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(1.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽421001；2.常德市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院2015級臨床醫(yī)學(xué)4班；4.湘南學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系)

梅毒是由蒼白密螺旋體蒼白亞種(Treponema pallidum subspecies pallidum，Tp)感染引起的一種全球廣泛流行的性傳播疾病，主要發(fā)生在包括中國在內(nèi)的中低收入國家，但在高收入國家中梅毒也再次出現(xiàn)并迅速回升，尤其在男-男性行為者(MSM)和孕婦中呈急劇上升態(tài)勢。先天性梅毒成為當(dāng)前死產(chǎn)的主要原因[1-2]，梅毒患者感染和傳播AIDS的風(fēng)險也大大增加，梅毒感染使全球經(jīng)濟(jì)蒙受巨大損失?？刂泼范静荒軆H靠現(xiàn)有的篩查和治療手段，必須尋求新的附加措施，而開發(fā)梅毒疫苗就是其中之一[3-4]。有效的梅毒疫苗將克服如今面臨的諸多困難[3]：預(yù)防Tp感染，進(jìn)而預(yù)防各期梅毒發(fā)展及母嬰垂直傳播；預(yù)防不同Tp臨床株的交叉感染，相應(yīng)地減少再感染的發(fā)生率；無需依賴復(fù)診和青霉素的充足供應(yīng)即可有效控制梅毒。研發(fā)疫苗不但對消滅梅毒具有重要意義，而且能有效降低AIDS發(fā)生[4]。

1 梅毒疫苗前期研究狀況

與其它病原體的疫苗開發(fā)相比，有關(guān)梅毒疫苗的實(shí)驗(yàn)研究非常有限，主要原因是：Tp的生物學(xué)性狀特殊[2]：外膜蛋白(OMP，為主要疫苗靶分子)稀少；外膜脆弱使OMP難以鑒定；不能體外培養(yǎng)，體內(nèi)增殖緩慢；不能通過基因操控來研究基因功能；細(xì)胞壁缺乏革蘭陰性菌共有的脂多糖；不產(chǎn)生明顯毒力因子。此外，缺乏從事Tp基礎(chǔ)研究的科研人員、Tp研究領(lǐng)域相對于其他病原體較落后的方法學(xué)[5]也是重要影響因素。

早在上世紀(jì)六七十年代，Metzger 和Miller 分別用4 ℃短期儲存后致弱的Tp和γ射線致弱的Tp(Nichols株)免疫家兔后分別獲得了針對Nichols株攻擊的部分和完全保護(hù)，通過比較得出結(jié)論[3]：表面抗原是梅毒疫苗的關(guān)鍵成分，但對熱敏感；保護(hù)性免疫是逐步誘導(dǎo)形成的；不同Tp株的保護(hù)性抗原不同；在兔模型中可誘導(dǎo)出持久和無菌免疫保護(hù)。

早期應(yīng)用全細(xì)胞免疫雖能獲得完全保護(hù)，但因免疫劑量大和免疫時間長，不適合應(yīng)用于人體，卻為發(fā)展梅毒疫苗提供了可行性和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。隨著Tp基因組解析和基因工程技術(shù)的開展，國外以重組蛋白類型[3,5]，國內(nèi)以核酸疫苗類型[6]，先后在動物模型中對單個抗原測試了免疫保護(hù)力，包括Tp92 (BamA) 、TprK、TprI、TprF 、Gpd、TmpB、TpN15、TpN47 、Tp0155、Tp0483、 Tp0956、4D、內(nèi)鞭毛和Tp0751[7]。其中用Tp92 (BamA) 、4D、Gpd、TpF和內(nèi)鞭毛免疫的家兔損害發(fā)展減弱，顯示出部分保護(hù)；用抗原可變的TprK獲得了很有希望的部分保護(hù)，該分子的保護(hù)性結(jié)構(gòu)位于蛋白N末端區(qū)域[3]；最近，以重組Tp0751蛋白免疫兔，發(fā)現(xiàn)其器官的Tp負(fù)荷明顯減低，而以Tp攻擊Tp0751免疫兔后，將其淋巴結(jié)引入其他兔體內(nèi)未出現(xiàn)感染，表現(xiàn)為無菌免疫，提示Tp0751是非常有希望的候選疫苗分子[7]。然而，TprK 、Gpd 和Tp92(BamA) 這幾種蛋白保護(hù)力的研究結(jié)果有分歧[3]。 以上研究表明：抗Tp感染保護(hù)不是由單一Tp抗原提供的，應(yīng)發(fā)展多價疫苗；不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果不同，突顯了對實(shí)驗(yàn)室間抗原制備和免疫方法實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化的重要性。

