王淑琦 黃海榮 王桂榮

結(jié)核病(TB)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的重大傳染性疾病，是當前全球關(guān)注的棘手問題。我國是全球22個TB嚴重流行的國家之一，也是27個耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)嚴重流行的國家之一。中國是同時位列于3種疾病(TB、TB并發(fā)AIDS、MDR-TB)高負擔國家名單中的14個國家之一[1]。WHO期望至2035年TB的患病率減少90%，死亡率減少95%[1]。但如果沒有更有效的疫苗，更短、更安全的治療潛伏性結(jié)核感染和TB(包括耐藥結(jié)核病)的方案，以及不斷改良的診斷方法，將是不可能達到的。

TB的傳統(tǒng)實驗室檢查為抗酸桿菌涂片染色鏡檢法和固體或液體培養(yǎng)法，但MTB培養(yǎng)耗時長，對菌種基本情況要求高，且活菌不易獲取；抗酸染色法雖然快速經(jīng)濟，但敏感度低[2]；而且有30%～60%的肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)患者無細菌學依據(jù)[3]，導(dǎo)致涂陰PTB患者誤診誤治，其死亡率接近20%[4]，且10%～20%的TB傳播可歸因于涂陰患者[5]。另一方面，2016年估計全球有1040萬例新發(fā)TB患者，其中肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)占15%[4]，含菌量極低的特點使EPTB的診斷非常具有挑戰(zhàn)性。因此，發(fā)現(xiàn)一種新技術(shù)以提高診斷效率并減少涂陰PTB和EPTB的診斷延遲具有重要意義。

一、利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增(Xpert MTB/RIF，簡稱“Xpert”)技術(shù)的臨床應(yīng)用

Xpert檢測技術(shù)是一種以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)原理為基礎(chǔ)的體外診斷技術(shù)，通過核酸提取、擴增和檢測，將前處理后的待檢標本放入密閉的反應(yīng)盒中，通過上述三位一體操作程序自動檢出痰標本是否菌陽、荷菌量多少，以及是否對利福平耐藥[4]。WHO于2010年12月首先推薦使用Xpert技術(shù)檢測PTB患者痰標本中的MTB及其耐藥性，2013年開始推薦Xpert技術(shù)同時應(yīng)用于小兒PTB和EPTB的診斷。隨著WHO的政策發(fā)布及大力支持，這項新技術(shù)得到大量推廣，使得2010—2016年間全球130個國家采用Xpert技術(shù)對超過2300萬例患者進行了檢測，使全球MDR-TB的檢測數(shù)量增加了3～8倍[6]。這種新型的檢測方法憑借其高敏感度和特異度，以及準確、快速地檢測出利福平耐藥基因(ropB突變基因)的特點，逐漸在臨床上成為結(jié)核病檢查的重要方法。

有研究顯示，Xpert技術(shù)檢測痰標本中MTB的檢出限(limit of detection，LOD)為131 CFU/ml，2 h內(nèi)即可報出結(jié)果[7]。盡管Xpert檢測痰標本總的敏感度很高，但對荷菌量較少的標本檢測的敏感度較低[8]。如Xpert檢測涂陰痰標本的敏感度約為68%[9]，檢測AIDS并發(fā)TB患者的陽性檢出率約為74%[10]，但對HIV陽性、菌陰PTB患者的檢測敏感度卻降至43%[11]；對TB發(fā)病率較低的高資源國家的涂陰患者檢測的敏感度低至28%[12]；對其他肺外標本，由于其荷菌量通常比肺部低，測定的敏感度也相應(yīng)較低，尤其是胸腔積液的敏感度只有43.7%[13-14]。但也有最新報道顯示涂陰患者的敏感度尚可[15]，可能是因為該報道與其他低敏感度結(jié)果的研究相比，采集的樣本量不夠大有關(guān)。

由于Xpert技術(shù)本身獨立封閉的反應(yīng)環(huán)境和操作方便的大規(guī)模適用性，大大改善了對利福平耐藥性和MDR-TB的診斷[16]。在與藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)和BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)結(jié)果做比較時，利福平的耐藥率和敏感度檢測的正確率甚至可達到96.71%和98.25%[9,17]。作為利福平耐藥的快速檢測，Xpert檢測結(jié)果一般非常好，敏感度和特異度分別為94%和98%[9]；然而有研究表明，Xpert檢測野生型與突變型菌株混合標本的利福平耐藥相關(guān)突變的能力有限[18]，且檢測某些導(dǎo)致利福平耐藥的rpoB基因C533G位點突變的能力也下降[19]；可能與檢測患者混合感染時探針D和E產(chǎn)生的實時信號延遲，以及Xpert會錯誤識別無法導(dǎo)致利福平耐藥的rpoB基因F514F位點沉默突變有關(guān)，而F514F位點本身為利福平耐藥的無功能突變[20]，導(dǎo)致Xpert檢測偶爾產(chǎn)生少量樣本利福平耐藥的假陽性報告[21-22]。

