周 盼 李鳳娟 張瑞華 許 翠 李黎明 蔣明軍

梅毒是由蒼白密螺旋體(又稱梅毒螺旋體，TP)感染引起的一種慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可累及多個(gè)器官和系統(tǒng)，嚴(yán)重危害患者身心健康。妊娠期梅毒感染還可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸胎、先天性梅毒及遠(yuǎn)期后遺癥等[1]；梅毒感染還能增加罹患或傳播艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。據(jù)估計(jì)[3]，2012年全球15～49歲人群中約有1800萬(wàn)例梅毒患者，其中新發(fā)病例約600萬(wàn)例。國(guó)內(nèi)梅毒感染率和發(fā)病率也居高不下[4]。所以，如何有效控制和預(yù)防梅毒感染已成為全球普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。

梅毒螺旋體具有強(qiáng)大的組織侵襲能力，不僅可引發(fā)廣泛的二期梅毒疹(其中肝、腎、眼等內(nèi)臟也常受累)；還能穿透胎盤屏障、血腦屏障導(dǎo)致先天梅毒及神經(jīng)梅毒[5]；在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，TP由局部皮膚感染后，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)經(jīng)血液或淋巴發(fā)生播散[6]；體外實(shí)驗(yàn)中，TP還可穿透完整的生物膜及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接[7,8]。TP強(qiáng)大的侵襲力與其復(fù)雜的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。

由于TP為胞外致病菌，故其膜蛋白在致病中的作用一直是研究熱點(diǎn)。TP細(xì)胞膜由內(nèi)外兩層組成，與G-菌不同的是，TP外膜缺乏脂多糖，且膜蛋白含量極少，尚不足大腸桿菌的百分之一，因而稱之為TP稀有外膜蛋白(TROMP)[9]。因表面缺乏靶抗原，宿主免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生針對(duì)TP有效的保護(hù)性抗體，這也給疫苗的開發(fā)帶來(lái)了巨大困難。無(wú)法在體外連續(xù)培養(yǎng)、基因操作困難、細(xì)胞膜易碎難以提取等因素，則嚴(yán)重限制了TP膜蛋白的鑒定和研究。

近年來(lái)隨著TP基因組序列的闡明及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)TP膜蛋白的認(rèn)識(shí)逐漸深入。其中多種與TP侵襲力密切相關(guān)的黏附蛋白也逐漸被發(fā)現(xiàn)。它們不僅可介導(dǎo)TP與宿主基底膜(basement membrane,BM)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等的相互作用，還可利用自身蛋白酶活性(如Tp0751、Tp0750)使這些組織降解，繼而穿透基底膜及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接，發(fā)生組織侵襲或隨血液播散。Tp0751還有促炎作用，Tp0435(Tp17)有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可能具有潛在的診斷價(jià)值；而Tp0136具有顯著的菌株間異質(zhì)性，可能與TP免疫逃避機(jī)制有關(guān)。本文將對(duì)目前已知的幾種具有黏附功能的膜蛋白進(jìn)行概述。

1 Tp0136

Tp0136基因全長(zhǎng)1488 bp,編碼約495個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量約50 KDa?；蛟诓煌觊g存在高度異質(zhì)性[10-13]，是Tp0136與其它黏附蛋白最顯著的不同。Brinkman等[14]對(duì)Street14、Samoa D、Samoa F、Cuniculi A 4種不同菌株的Tp0136基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序，并與Nichols標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Tp0136基因在不同菌株間存在多處核苷酸錯(cuò)配、插入和缺失，這些差異最終導(dǎo)致不同菌株間Tp0136氨基酸序列的差異。Ke等[15]對(duì)Nichols Houston株、Nichols Seattle株、Nichols Dallas株、Dal-1株、MexicoA株、Bal73-1株、Seattle81-4株以及SS14株進(jìn)行Tp0136 DNA測(cè)序和氨基酸序列對(duì)比研究，結(jié)果也支持上述觀點(diǎn)。