在梅毒臨床前開發(fā)疫苗方法學(xué)方面，一個重大進(jìn)步是應(yīng)用實(shí)時定量PCR(qPCR),該技術(shù)可以在家兔感染Tp的遠(yuǎn)端部位對Tp-DNA進(jìn)行靈敏的定量檢測[8]，但無法區(qū)分Tp死活，也很難從復(fù)雜組織中(如淋巴結(jié))有效提取DNA。熒光原位雜交(FISH) 應(yīng)用一個可識別Tp 16s rRNA的種特異性探針，能對人和兔組織樣本中的Tp進(jìn)行定位分析[9]，提供更多信息。

2 梅毒疫苗成功接種需要的相關(guān)免疫保護(hù)因素

強(qiáng)烈的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)對有效清除損害部位的Tp至關(guān)重要[10]。通過CD4+Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD8+CTL等局部分泌的Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ)活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其吞噬被特異性抗體調(diào)理的Tp，被認(rèn)為是清除Tp的主要機(jī)制。

除細(xì)胞免疫應(yīng)答外，體液免疫應(yīng)答也是必不可少的。然而抗體調(diào)理巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)程緩慢，且某些Tp亞群可以逃避調(diào)理吞噬作用，這些持續(xù)存在的亞群可能對調(diào)理素(抗體)敏感性不同，這與表面抗原暴露的差異性或抗原變異有關(guān)[3]。Tp亞群的免疫逃避使目前的疫苗方案難以完全抵抗Tp感染，這對發(fā)展梅毒疫苗是一個巨大挑戰(zhàn)。

基于對Tp免疫清除機(jī)制的認(rèn)識，臨床前疫苗研究應(yīng)著重于促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生，因其能激活巨噬細(xì)胞和促進(jìn)Tp的調(diào)理吞噬。此外，有效免疫還需針對那些能抗巨噬細(xì)胞清除而持續(xù)存在的Tp種群和血管內(nèi)的Tp，以抑制Tp向感染遠(yuǎn)端播散。

3 對HIV陽性者梅毒防護(hù)相關(guān)因素的再思考

HIV和Tp混合感染導(dǎo)致HIV載量增加，并增加HIV傳播風(fēng)險。Tp感染時，主要依賴CD4+T細(xì)胞活化的DTH對清除病變部位Tp至關(guān)重要，但HIV可破壞感染者的CD4+Th細(xì)胞致其數(shù)量偏低。在HIV陽性者的硬下疳部位，CD8+T細(xì)胞替代耗竭的CD4+Th細(xì)胞而成為主要淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子，活化硬下疳部位的巨噬細(xì)胞。此外，HIV陽性者的CD4+Th2細(xì)胞受損，B細(xì)胞缺乏其輔助使血清中特異性抗Tp抗體活性較低[11]，不利于病變部位Tp清除。了解HIV陽性者體內(nèi)這一免疫應(yīng)答變化特點(diǎn)和代償清除機(jī)制，對于開發(fā)梅毒疫苗去保護(hù)這一最重要的目標(biāo)人群至關(guān)重要。此類疫苗接種應(yīng)能促進(jìn)包括CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子。然而，在為HIV陽性者開發(fā)有效疫苗之前，還需更好理解HIV陽性者體內(nèi)調(diào)理素應(yīng)答的變化，以及CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞在梅毒損傷中的作用。

