李 嬌 ，王文秀 ，謝金文 ，沈志強(qiáng) ，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種急性、高度接觸性、病毒性腸道傳染病[1]，一直是嚴(yán)重威脅仔豬健康養(yǎng)殖的主要疫病之一。尤其自2010年末開始，我國(guó)豬場(chǎng)從南到北，從東到西陸續(xù)暴發(fā)了由PEDV變異毒株引起的以新生仔豬嚴(yán)重嘔吐、水樣腹瀉和高病死率為主要特征的腹瀉疫情[2]。目前PEDV變異毒株已是我國(guó)PEDV流行的優(yōu)勢(shì)毒株，變異毒株在我國(guó)豬群中的流行已不容忽視，甚至普遍認(rèn)為變異型PED將是未來幾年內(nèi)危害仔豬最為嚴(yán)重的腹瀉病之一[2]。疫苗接種是預(yù)防控制PED的主要手段，自PEDV出現(xiàn)以來，針對(duì)PED疫苗的研究一直都在持續(xù)進(jìn)行，過去受病毒培養(yǎng)困難等條件限制，PED疫苗研究與應(yīng)用一直受阻，直到Hofmann等[3]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中添加胰酶可提高PEDV在Vero細(xì)胞的適應(yīng)性，使PED疫苗研究與生產(chǎn)得到迅速發(fā)展。目前我國(guó)商品化的PED疫苗主要有傳統(tǒng)PEDV滅活苗和弱毒苗，但滅活疫苗存在對(duì)豬的免疫保護(hù)力較弱、滅活不完全導(dǎo)致病毒擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)等缺陷，弱毒疫苗存在毒力增強(qiáng)、易產(chǎn)生變異株等缺陷。同時(shí)，隨著PEDV病原學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入，其免疫機(jī)理日益清楚，PEDV以典型的局部黏膜免疫為主，存在于血清中的IgG不能提供完全保護(hù)，只有腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗體（SIgA）才能抵抗PEDV感染，哺乳仔豬通過初乳獲得母源SIgA，從而產(chǎn)生針對(duì)PEDV的被動(dòng)免疫保護(hù)。就目前我國(guó)PED流行現(xiàn)狀而言，疫苗免疫仍是控制該病發(fā)生、流行和降低高病死率的最佳方法，疫苗應(yīng)用依然是PED預(yù)防和控制的主要途徑。本文綜述了我國(guó)研究學(xué)者在PED滅活疫苗、弱毒疫苗等傳統(tǒng)疫苗以及亞單位、活載體疫苗等基因工程疫苗方面的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為新形勢(shì)下進(jìn)一步開展PED疫苗的研發(fā)提供借鑒與參考，對(duì)制定和優(yōu)化我國(guó)PED綜合防控措施具有一定的參考價(jià)值。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 滅活疫苗

PEDV滅活疫苗是最常規(guī)的疫苗，制造工藝簡(jiǎn)單，直接用人工繁殖獲得病原微生物，經(jīng)滅活后作為抗原，具有安全、可靠的特點(diǎn)。目前，已經(jīng)商品化的滅活疫苗為豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗。徐宏軍等[4]為研究PEDV常規(guī)疫苗毒株對(duì)現(xiàn)流行變異毒株的免疫保護(hù)效果，分別以轉(zhuǎn)瓶工藝與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝制備了PEDV轉(zhuǎn)瓶滅活苗與懸浮滅活苗，免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示懸浮滅活苗對(duì)仔豬保護(hù)率達(dá)80%，轉(zhuǎn)瓶滅活苗對(duì)仔豬保護(hù)率僅為20%，表明提高PEDV常規(guī)疫苗株的抗原含量，能夠有效提高常規(guī)滅活疫苗對(duì)PEDV流行變異毒株的保護(hù)效果。為篩選能用于變異型PEDV疫苗研發(fā)的流行毒株，代洪波等[5]進(jìn)行PEDV變異毒株的分離鑒定及滅活疫苗免疫保護(hù)效果研究，結(jié)果顯示以PEDV-JX12分離株制備的滅活疫苗免疫母豬，對(duì)哺乳仔豬的保護(hù)率達(dá)93.75%，表明PEDV-JX12分離株能夠適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)，免疫接種母豬能給哺乳仔豬提供有效保護(hù)，可用于變異型PEDV流行毒株的疫苗研發(fā)。滅活疫苗性質(zhì)比較穩(wěn)定，易于保存和運(yùn)輸，抗原含量達(dá)到一定水平后免疫母豬，可以有效防控哺乳仔豬PEDV的發(fā)生和流行。