Tp0136可與血漿纖連蛋白(fibronectin,Fn)、細(xì)胞纖連蛋白及超纖連蛋白發(fā)生有效結(jié)合[14]。與血漿Fn的主要作用位點(diǎn)在Tp0136的NH2端保守區(qū)；而與細(xì)胞Fn，除了NH2端外，還可通過羧基端和中部進(jìn)行相互作用，故Tp0136與細(xì)胞Fn的結(jié)合更有效[15]。Tp0136與Fn相互作用的分子機(jī)制尚需深入研究。Brinkman等[14]用Nichols株接種實(shí)驗(yàn)兔，14天后，實(shí)驗(yàn)兔血清即可與rTp0136以及TP蛋白溶解產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)(即血清中產(chǎn)生了抗Tp0136抗體)，說(shuō)明Tp0136具有一定的免疫原性。實(shí)驗(yàn)中Tp0136還可被梅毒兔血清及早期梅毒患者陽(yáng)性血清所識(shí)別[16,17]，故Tp0136具有免疫反應(yīng)性，可能在梅毒早期診斷中具有潛在價(jià)值。Brinkman等[14]發(fā)現(xiàn)，用rTp0136免疫新西蘭兔，再用Nichols株感染時(shí)，可顯著延遲潰瘍出現(xiàn)的時(shí)間，減輕皮損，但并不能阻止感染的發(fā)生，說(shuō)明Tp0136具有不完全的免疫保護(hù)作用。Ke等[15]為了探究梅毒感染過程中Tp0136 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況是否會(huì)發(fā)生變化，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔初期皮損中Tp0136 mRNA進(jìn)行定量了分析，在感染后6～18天 Tp0136 mRNA轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)而穩(wěn)定，在21～30天(硬下疳愈合期)轉(zhuǎn)錄水平較前增加，尤其在感染后第27～30天增加最為顯著。Tp0136 mRNA在感染早期持續(xù)高轉(zhuǎn)錄，并在硬下疳愈合期間明顯升高，即Tp0136的轉(zhuǎn)錄與宿主免疫壓力相平行，這可能與TP的持續(xù)感染能力有關(guān)。

2 Tp0155和Tp0483

Cameron等[18]對(duì)Tp基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測(cè)Tp0155和Tp0483可能具有黏附功能，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者均可與Fn發(fā)生特異性結(jié)合，其中Tp0155優(yōu)先與細(xì)胞外基質(zhì)中Fn結(jié)合，而Tp0483既能結(jié)合血漿可溶性Fn及細(xì)胞外基質(zhì)Fn，還能與分泌Fn的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合；抗Tp0155和抗Tp0483特異性抗體可部分阻斷TP與纖連蛋白包被的顯微載玻片的黏附。這種黏附作用可能有助于TP隱藏自身表面抗原，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別，達(dá)到快速增殖與擴(kuò)散的目的。

為探究Tp0483與Fn結(jié)合的機(jī)制及影響因素，Dickerson等[19]用自組裝單分子膜(Self-assembled monolayers,SAMs)技術(shù)模擬了Tp0483與Fn結(jié)合情況，結(jié)果顯示，與-OHSAMs、-NH3SAMs、-CH3SAMs相比，-COO-SAMs所結(jié)合的Tp0483顯著增多，但Tp0483-COO-SAMs所結(jié)合的Fn與Tp0483的量卻不成正比。Dickerson等用表面等離子反應(yīng)(Surface plasmon response,SPR)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，由此認(rèn)為Tp0483與Fn的結(jié)合可能與二者表面所帶電荷及化學(xué)基團(tuán)性質(zhì)有關(guān)。

Tomson等[20]試圖用間接免疫熒光法探究Tp0155和Tp0183的細(xì)胞膜定位，但并未找到二者位于TP外膜表面的證據(jù)，認(rèn)為這與Tp0155和Tp0483具有黏附功能相矛盾，故推測(cè)二者可能并非真正的外膜蛋白。用rTp0155和rTp0483分別免疫新西蘭兔，雖然可產(chǎn)生高滴度特異性抗體，但均不能阻止再感染時(shí)皮損的發(fā)生，故二者雖有免疫原性，但均不具有免疫保護(hù)作用。

