吳文悅 吳倩 肖文彪 龍泓羽 肖波

精神分裂癥斷裂基因1（DISC1）是與精神分裂癥、雙相情感障礙、重度抑郁癥等精神病相關(guān)的易感基因［4］，編碼DISC1蛋白，在生物體各生長發(fā)育時期均有表達(dá)。DISC1蛋白作為支架蛋白，與多種蛋白質(zhì)相互結(jié)合共同調(diào)控生物體生理功能。研究顯示，DISC1基因在成人腦組織特別是海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生與發(fā)育方面，如神經(jīng)元增殖、遷移、分化、成熟和突觸可塑性等具有重要作用［5］。DISC1基因表達(dá)變化可以導(dǎo)致新生神經(jīng)元異常增殖、過度遷移、異常整合，并出現(xiàn)生理功能紊亂［5］。這些現(xiàn)象與癲發(fā)作后的病理生理改變存在諸多相似之處，提示DISC1蛋白可能與癲的發(fā)生與發(fā)展具有重要聯(lián)系。中南大學(xué)湘雅醫(yī)院肖波教授研究團(tuán)隊就DISC1基因及其相關(guān)蛋白對神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）生長發(fā)育和癲發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用機制進(jìn)行初步探討［6?7］，現(xiàn)將主要方法和結(jié)果進(jìn)行綜述。

1.DISC1 mRNA和蛋白表達(dá)變化 免疫組織化學(xué)染色，DISC1蛋白廣泛分布于正常小鼠海馬組織，主要表達(dá)于神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)。兩組小鼠DISC1蛋白在海馬組織的分布區(qū)域無明顯差異，對照組各時間點海馬齒狀回和CA3區(qū)DISC1蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗組癲持續(xù)狀態(tài)后3天海馬齒狀回和CA3區(qū)DISC1蛋白水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），至癲持續(xù)狀態(tài)后7天低于對照組（P＜0.05），且隨著時間的延長，DISC1蛋白水平下降。qRT?PCR法顯示的癲持續(xù)狀態(tài)后海馬組織DISC1 mRNA表達(dá)變化與免疫組織化學(xué)染色相一致。Western blotting法顯示，實驗組小鼠癲持續(xù)狀態(tài)后7、14和28天海馬組織DISC1蛋白水平均顯著低于對照組（P＜0.01）［6］。

2.DISC1蛋白與MCM2蛋白 MCM2蛋白是基因復(fù)制相關(guān)蛋白，存在于細(xì)胞核，是目前臨床常用的檢測人類和哺乳動物新生神經(jīng)元的標(biāo)志物［8］。MCM2蛋白在靜止期細(xì)胞中基本不表達(dá)，在正常增殖細(xì)胞中于G0期開始表達(dá)，至S期早期達(dá)峰值水平，并與染色質(zhì)結(jié)合，一旦DNA復(fù)制完成，即從染色體脫離，MCM2蛋白在G期和M期水平降低。由于MCM2蛋白在細(xì)胞增殖周期中的特異性變化，目前已經(jīng)成為增殖細(xì)胞標(biāo)志物［9?10］。我們研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)染色顯示，對照組小鼠MCM2蛋白主要表達(dá)于海馬神經(jīng)元胞核，MCM2陽性細(xì)胞局限于顆粒細(xì)胞層與門區(qū)之間的顆粒細(xì)胞下層，通常不超過顆粒細(xì)胞層內(nèi)1/3，亦可見少量MCM2陽性細(xì)胞表達(dá)于門區(qū)和顆粒細(xì)胞層中1/3；對照組小鼠各時間點海馬齒狀回MCM2陽性細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著時間的延長，MCM2陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，表明新生神經(jīng)元減少，實驗組小鼠癲持續(xù)狀態(tài)后3、7、14和28天海馬齒狀回MCM2陽性細(xì)胞數(shù)目均高于對照組（P＜0.05），且隨著時間的延長，這種差異更加明顯；qRT?PCR法顯示，實驗組小鼠癲持續(xù)狀態(tài)后 3、7、14和 28天 MCM2 mRNA含量均高于對照組（P＜0.05），表明癲發(fā)作后海馬齒狀回出現(xiàn)新生神經(jīng)元的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖；采用Pearson相關(guān)分析探討DISC1蛋白與MCM2蛋白水平的相關(guān)性，二者呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.756，P＜0.001）［6］。由此可見，正常成年哺乳動物海馬齒狀回存在神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象，且隨著年齡的增長，神經(jīng)發(fā)生逐漸減少。某些病理因素如癲可以激活神經(jīng)前體細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生增加。