二、超敏結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥基因檢測技術(shù)(Xpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)的推出

2017年3月，WHO推薦使用新一代檢測方法Xpert Ultra替代Xpert[4]。Xpert Ultra是作為新一代檢測方法開發(fā)的，用于提高MTB檢測和利福平耐藥性診斷的敏感度。與Xpert相比，Xpert Ultra檢測荷菌量少的標本(如EPTB、AIDS并發(fā)TB、兒童結(jié)核病等)敏感度更高[23]，其檢測特點如下：

1.檢測系統(tǒng)的改善：與Xpert相比，Xpert Ultra的操作步驟并沒有明顯的改變，GeneXpert軟件由原先的Dx 4.0版本及以上改變?yōu)镈x 4.6版本及以上，插件由Xpertise 6.1及以上改變?yōu)閄pertise 6.4b及以上，PCR體系由25 μl增至50 μl；Xpert檢測的報陽時間與報陰時間均由原先的110 min提前至77 min和66 min；最低檢出限由131 菌落形成單位(CFU)/ml下降為11.8 CFU/ml。此外，檢測原理由半定量半巢式循環(huán)閾值比較變?yōu)榘攵砍彩絇CR，并運用了高分辨率熔解曲線技術(shù)，以更好地區(qū)分ropB突變種類、將“沉默突變”報告為“敏感”，及在混合感染中檢測利福平的耐藥情況。根據(jù)檢測的目的基因ropB由5條探針增為6條探針(即原有的4條+新增的檢測兩種多拷貝序列IS6110和IS1081的2條探針)。此外，Xpert Ultra在檢測過程中會將菌量過低的結(jié)果判讀為“MTB檢出不明確”。

2.Xpert Ultra的質(zhì)量控制：每個測試均以探針質(zhì)控(PCC)和樣品處理質(zhì)控(SPC)驗證探針和試劑是否符合PCR反應(yīng)所需要求，以及細菌裂解情況和PCR反應(yīng)是否符合檢測的驗收標準。IS1081或IS6110陰性而SPC陽性時，結(jié)果顯示“MTB未檢出”；IS1081或IS6110陽性時，則根據(jù)相應(yīng)的熔解曲線判讀利福平的耐藥性；若樣本中ropB基因擴增循環(huán)數(shù)<2，則顯示“MTB檢出不明確”。

3.敏感度的提高：一項評估診斷準確性的研究結(jié)果顯示，Xpert Ultra的整體敏感度較Xpert技術(shù)高5%，其在涂陰和(或)培陽患者組的敏感度較Xpert技術(shù)高17%，在并發(fā)HIV感染患者組敏感度較Xpert技術(shù)高12%[23]。另一項研究表明，Xpert Ultra對HIV感染并發(fā)結(jié)核性腦膜炎的成年患者的檢出率明顯優(yōu)于Xpert技術(shù)和培養(yǎng)[24]。此外，模型研究顯示Xpert技術(shù)Ultra可提高PTB患者檢出率，早期診斷有助于早期治療、改善患者預(yù)后。由于Xpert Ultra敏感度的提高，極有可能也提高了對非存活MTB的檢出率，導(dǎo)致其對高負擔環(huán)境下成人PTB患者檢測的特異度有所下降[25]，但可喜的是，在TB低負擔環(huán)境中，Xpert Ultra檢測的特異度高達99.3%，為協(xié)助TB治療提供了重要信息[23]。

Xpert Ultra和Xpert的敏感度比較檢測限是通過將連續(xù)稀釋量化的菌落形成單位摻入痰液樣品中進行檢測的。MTB標準菌株H37Rv含有16拷貝的IS6110和5拷貝的IS1081，對于該菌株，Xpert Ultra和Xpert均能在標本濃度高于200 CFU/ml時，于樣本檢測時間內(nèi)100%正確地檢測到MTB和判斷利福平耐藥性。在標本濃度低于200 CFU/ml時，Xpert對于TB陽性標本在濃度為100、50和25 CFU/ml時的正確檢測率分別降至85%、50%和10%，檢測TB的LOD為 112.6 CFU/ml (95%CI：91.9～158.2 CFU/ml)，檢測利福平敏感度的LOD為112.6 CFU/ml (95%CI：91.9～158.2 CFU/ml)。然而，在濃度不低于25 CFU/ml時Xpert Ultra檢測的正確率均為100%，檢測TB的LOD為15.6 CFU/ml (95%CI：12.2～23.1 CFU/ml)，約為Xpert檢測TB樣本LOD經(jīng)8倍稀釋后的含菌量，檢測利福平敏感度的LOD為105.4 CFU/ml (95%CI：78.5～178.8 CFU/ml)；研究還發(fā)現(xiàn)，Xpert Ultra在標本濃度低于LOD濃度時仍可保證較高的敏感度，如標本濃度為2.5 CFU/ml時陽性檢出率仍可達到48%[22]。