4 梅毒疫苗設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的關(guān)鍵問題

成功的梅毒疫苗需要考慮四個方面[3]：在感染部位形成的高度傳染性的硬下疳；Tp的高度侵襲力；Tp的重復(fù)感染能力；Tp逃避強(qiáng)烈免疫應(yīng)答清除的能力。因此，有效的梅毒疫苗應(yīng)能防止梅毒硬下疳的發(fā)展、梅毒的傳播、梅毒的持續(xù)感染和再感染[3]，以消除感染者癥狀和疾病在總?cè)丝谥械膫鞑ァＨ缟纤?，Tpr蛋白家族中的某些蛋白免疫新西蘭兔后能減緩硬下疳的發(fā)展，預(yù)測這些蛋白亞家族成員暴露在Tp表面[3,12]，在預(yù)測的表面暴露環(huán)狀區(qū)域出現(xiàn)廣泛的序列變異[13]，表明其在Tp持續(xù)感染和再感染中也發(fā)揮作用。關(guān)于Tp高度侵襲力，已證明Tp0751是一種對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和細(xì)胞均具有黏附作用的黏附素，提示Tp通過其經(jīng)血液播散[14]。其他已發(fā)現(xiàn)的黏附素包括Tp0136[15]、Tp0155[16]、Tp0483[16]、Tp0750[17]和Tp0435[18]，可能在Tp播散中起相似作用。由于在Tp感染時發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，很可能需要多種Tp抗原的混合物接種以獲得完全保護(hù)，因此上述致病因子可能是多價疫苗的候選分子。

梅毒臨床前疫苗開發(fā)過程中需要評估幾個關(guān)鍵問題，包括為獲得最大免疫力所需要接種次數(shù)，疫苗接種后誘導(dǎo)免疫持續(xù)時間，對不同菌株的交叉保護(hù)，合適的多價疫苗的制備，佐劑的選擇與優(yōu)化等等，以獲得免疫應(yīng)答有效保護(hù)機(jī)體抗Tp感染。

5 未來發(fā)展梅毒疫苗的策略與措施

首先需得到政府有關(guān)部門的重視和資金投入，吸引大量的研究人員從事梅毒基礎(chǔ)研究，以提供新的思路和跨學(xué)科的研究方法，尤其在宿主-病原體相互作用、Tp基礎(chǔ)生物學(xué)和動物模型的研究領(lǐng)域。其次，應(yīng)用反向疫苗學(xué)和現(xiàn)代研究手段(包括先進(jìn)的結(jié)構(gòu)方法學(xué)與蛋白質(zhì)組方法學(xué))開展Tp基礎(chǔ)生物學(xué)研究，鑒定與病原體-宿主間相互作用和致病有關(guān)的重要抗原[19]，進(jìn)而篩選新的疫苗候選分子；同時應(yīng)用其他病原體研究先進(jìn)的疫苗方法學(xué)，從維持抗原分子天然構(gòu)象(如采用核酸疫苗形式)、疫苗分子間協(xié)同效應(yīng)、佐劑(如菌影[20])、免疫策略(初免-加免)、免疫途徑(改變免疫應(yīng)答類型)等方面進(jìn)行選擇和優(yōu)化[5]，進(jìn)而發(fā)展多價疫苗，誘導(dǎo)系統(tǒng)和局部黏膜產(chǎn)生持久的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答以有效保護(hù)機(jī)體抗Tp感染。此外，還需發(fā)展檢測家兔種屬特異性的免疫試劑，如各類細(xì)胞因子檢測試劑；建立Tp抗原制備和接種與攻擊感染標(biāo)準(zhǔn)化操作程序以減少或消除實(shí)驗(yàn)室間的誤差[3]。

梅毒疫苗的發(fā)展需要專用資金來評估當(dāng)前和未來的候選疫苗。為確保成功，政府和監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)優(yōu)先考慮發(fā)展梅毒疫苗，同時資助機(jī)構(gòu)、非營利和慈善組織及行業(yè)合作伙伴給予支持，特別是行業(yè)合作伙伴需要獲得擔(dān)保以生產(chǎn)和銷售梅毒疫苗。有理由相信，在持續(xù)資助和研究人員共同努力下，預(yù)期在10年時間內(nèi)可望獲得用于臨床的梅毒候選疫苗。