3.DISC1蛋白與DIXDC1蛋白 DIXDC1基因編碼蛋白含絲氨酸和蘇氨酸位點，可以被蛋白酪氨酸激酶（PTK）糖原合成酶激酶?3β（GSK?3β）磷酸化，參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在胚胎神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元分化和軸突生長中發(fā)揮重要生物學(xué)作用［11?12］。DIXDC1蛋白廣泛表達(dá)于成年小鼠腦組織，在海馬組織中主要表達(dá)于CA1～CA4區(qū)和齒狀回顆粒細(xì)胞層［13］。Singh 等［14］發(fā)現(xiàn)，DIXDC1 蛋白與 DISC1 蛋白存在相互作用，他們在胚胎14天小鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)DIXDC1蛋白與DISC1蛋白共沉淀，且二者相互結(jié)合，對 Wnt/GSK?3β/β?連環(huán)蛋白（β?catenin）/T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴樣增強因子（LEF）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮共調(diào)節(jié)作用。我們研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)染色顯示，DIXDC1蛋白主要表達(dá)于齒狀回顆粒細(xì)胞層神經(jīng)元胞質(zhì)，實驗組小鼠癲持續(xù)狀態(tài)后 3、7、14和28天海馬齒狀回DIXDC1蛋白水平均低于對照組（P＜0.01），且隨著時間的延長，DIXDC1蛋白水平下降；qRT?PCR法和Western blotting法顯示的海馬組織DIXDC1蛋白表達(dá)變化與免疫組織化學(xué)染色相一致；Pearson相關(guān)分析顯示，實驗組小鼠海馬組織DIXDC1蛋白與DISC1蛋白水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.808，P＜0.05），DIXDC1 mRNA與MCM2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.488，P ＜ 0.05）［6］。由此可見，DIXDC1基因和DISC1基因在癲發(fā)生與發(fā)展中存在某種聯(lián)系，DIXDC1基因可能與神經(jīng)干細(xì)胞增殖有關(guān)。