4. 改善檢測沉默突變菌株：Xpert Ultra檢測修復(fù)了Xpert檢測ropB基因突變類型中沉默突變時錯誤報陽的情況，重新設(shè)計了一組ropB基因的稀松分子信標(sloppy molecular beacon,SMB)，提高了決定利福平耐藥相關(guān)第553號密碼子突變的檢測質(zhì)量，尤其是突變型與野生型DNA混合時。此外，Xpert Ultra還修復(fù)了另一個ropB基因的SMB，以便將沉默突變Q513Q和F514F與其他利福平耐藥相關(guān)的決定區(qū)域(rifampin resistance-determining region，RRDR)的突變區(qū)分[26]。Xpert Ultra添加額外的突變檢測rpoBSMB探針(rpo4)，使rpoBSMB組中的探針從3個增加到4個，rpo4 SMB也被設(shè)計成與rpoBS531L突變體比野生型序列更為互補的探針；與野生型樣本檢測時測得的熔解溫度(Tm)相比，在存在該突變的情況下Tm值升高。

此外，Xpert Ultra將Xpert原有的rpo1探針重新設(shè)計了探針序列，旨在將沉默突變與利福平耐藥相關(guān)突變區(qū)分開。當新的rop1 SMB與Q513Q或F514F突變序列雜交時測得的Tm較野生型序列雜交的Tm升高，而與RRDR突變序列雜交時則產(chǎn)生比野生型更低的Tm值。當研究者分別使用Xpert Ultra檢測TB的雙重和(或)三重突變、發(fā)生缺失，或含有終止密碼子的序列發(fā)生Q513Q或F514F沉默突變的菌株時，均可監(jiān)測到1個或多個rpoBSMB探針與序列雜交熔解時形成的Tm峰變化，該檢測重復(fù)性良好[26]。檢測系統(tǒng)將每個檢測到利福平耐藥突變序列的樣本報告為“ropB基因突變”，將Tm值低于系統(tǒng)本身識別標準的三重突變報告為“ropB基因突變不明確”，而含有Q513Q和F514F沉默突變序列的樣本則被報告為“利福平敏感”[22]，規(guī)避了Xpert檢測Q513Q和F514F沉默突變菌株時的假陽性報告。

綜上，Xpert Ultra總體探針檢測ropB基因是否突變的大致原理為：rpoB基因的特異性探針(rpo1，rpo2，rpo3和rpo4)首先同ropB雜交，然后隨著Tm的升高各自的擴增子靶標熔解，形成了一條隨著溫度不斷升高、熒光信號由弱變強再變?nèi)醯腄NA熔解曲線。以檢測野生型菌株測得的峰形為標準，將形成的1個或多個不同于野生型熔解曲線峰形的樣本報告為“含rpoB突變和利福平耐藥菌”。

5.Xpert Ultra檢測的異質(zhì)耐藥性與兼容性：檢測同時含有rpoBS531L突變的DNA和野生型DNA的混合物來評估Xpert Ultra檢測異質(zhì)性的能力(rpoBS531L突變?yōu)樽畛Ｒ姷腞RDR突變)[27]。S531L突變存在時，Xpert Ultra的rop4 SMB探針雜交形成熔解曲線的峰值相對野生型更高：且即使在野生型菌樣本中含有僅10%突變菌DNA時仍可檢出明顯的突變峰，在含有5%突變菌DNA比率時亦可檢出明顯的雙峰(一條為野生型峰形，一條為突變型峰形)并報告為“利福平耐藥陽性”。當混合物中突變菌DNA含量少于1%時，則視為超出Xpert Ultra的耐藥檢測限。對于其他類型突變的混合物雖不如S531L敏感，但當含量高于20%～40%時，可確切地檢測到含rpoB突變體DNA的混合物中的RRDR突變。

關(guān)于Xpert Ultra檢測的兼容性，研究者選擇了22株IS6110序列不同拷貝數(shù)的菌株進行檢測，其中包括MTB臨床菌株、標準菌株H37Rv、牛分枝桿菌(M.bovis)和M.bovis卡介苗(BCG)，結(jié)果均為陽性[26]，表明Xpert Ultra對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中不同菌種的檢出具有良好的兼容性。