1.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是一種將病原的致病力減弱但仍然具有活力的完整病原疫苗，將其接種動(dòng)物后類似自然感染過程，在動(dòng)物體內(nèi)停留一段時(shí)期即可增殖產(chǎn)生大量抗原，可同時(shí)誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果，具有使用劑量小、免疫原性好、不需佐劑、成本低、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。通過篩選獲得PEDV弱毒疫苗株，即可制備出安全、效價(jià)高的弱毒疫苗，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化的弱毒疫苗株有豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗、豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗，PED使用的弱毒疫苗株主要有CV777株、P-5V株、KPED-9株和DR13株。但研究學(xué)者對(duì)我國(guó)2010年以來PEDV流行毒株的分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)目前流行毒株與CV777等疫苗毒株相比，毒力基因發(fā)生了較大的改變[6-7]，由此推測(cè)以CV777株為代表的疫苗毒株對(duì)豬群的保護(hù)力不足，造成免疫失敗[8]。故毒株的選擇及其免疫原性、毒價(jià)是弱毒疫苗研發(fā)和生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，在PEDV流行毒株不斷發(fā)生變異的情況下，篩選并致弱免疫原性、毒價(jià)高的變異毒株是研發(fā)新型PEDV弱毒疫苗的緊要任務(wù)和必由之路。

2 基因工程疫苗

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，基因工程疫苗逐漸成為PED疫苗研究的熱點(diǎn)。目前利用基因工程技術(shù)已經(jīng)和正在研制開發(fā)的PED新型疫苗主要有腺病毒重組疫苗、枯草芽孢桿菌重組疫苗、轉(zhuǎn)基因玉米疫苗、大腸桿菌表達(dá)的亞單位疫苗、桿狀病毒表達(dá)的亞單位疫苗、畢赤酵母表達(dá)的亞單位疫苗，但均位于試驗(yàn)研究階段，均未實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。

2.1 腺病毒重組疫苗

腺病毒載體已被廣泛用于疫苗開發(fā)，是一種安全有效的活病毒載體。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）屬于造血生長(zhǎng)因子，能夠刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞功能，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，能增強(qiáng)疫苗的免疫效果，具有免疫佐劑的功能。趙攀登等[9]利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了串聯(lián)表達(dá)GM-CSF和PEDV S1蛋白的重組腺病毒，經(jīng)間接免疫熒光和Western-blot檢測(cè)顯示，S1和GM-CSF蛋白在重組腺病毒中獲得表達(dá)，該重組腺病毒的獲得為PEDV腺病毒重組活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 枯草芽孢桿菌重組疫苗

枯草芽孢桿菌在缺乏營(yíng)養(yǎng)或其他迫脅條件下，芽孢衣殼蛋白基因能表達(dá)一種抗逆性的休眠體—芽孢，以外層芽孢衣殼蛋白為分子載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將外源目的蛋白展示于芽孢表面，既能制備出具有特定生物活性的重組芽孢。重組芽孢不僅具有外源蛋白特有的生物活性，而且還攜帶芽孢本身獨(dú)特的抗逆性，能夠長(zhǎng)期存活并順利通過胃腸屏障激發(fā)腸道黏膜免疫。戴茜茜等[10]將PEDV S蛋白保護(hù)性抗原片段COE1與枯草芽孢桿菌芽孢外層衣殼蛋白基因cotB進(jìn)行重組，構(gòu)建融合表達(dá)cotBCOE1的整合型重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌淀粉酶基因amyE雙交叉，獲得重組枯草芽孢桿菌，對(duì)重組枯草芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶活性分析、PCR鑒定、Western-blot分析、免疫熒光試驗(yàn)，表明PEDV S蛋白保護(hù)性抗原片段COE1成功地展示于枯草芽孢桿菌芽孢表面，且保護(hù)性抗原片段具有良好的免疫原性，為研制PEDV新型、口服枯草芽孢桿菌重組疫苗奠定了基礎(chǔ)。