4.DISC1蛋白與PDE4蛋白和PDE4B蛋白

PDE4蛋白是特異性cAMP水解酶，是磷酸二酯酶（PDE）家族最大成員，包括PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D共4種亞型，尤以PDE4B蛋白在腦組織中水平最高。PDE4蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)各類細(xì)胞中均有不同程度表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)活動的重要作用。PDE4/cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種病理生理學(xué)過程，如突觸發(fā)生、突觸后神經(jīng)傳遞、新生神經(jīng)元異常增殖等［15?17］。研究顯示，DISC1 蛋白與 PDE4 蛋白存在聯(lián)系，但其相互作用機制較為復(fù)雜，目前尚不十分清楚［18］，關(guān)于 PDE4蛋白在癲發(fā)生機制中的作用研究較少。我們研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)染色顯示，PDE4蛋白廣泛分布于正常小鼠海馬組織，尤其CA1～CA3區(qū)錐體細(xì)胞、門區(qū)中間神經(jīng)元和齒狀回顆粒細(xì)胞均可見PDE4陽性細(xì)胞，主要表達(dá)于神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)，且其表達(dá)水平在各時間點無明顯差異；實驗組小鼠癲持續(xù)狀態(tài)后3和7天海馬齒狀回和CA3區(qū)PDE4水平與對照組無明顯差異（P＞0.05），至癲持續(xù)狀態(tài)后14天低于對照組（P＜0.05），而至癲持續(xù)狀態(tài)后28天又高于對照組（P＜0.05），PDE4B蛋白表達(dá)變化與PDE4蛋白相一致，在實驗組小鼠海馬齒狀回和CA3區(qū)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；qRT?PCR法顯示的PDE4 mRNA和PDE4B mRNA表達(dá)變化與免疫組織化學(xué)染色相一致［6］。為何 PDE4蛋白和PDE4B蛋白在癲動物模型中呈現(xiàn)如此趨勢？它們通過何種作用機制影響癲的發(fā)生與發(fā)展？我們研究團(tuán)隊認(rèn)為，DISC1蛋白與PDE4蛋白的結(jié)合和解離受多種因素的影響，包括分子亞型、表達(dá)水平、結(jié)合位點親和力等［6］。由于相對分子質(zhì)量為71×103的DISC1蛋白氨基酸含量不確定，故一些結(jié)合位點可能消失，使解離更加容易。我們研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，癲模型小鼠海馬組織DISC1蛋白水平逐漸下降，而PDE4蛋白水平先下降后上升［6］。究其原因可能是DISC1蛋白與PDE4蛋白結(jié)合后，PDE4蛋白表達(dá)下調(diào)、活性降低，cAMP水平隨之升高，當(dāng)cAMP水平升高至一定程度時，促使DISC1蛋白與PDE4蛋白解離，解除對PDE4蛋白的抑制，使PDE4蛋白水平升高；當(dāng)DISC1蛋白降低至一定程度，結(jié)合的PDE4蛋白水平下降，DISC1蛋白對PDE4蛋白的抑制減弱，使PDE4蛋白表達(dá)上調(diào)［19］，推測如果DISC1蛋白與PDE4蛋白之間的聯(lián)系發(fā)生變化，可以導(dǎo)致cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常。DISC1蛋白可能通過與PDE4蛋白相互作用以調(diào)節(jié)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與癲的發(fā)生與發(fā)展過程。

二、體外神經(jīng)干細(xì)胞研究

為進(jìn)一步探討DISC1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡的影響，并探尋DISC1基因相關(guān)神經(jīng)元生長發(fā)育基因，我們研究團(tuán)隊從C57BL/6胎鼠海馬組織中分離、提取并培養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞，通過構(gòu)建過表達(dá)DISC1基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體胞嘧啶?腺嘌呤?鳥嘌呤（CAG）?DISC1和沉默DISC1基因的小干擾RNA（siRNA）成功制備DISC1基因過表達(dá)模型和DISC1基因敲除模型［20］。

1.DISC1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞功能的影響 我們研究團(tuán)隊分別于模型制備后即刻、24、48和72小時采用MTS法、Transwell小室模型和流式細(xì)胞術(shù)檢測DISC1基因過表達(dá)模型和DISC1基因敲除模型神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡情況［20］。MTS法顯示，DISC1基因敲除模型中，DISC1 siRNA轉(zhuǎn)染24、48和72小時后，神經(jīng)干細(xì)胞增殖抑制率較空載對照組升高5.73%、22.00%（P＜0.01）和23.27%（P＜0.05）；CAG?DISC1感染24、48和72小時后，神經(jīng)干細(xì)胞增殖抑制率較空載對照組降低10.64%（P＜0.05）、15.21%（P ＜ 0.01）和 19.60%（P ＜ 0.05）［20］。Transwell小室模型計數(shù)細(xì)胞數(shù)目，DISC1基因敲除模型中實驗組穿過膜孔的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目少于對照組［（53.50±7.15） 個對（90.67±6.77） 個，P ＜0.05］；DISC1基因過表達(dá)模型中實驗組穿過膜孔的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目高于對照組［（53.67±9.67）個對（34.83±5.19）個，P ＜ 0.01］［20］。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，DISC1基因敲除模型中實驗組神經(jīng)干細(xì)胞生長受到抑制，處于G0期/G1期、S期和G2期/M期的細(xì)胞比例為 64.20%、22.33%和13.47%，低于空載對照組的 44.16%（P＜0.01）、39.65%（P＜0.01）和16.19%（P＜0.01）；DISC1基因過表達(dá)模型中實驗組細(xì)胞生長較活躍，處于G0期/G1期、S期和G2期/M期的細(xì)胞比例為43.50%、39.63%和16.87%，高于空載對照組的 41.47%（P＜0.01）、32.31%（P＜0.01）和26.22%（P ＜ 0.01）［20］。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，DISC1基因敲除模型中實驗組凋亡細(xì)胞比例較空載對照組高7.48%（P＜0.05）；DISC1基因過表達(dá)模型中實驗組凋亡細(xì)胞比例與空載對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）［20］。由此可見，DISC1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞的增殖和遷移具有正向調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長，但對神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡作用不顯著。

