張新艷

摘要 本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的氣單胞菌屬16S rDNA序列，設(shè)計嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌16S rDNA序列的特異保守區(qū)，建立這2種菌的快速PCR檢測方法。結(jié)果表明，僅嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌得到了特異性擴(kuò)增，而幾種常見弧菌科水產(chǎn)病原菌，包括豚鼠氣單胞菌、易損氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌并未得到特異性擴(kuò)增，說明設(shè)計的引物可以用于這2種病原的PCR快速檢測方法的建立，可以為水產(chǎn)動物嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的快速檢測、病害預(yù)警和病原調(diào)查提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 嗜水氣單胞菌；溫和氣單胞菌；PCR；快速檢測

中圖分類號 Q93-337 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）22-0238-02

Abstract Based on the 16S rDNA sequence of Aeromonas hydrophila published in GenBank database，the specific conserved region of 16S rDNA sequence of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria was designed and a rapid PCR method was established for the detection of these two bacteria.The results showed that only Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria were specifically amplified，while several common aquatic pathogens，including Aeromonas hydrophila，Aeromonas caviae，Aeromonas trota，Aeromonas salraonicida Vibrio parahaemolyticus，V. vulnificus，V.anguillarum，V. alginolyticusere were not specifically amplified. Thus the primers could be used for rapid detection of the two pathogens and provided the technical support for disease warning and pathogen investigation of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria.

Key words Aeromonas hydrophila；Aeromonas sobria；PCR；rapid detection

氣單胞菌廣泛存在于淤泥、海水、淡水、土壤、污水中，代表性的有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和溫和氣單胞菌（A. sobria），可引起哺乳類動物、禽類、兩棲類以及魚類的局部感染，如皮膚潰瘍或敗血癥等[1-3]，也可以單獨或與其他致病菌共同感染，是水生動物常見致病菌，其中在魚類中最為常見，不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還可以通過水產(chǎn)動物和水產(chǎn)品感染人畜，導(dǎo)致人畜食物中毒和腹瀉，引發(fā)人類急性腸胃肌肉壞死、筋膜炎、敗血癥等，影響食品安全，已成為人-獸-魚共患病原菌，引起了水產(chǎn)界、獸醫(yī)學(xué)界和醫(yī)學(xué)界的高度重視[4-7]。目前，檢測菌種的方法主要有Dot-ELISA、鑒別培養(yǎng)基、間接ELISA等[8-11]，但都存在特異性不強(qiáng)或操作復(fù)雜等缺點。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，病原菌的檢測又多了一種方法[12-14]。本研究以公開發(fā)表的嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌16S rDNA序列的特異保守區(qū)設(shè)計一組引物，建立這2種菌的快速PCR檢測方法，旨在為水產(chǎn)動物嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的快速檢測和病原調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株（表1）在福建省淡水水產(chǎn)研究所保存，所有菌株皆用營養(yǎng)瓊脂（NA）和營養(yǎng)肉湯（NB）（北京陸橋）進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。

2×PCR MasterMix、DNA marker D2000為TIANGEN產(chǎn)品，瓊脂糖為OXOID產(chǎn)品，其他為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的氣單胞菌屬16S rDNA序列設(shè)計嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌特異性引物，引物由Invitrogen公司合成，具體見表2。

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取

從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細(xì)胞，接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在28 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日取1mL菌液5 000 r/min離心收集菌體，加入100 μL無菌重蒸H2O，旋渦混勻后，沸水浴2 min，以12 000 r/min離心5 min，上清液中即含細(xì)菌基因組DNA，可直接用于PCR擴(kuò)增。

1.4 引物特異性擴(kuò)增

采用普通PCR進(jìn)行引物特異性驗證，PCR反應(yīng)在Epp-endorf Mastercycler Gradient PCR儀上進(jìn)行，每個樣品分別加入2×PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA（20～200 ng/μL）1 μL，用無菌超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，然后在94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，反應(yīng)循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)均設(shè)置不含DNA的空白對照。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用柯達(dá)凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

1.5 應(yīng)用

選取實驗室近年來分離的氣單胞菌菌株50株，分別用這2對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時用ELISA方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌特異性擴(kuò)增

使用引物對AH-F/R1對18株常見水產(chǎn)病原菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，僅嗜水氣單胞菌菌株得到特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增得到目的條帶大小約680 bp，與預(yù)期相符。因此，該引物對可以用于嗜水氣單胞菌的特異性分析。

2.2 溫和氣單胞菌特異性擴(kuò)增

使用引物對AS-F/R1對18株常見水產(chǎn)病原菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，僅溫和氣單胞菌菌株得到特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增得到目的條帶大小約680 bp，與預(yù)期相符。因此，該引物對可以用于溫和氣單胞菌的特異性分析。

3 結(jié)論與討論

采用PCR方法對近年來實驗室分離的菌株進(jìn)行檢測，嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的檢測結(jié)果與采用ELISA方法進(jìn)行檢測的檢出結(jié)果一致；同時對部分菌株進(jìn)行16S rDNA測序或進(jìn)行微生物質(zhì)譜鑒定，結(jié)果也一致。因此，可證明所建立的方法比較可靠，可用于嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的快速檢測。

暴發(fā)性流行病的防治可通過對病原的早期診斷和長期監(jiān)控等重要手段，除傳統(tǒng)的生理生化鑒定外，有必要建立靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的快速鑒定方法。與傳統(tǒng)鑒定方法相比，PCR技術(shù)具有操作簡便易行、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)勢，所以在鑒定病原菌方面得到越來越廣泛的利用[15-16]。通過比較、分析已知細(xì)菌核糖體RNA（rRNA）序列，擴(kuò)增其中的特異性片段來鑒別細(xì)菌被證實是行之有效的方法[17-18]。本研究通過比對GenBank中氣單胞菌屬16S rRNA序列，設(shè)計特異性引物試圖將嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌與其他水體中常見弧菌科細(xì)菌特別是水產(chǎn)氣單胞菌屬細(xì)菌鑒別開來，研究中下游引物使用2種細(xì)菌兼有的共同序列，上游引物使用特異性的引物。結(jié)果表明，設(shè)計的2對引物能夠分別很好地擴(kuò)增嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌，其他試驗菌株并未得到擴(kuò)增，說明此引物具有很強(qiáng)的特異性，可以較好地應(yīng)用于嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的PCR快速檢測。

在細(xì)菌基因組DNA模板的處理上，本研究采用了熱處理菌液后直接用于PCR擴(kuò)增，大幅度縮短了試驗時間，減少了中間部分操作。理論上，熱處理的DNA模板為微克級，本研究PCR法擴(kuò)增的靈敏度可檢測的細(xì)菌數(shù)量為100 CFU/mL，完全能夠滿足在漁業(yè)生產(chǎn)中病原早期診斷、監(jiān)控和暴發(fā)性流行病預(yù)警的需要。隨著PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和完善，它將成為水產(chǎn)動物致病菌檢測的重要技術(shù)手段，為實驗室診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供較好的分析依據(jù)。

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