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米疫苗

利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)動(dòng)物基因工程疫苗用于疾病的預(yù)防及治療已成為植物基因工程的一個(gè)新興研究領(lǐng)域。滿坤等[11]根據(jù)玉米密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)合成優(yōu)化的PEDV主要中和抗原表位COE編碼基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBAC9036，將其轉(zhuǎn)化玉米自交系501的幼胚，通過分化再生培養(yǎng)和田間草甘膦抗性篩選獲得了2個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米穩(wěn)定株系，經(jīng)PCR、間接ELISA和Western-blot等鑒定表明COE基因已成功整合到玉米基因組并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，分別提取轉(zhuǎn)基因玉米穩(wěn)定株系葉片和種子的可溶性蛋白提取物，分別與佐劑混合后皮下注射小鼠，免疫小鼠均可產(chǎn)生針對(duì)PEDV COE基因的特異性抗體。表明成功獲得的轉(zhuǎn)基因玉米可有效表達(dá)COE蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的免疫原性，為進(jìn)一步開發(fā)PEDV轉(zhuǎn)基因玉米疫苗奠定了基礎(chǔ)。

2.4 大腸桿菌表達(dá)的亞單位疫苗

原核表達(dá)系統(tǒng)無法對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行翻譯以及翻譯后的加工和修飾，但原核表達(dá)系統(tǒng)以其培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、表達(dá)量高、易于純化等優(yōu)點(diǎn)，仍然成為外源蛋白表達(dá)的首選表達(dá)系統(tǒng)。桂銳等[12]將PEDVS1基因主要抗原區(qū)域克隆至pET-30a原核表達(dá)載體，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，Western-blot分析顯示重組蛋白能夠被PEDV多抗血清特異性識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性，為進(jìn)一步研制亞單位疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5 桿狀病毒表達(dá)的亞單位疫苗

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是一個(gè)以桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細(xì)胞為受體的表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)后的產(chǎn)物可進(jìn)行包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘?hào)肽切除及肽段的切割和分解等在內(nèi)的翻譯后加工和修飾，保證了所表達(dá)的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白。譚博敏等[13]將PEDV主要抗原表位S1和M基因克隆到桿狀病毒雙表達(dá)載體pFastBacTMDuai中，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBD-S1-M，并將其轉(zhuǎn)化至DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中制備重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-S1-M，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后，拯救出能夠共表達(dá)S1和M蛋白的重組桿狀病毒rBacmid-S1-M，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)表明，表達(dá)產(chǎn)物能與PEDV多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明共表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為PEDV基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。2.6 畢赤酵母表達(dá)的亞單位疫苗

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，操作方便、生長(zhǎng)快速、表達(dá)量高，又能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯以及翻譯后加工和修飾。胡青松等[14]將PEDV S蛋白部分保護(hù)性抗原COE基因?qū)氘叧嘟湍副磉_(dá)載體，構(gòu)建畢赤酵母pPIC9K-COE重組質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115中，篩選高拷貝陽性重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和 Western-blot分析表明 PEDV COE基因可在畢赤酵母中獲得分泌表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白具有很好的生物學(xué)活性，病毒中和試驗(yàn)表明重組蛋白免疫后的小鼠血清中能夠檢測(cè)到PEDV特異性中和抗體，為利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)PEDV亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與展望

PED發(fā)病急、病程短，豬只年齡越小死亡率越高，近幾年來變異型PED成為影響我國(guó)仔豬健康的最重要病毒性腸道傳染病，研發(fā)和應(yīng)用安全、有效的PED疫苗對(duì)控制和清除PEDV至關(guān)重要。對(duì)于PEDV的疫苗，滅活疫苗只能誘導(dǎo)體液免疫，仔豬只能通過哺乳獲得SIgA，保護(hù)效果不佳，弱毒疫苗存在散毒和返祖的危險(xiǎn)，同時(shí)現(xiàn)有滅活疫苗和弱毒疫苗抗原含量均偏低，且疫苗株對(duì)PEDV變異毒株的保護(hù)效果不確切。故篩選以臨床分離培養(yǎng)的變異毒株作為疫苗候選毒株，優(yōu)化和改進(jìn)現(xiàn)有的商品化疫苗，馴化出免疫原性好且毒價(jià)高的弱毒株將是PEDV常規(guī)疫苗研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的重點(diǎn)。PEDV基因工程疫苗尚處于研究階段，但新型基因工程疫苗通過口服可以在腸道快速定植，產(chǎn)生SIgA抗體，達(dá)到理想的黏膜免疫效果，其將在PED防控中起到越來越重要的作用，將具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。相信隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，以及PEDV致病機(jī)理和免疫機(jī)制研究的不斷深入，PEDV疫苗研究均將逐步得到完善，不斷為我國(guó)PED的綜合防控提供技術(shù)保障。

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