binding site retains its tertiary structure. FEBS Letters, 580 (8): 2109-2116.

Yu N, Cai W J, Wang S C,etal. 2010. Temporal control of trichome distribution by microRNA156-targetedSPLgenes inArabidopsisthaliana. Plant Cell, 22 (7): 2322-2335.

Zhang W, Li B, Yu B. 2016. Genome-wide identification, phylogeny and expression analysis of the SBP-box gene family in maize (Zeamays). Journal of Integrative Agriculture, 15 (1): 29-41.