2.DISC1基因及神經(jīng)元生長發(fā)育相關(guān)基因 為探討DISC1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞生長發(fā)育的作用及其機制，我們研究團(tuán)隊采用神經(jīng)元發(fā)生相關(guān)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測DISC1基因過表達(dá)模型和DISC1基因敲除模型中神經(jīng)元生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示，DISC1基因敲除模型中，與對照組相比，Neurog1、Neurog2、Nr2e3和 Sox2基因表達(dá)下調(diào)（均P ＜0.01），而 Dll1、Pafah1b1和 Pax5基因表達(dá)上調(diào)（均P＜0.01）；DISC1基因過表達(dá)模型中，與對照組相比，Dll1、Dvl3、Pax3和Pax5基因表達(dá)下調(diào)（均P＜0.01），Neurog2、Pafah1b1、Sox2、Sox3和Stat3基因表達(dá)上調(diào)（均P＜0.01），表明DISC1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控可能與多種基因（Dll1、Dvl3、Neurog1、Neurog2、Nr2e3、Pafah1b1、Pax3、Pax5、Sox2、Sox3和Stat3）及其產(chǎn)物有關(guān)，其中，兩種模型中與DISC1基因表達(dá)變化趨勢相一致的是Neurog2和Sox2基因，相反的是Dll1和Pax5基因，提示上述4種基因可能是DISC1蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的潛在下游作用分子［20］。我們研究團(tuán)隊進(jìn)一步選擇表達(dá)變化最為顯著的Sox2和Pax5基因，探究二者協(xié)同作用對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用。Sox2基因是多系干細(xì)胞，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的重要因素［21］，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或下調(diào)時均可以導(dǎo)致干細(xì)胞生長發(fā)育失衡［22］。研究顯示，在多種生長增殖活躍的細(xì)胞中Sox2基因表達(dá)均上調(diào)，若將Sox2基因敲除，細(xì)胞則停止增殖［23?25］。Pax5 基因位于第 9 號染色體短臂13區(qū)，編碼B細(xì)胞特異性活化蛋白（BSAP），后者與B淋巴細(xì)胞增殖密切相關(guān)［26］。近年有文獻(xiàn)報道，Pax5基因及其產(chǎn)物可能參與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。Adams等［27］的研究顯示，Pax5基因與Pax基因家族其他成員不同，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，在中腦和脊柱發(fā)育過程中短暫表達(dá)。我們研究團(tuán)隊通過在DISC1基因敲除模型中沉默Pax5基因或過表達(dá)Sox2基因以及在DISC1基因過表達(dá)模型中過表達(dá)Pax5基因或沉默Sox2基因，采用MTS法和Transwell小室模型分別檢測神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移變化，結(jié)果顯示，在DISC1基因過表達(dá)模型中敲除Sox2基因或在DISC1基因敲除模型中過表達(dá)Sox2基因，神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移能力均部分恢復(fù)，而在DISC1基因過表達(dá)模型中過表達(dá)Pax5基因或在DISC1基因敲除模型中敲除Pax5基因，神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移能力并無部分或完全恢復(fù)，反而使原有的增殖和遷移能力缺陷加重，推測不同于Sox2基因作為DISC1基因的下游作用分子，與DISC1基因共同調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和遷移能力，Pax5基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞增殖和遷移能力可能有獨立調(diào)控機制［20］。由此可見，DISC1基因與Pax5基因或Sox2基因共同對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移能力發(fā)揮調(diào)控作用，其中，Sox2基因是DISC1基因的下游作用分子，Pax5基因獨立于DISC1基因，直接對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移能力產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)。