6.Xpert Ultra檢測的特異性和排他性：對于Xpert Ultra 檢測的特異性和排他性，研究者將臨床相關(guān)的106CFU/ml 非結(jié)核分枝桿菌(NTM，包含結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌)或環(huán)境污染的分枝桿菌同50 CFU/ml MTB標準株混合，每種混合物一式三份進行測試，檢測結(jié)果均為MTB陽性且對利福平敏感，表明NTM的高濃度混雜不會明顯干擾Xpert Ultra檢測MTB的效能。檢測臨床痰標本時，以培養(yǎng)結(jié)果作為參考，Xpert Ultra的敏感度較Xpert更高，但特異度差異無統(tǒng)計學意義[22]。另外，Xpert Ultra檢測盒可在Xpert檢測盒使用的GeneXpert平臺上運行，對于資源有限的國家，每個檢測盒的優(yōu)惠價格將保持不變(約10美元)[28]。

三、Xpert Ultra檢測的不足

Xpert Ultra作為新一代智能MTB檢測試劑盒，雖然相對于Xpert檢測樣本的敏感度有所提升，如在痰液標本中LOD從Xpert的112.6 CFU/ml菌落下降到Xpert Ultra的15.6 CFU/ml[26]，但Xpert和Xpert Ultra檢測的最新對比研究表明，Xpert Ultra敏感度的提高是以降低患者特異度為代價的[29]。還有一些研究數(shù)據(jù)顯示，Xpert Ultra檢測的特異度低于Xpert，下降的原因可能主要出現(xiàn)在患者治療后期，其痰液等標本中非活性MTB被系統(tǒng)識別，而造成了部分假陽性結(jié)果[23]。這就意味著，臨床醫(yī)生在參考復(fù)治患者實驗室檢查結(jié)果時，需要進一步結(jié)合臨床病史、癥狀體征，以及其他實驗室檢查。

理論上講，Xpert Ultra檢測的高敏感度應(yīng)該會影響公共衛(wèi)生健康的關(guān)鍵指標，如開始治療的患者例數(shù)及死亡率。但與涂片抗酸染色鏡檢相比，盡管Xpert Ultra的敏感度大幅度提高，但在衡量Xpert Ultra對患者死亡率影響的研究中顯示，其對公共衛(wèi)生的貢獻并沒有體現(xiàn)出應(yīng)有的價值[30-31]；同時，Xpert Ultra的廣泛使用應(yīng)該會增加就診患者的檢出率，進而增加抗結(jié)核治療患者的數(shù)量，但目前的研究結(jié)果顯示影響程度并不大[32-33]，具體影響還需進一步進行系統(tǒng)評估。

雖然Xpert Ultra在國內(nèi)并未上市，但Xpert在國內(nèi)的檢測中的確存在對EPTB與涂陰結(jié)核標本的檢測敏感度不足的問題。比如國內(nèi)的報道中，張愛梅等[34]研究Xpert在EPTB標本的數(shù)據(jù)顯示，以細菌培養(yǎng)為金標準時Xpert檢測的敏感度為53.8%，其中涂陰組的敏感度僅為34.6%。以臨床診斷為參考標準，孫慶燕等[35]的研究顯示，Xpert在EPTB患者中的檢出率僅19%；張煒平和秦超[36]的研究顯示，Xpert在涂陰PTB痰標本中的檢出率為48.57%。張海晴等[37]在Xpert對4個TB高負擔國家疑似PTB患者痰標本檢測的分析中顯示，涂陽組檢出率為98.2%(551/561)、涂陰組為72.1%(124/172)，且復(fù)檢可提高涂陰組檢出率。所以，Xpert Ultra技術(shù)針對國內(nèi)涂陰和EPTB患者的少菌型樣本的檢測效果值得期待，預(yù)測會體現(xiàn)在患者病程中提早報告菌陽、減少重復(fù)檢測次數(shù)、降低支出成本等方面。

綜上所述，Xpert Ultra的應(yīng)用可提高TB患者的檢出率，尤其是PTB并發(fā)HIV感染者、兒童結(jié)核病和EPTB等荷菌量較低的患者。隨著臨床抗結(jié)核藥物的應(yīng)用和發(fā)展，從患者處所獲標本逐漸向少菌型發(fā)展，在這種情況下，提高檢測方法的敏感度將更有助于確定TB患者，為實現(xiàn)根除TB的目標奠定堅實的基礎(chǔ)。

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