3 Tp0751

Tp0751基因全長(zhǎng)714 bp，編碼237個(gè)氨基酸。它是由一條多肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)的核心是一個(gè)位于C端、由8條反向平行排列的β鏈構(gòu)成的β桶狀結(jié)構(gòu)[21]。功能研究發(fā)現(xiàn)，Tp0751是一個(gè)具有雙重功能的Tp膜蛋白：一方面，它能與層黏連蛋白(基底膜重要成分)及纖維蛋白原發(fā)生特異性結(jié)合；另一方面，Tp0751還具有金屬蛋白酶活性[22,23]。氨基酸序列分析證實(shí)其C端含有一個(gè)HEXXH金屬蛋白酶模體，能夠結(jié)合鋅離子，是一個(gè)鋅離子依賴的、膜相關(guān)的金屬蛋白酶，依靠其金屬蛋白酶活性，Tp0751可降解與之結(jié)合的層黏連蛋白和纖維蛋白原[23]。Houston等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)HEXXH進(jìn)行定點(diǎn)突變可使Tp0751失去對(duì)宿主組織的蛋白水解作用，但不影響其與組織的黏附，故推測(cè)Tp0751對(duì)組織的黏附作用和蛋白水解作用在結(jié)構(gòu)和功能上可能都是相互獨(dú)立的。Houston等[22]對(duì)Tp0751蛋白水解機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其N端存在凝血酶裂解位點(diǎn)和自身催化裂解位點(diǎn)，可通過宿主凝血酶介導(dǎo)的催化裂解和自身催化裂解兩種途徑獲得完整的金屬蛋白酶活性。前一種途徑可能是TP在進(jìn)化過程中形成的特殊的基因節(jié)約方式，而后一種途徑則能保證Tp0751即使是在凝血酶極少情況下(如骨骼、神經(jīng)等)，其蛋白水解活性也能被有效激活，故而Tp可以在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)存在，并能侵襲全身多種組織和器官?？碌萚24]用梅毒兔模型探究Tp0751蛋白在早期皮損中轉(zhuǎn)錄情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)化Tp0751(以Tp管家基因Tp0574作為Tp0751標(biāo)準(zhǔn)化的參比基因)轉(zhuǎn)錄水平在Tp被清除后期出現(xiàn)全身播散性二期梅毒疹前高表達(dá)，這可能是Tp為了對(duì)抗宿主對(duì)其清除作用，通過高度表達(dá)Tp0751蛋白降解層黏連蛋白和纖維蛋白原，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)的播散。說(shuō)明Tp0751可能參與了TP的播散。

Liu等[25]通過基因工程方法制備并純化Tp0751重組蛋白(rTp0751)，用Western blot對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，rTp0751不僅能與梅毒患者陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，還能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗體，即Tp0751重組蛋白具有良好的免疫原性。另外Tp0751還可能有促炎作用。rTp0751可通過THP-1單核細(xì)胞膜上TLR2和CD14激活MAPKs/p38和NF-κB兩種途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)THP-1產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等前炎癥細(xì)胞因子[25]。因此，Tp0751可能是一個(gè)重要的致病因子。

4 Tp0750

Tp0750是近年新發(fā)現(xiàn)具有黏附功能的TP膜蛋白，它與Tp0751在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)。分析Tp0750和Tp0751基因序列發(fā)現(xiàn)，二者在同一條DNA鏈上同向排列,位于同一閱讀框內(nèi)，且存在基因共轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，故推測(cè)二者可能是以異源二聚體復(fù)合物的形式暴露于Tp表面[26]，但這一推測(cè)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。與Tp0751相似，Tp0750也具有多種功能[26]：1)它可與纖維蛋白原發(fā)生特異型結(jié)合；2)具有基質(zhì)金屬蛋白酶樣作用，可促進(jìn)宿主細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而有利于TP在組織間的侵襲和播散；3)具有絲氨酸蛋白酶活性，可直接降解凝血瀑布中的重要成分——纖維蛋白原和纖連蛋白，從而抑制血栓形成；4)可與內(nèi)皮細(xì)胞表面纖溶復(fù)合物受體——膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合，間接激活并促進(jìn)纖溶。通過3)、4)兩方面的作用，Tp0750可降解使感染局限的血栓，最終Tp可隨血流發(fā)生廣泛播散。

Houston等[27]對(duì)不同螺旋體Tp0750和Tp0751同源物氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)Tp0750氨基酸序列與高侵襲性的T.paraluiscuniculi(兔梅毒密螺旋體，可致兔梅毒)同源物幾乎完全相同，在弱侵襲性螺旋體中也具有較高的序列保守性，但在非致病性螺旋體中低度保守或消失。而Tp0751則僅在高侵襲性的T.paraluiscuniculi中高度保守。在體外黏附及蛋白水解實(shí)驗(yàn)中，Tp0750和Tp0751對(duì)纖維蛋白原、纖連蛋白及層黏連蛋白均表現(xiàn)出黏附及蛋白水解功能，而在低侵襲性和非侵襲性螺旋體中Tp0750和Tp0751同源物則不具有這兩種功能，故Tp0751和Tp0750的黏附及蛋白水解功能可能與侵襲作用有關(guān)。