三、總結(jié)與展望

DISC1基因在神經(jīng)發(fā)生中具有重要作用，但其對神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控作用十分復(fù)雜。大部分情況下，DISC1蛋白表達(dá)缺失可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞遷移能力缺陷。既往在斑馬魚和嚙齒類動物實驗中發(fā)現(xiàn)，胚胎大腦發(fā)育期DISC1蛋白對神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和遷移呈正向調(diào)控作用，即DISC1蛋白水平升高時，神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和遷移能力增強，反之亦然［30?31］。我們研究團(tuán)隊在體外神經(jīng)干細(xì)胞實驗中亦發(fā)現(xiàn)，DISC1蛋白對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移具有正向調(diào)控作用，并能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長［20］。DISC1蛋白在癲中的研究甚少，我們研究團(tuán)隊首次在匹羅卡品誘導(dǎo)小鼠癲持續(xù)狀態(tài)模型中探討DISC1蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，DISC1蛋白水平下降可以導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生［6］，并經(jīng)多項研究所證實。有學(xué)者采用逆病毒介導(dǎo)的單細(xì)胞RNA干擾（RNAi）技術(shù)使成年小鼠海馬分裂期新生顆粒細(xì)胞DISC1蛋白水平下降，可以導(dǎo)致細(xì)胞樹突過度增長和異位樹突形成；且DISC1蛋白水平下降的新生顆粒細(xì)胞較正常新生顆粒細(xì)胞存在過度遷移甚至異位現(xiàn)象，并表現(xiàn)為興奮性增高［32］。盡管DISC1蛋白的調(diào)控作用復(fù)雜，但可以肯定的是，其與癲的發(fā)生與發(fā)展存在重要聯(lián)系。

作為一種多功能“載構(gòu)”蛋白，DISC1蛋白可以與200多種蛋白質(zhì)相結(jié)合，參與眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）通路［33］、GSK?3β/β?連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［34］、經(jīng)典或非經(jīng)典 Wnt通路［34］、γ?氨基丁酸受體（GABAR）通 路［35］和 N?甲 基 ?D?天 冬 氨 酸 受 體（NMDAR）通路［36］等，甚至直接對神經(jīng)元生長發(fā)育發(fā)揮調(diào)控作用。我們研究團(tuán)隊初步發(fā)現(xiàn)，DISC1蛋白與DXIDC1蛋白、PDE4蛋白和PDE4B蛋白均存在相互作用［6］。既往研究證實多種DISC1蛋白網(wǎng)絡(luò)成員的作用和功能，并發(fā)現(xiàn)其之間并非完全獨立的，通過直接和間接物理連接或化學(xué)連接、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間連接模式相互影響、彼此作用，形成一個以DISC1蛋白為核心的調(diào)控系統(tǒng)以發(fā)揮生物學(xué)作用。然而DISC1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，我們研究團(tuán)隊的工作僅是冰山一角，深入了解其具體作用途徑和機制對了解癲的發(fā)生與發(fā)展及治療具有重要意義。同時，DISC1蛋白是精神分裂癥、焦慮、雙相情感障礙等精神病相關(guān)蛋白，癲患者合并焦慮、抑郁等精神病的報道較為常見，因此推測，DISC1通路功能障礙可能是慢性癲患者發(fā)生焦慮、抑郁的原因，而抑制癲后異常神經(jīng)發(fā)生可能對這些行為障礙有治療作用。

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