5 Tp0435

Tp0435(或Tp17)開放閱讀框包含468個(gè)堿基對(duì)，編碼156個(gè)氨基酸，分子量約17KDa[28]。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，Tp0435是一個(gè)由8條反向平行排列的β鏈組成的桶狀結(jié)構(gòu)，一端呈淺“盆”狀，另一端由一個(gè)α螺旋覆蓋。Tp0435在還原狀態(tài)下為單體形式，在氧化狀態(tài)下以一個(gè)二硫鍵連接的二聚體形式存在。Brautigam等[29]推測(cè)Tp0435可能在Tp細(xì)胞周質(zhì)間隙發(fā)揮氧化還原感受器的作用，并且可能通過改變自身氧化還原狀態(tài)與下游的效應(yīng)分子進(jìn)行信號(hào)傳遞。但這一假說(shuō)尚未得到證實(shí)。在蛋白功能方面，以往研究發(fā)現(xiàn)，它可與梅毒患者血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)[30-32]，故Tp0435與其他TP膜蛋白(如TPN47)被應(yīng)用于梅毒診斷[33]。此外，Tp0435也是一種炎癥介質(zhì)，可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α[28]，還能活化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、E選擇素(E-selectin)以及單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達(dá)與基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)單核細(xì)胞遷移及與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，故Tp0435可能在梅毒免疫方面發(fā)揮重要作用[34]。

除上述作用外，最近Chan等[35]還發(fā)現(xiàn)Tp0435具有黏附功能。通過構(gòu)建Tp0435重組表達(dá)體，使其在伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)中得到有效表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中觀察到，B.burgdorferi經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)后可丟失內(nèi)源性質(zhì)粒而失去黏附能力，但成功表達(dá)rTp0435的B.burgdorferi卻能重新與人胚腎上皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合，這一結(jié)果表明rTp0435可能參與TP和多種宿主細(xì)胞的黏附。

Tp0435是一種膜脂蛋白，關(guān)于其在TP細(xì)胞膜上的定位目前存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為它暴露于外膜表面，也有人認(rèn)為它只存在與細(xì)胞周質(zhì)間隙。Chan等[35]用間接熒光抗體法檢測(cè)了B.burgdorferi表面表達(dá)的rTp0435，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度較處理前增強(qiáng)了2～3倍。因此Chan等提出了與上述不同的觀點(diǎn)：rTp0435可能只有小部分暴露于Tp外膜表面，而大部分定位于細(xì)胞周質(zhì)間隙。

Chan等[35]還發(fā)現(xiàn)，表達(dá)于B.burgdorferi表面的Tp0435蛋白存在多種亞型，并且只能在一部分B.burgdorferi和T.pallidum菌體表面檢測(cè)到Tp0435，即Tp0435在菌體外膜表面的分布具有隨意性的特點(diǎn)。Chan等認(rèn)為這些蛋白亞型可能是由相同的Tp0435蛋白質(zhì)前體經(jīng)不同的翻譯后加工形成的。Tp0435的翻譯后加工可能在每個(gè)螺旋體中都是獨(dú)立且隨機(jī)進(jìn)行的，新合成的Tp0435經(jīng)加工處理后，隨意分布于細(xì)胞周質(zhì)間隙和外膜表面，或者只分布于細(xì)胞周質(zhì)間隙。然而Tp0435在細(xì)胞中的分布差異最終可能導(dǎo)致Tp在機(jī)體中不同的結(jié)局：在感染早期，適應(yīng)性免疫應(yīng)答尚未建立，表面表達(dá)Tp0435的梅毒螺旋體可與宿主多種細(xì)胞發(fā)生黏附，而針對(duì)Tp0435的特異性免疫應(yīng)答建立以后，表面表達(dá)Tp0435的游離Tp則被清除，只有表面缺乏Tp0435的Tp才能在播散過程中存活下來(lái)，并在機(jī)體中持續(xù)存在，這是發(fā)展為晚期梅毒的必要條件。

6 結(jié)語(yǔ)

梅毒目前仍然是全球面臨的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。由于Tp無(wú)法在體外連續(xù)培養(yǎng)、基因操作困難、細(xì)胞膜易碎難以提取等，使得Tp膜蛋白的鑒定和研究嚴(yán)重受阻。Tp黏附蛋白與侵襲力密切相關(guān)，對(duì)其生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)的深入探究，將有助于闡明Tp致病機(jī)制及宿主免疫應(yīng)答機(jī)制，有助于優(yōu)化梅毒的診斷方法，同時(shí)也為開發(fā)有效的梅毒疫苗提供依據(jù)。