韓 霄， 趙呈天

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所， 山東 青島 266003)

多囊腎(Polycystic Kidney Disease, PKD)是一種常見(jiàn)的人類(lèi)遺傳病。患者常常表現(xiàn)出腎囊腫，側(cè)腹部痛，血尿等癥狀[1-2]。PKD有2種類(lèi)型，分別是常染色體顯性PKD (Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD)，以及常染色體隱性PKD (Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease, ARPKD)。常染色體隱性PKD比較少見(jiàn)，由常染色體隱性基因PKHD1控制。

ADPKD相對(duì)來(lái)說(shuō)更為常見(jiàn)，病人還會(huì)出現(xiàn)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，結(jié)腸憩室以及心血管疾病。人群中ADPKD的患病率大約在1/1 000～1/500[3]?？刂艫DPKD的基因有2個(gè)，PKD1和PKD2。PKD1編碼的polycystin-1是個(gè)跨膜蛋白，在細(xì)胞信號(hào)識(shí)別中行使功能[4]。PKD2編碼的polycystin-2是一個(gè)鈣離子通道蛋白，具有6個(gè)跨膜區(qū)段。在C端胞內(nèi)區(qū)，有EF-Hand和coiled-coil結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在斑馬魚(yú)、小鼠、以及人類(lèi)中高度保守[5]。事實(shí)上，在斑馬魚(yú)中，有78%～79%的pkd2序列與人和小鼠是同源的。

polycystin-1和polycystin-2在體內(nèi)和體外都能通過(guò)其C端胞內(nèi)區(qū)穩(wěn)定結(jié)合成異源二聚體[6-7]，這一復(fù)合物能夠感受胞外Ca2+的濃度[8]，而且對(duì)于細(xì)胞間的粘附起到重要作用。例如polycystin-2能夠與細(xì)胞骨架蛋白Hax-1相互作用[9], 在體內(nèi)可以與CD2-AP相互作用[10]，這2種蛋白會(huì)與polycystin-2的C末端相結(jié)合。在人類(lèi)的腎臟中，polycystin-1和polycystin-2都定位在腎小管上皮細(xì)胞的纖毛上，纖毛的缺陷會(huì)直接導(dǎo)致該信號(hào)通路的阻斷，進(jìn)而引起PKD[11-12]。

斑馬魚(yú)是研究纖毛缺陷的良好模式動(dòng)物[13]，斑馬魚(yú)pkd2基因與PKD2同源[14]。現(xiàn)在已經(jīng)鑒定出數(shù)個(gè)pkd2突變體。目前為止，它們的突變位點(diǎn)大都位于跨膜區(qū)。斑馬魚(yú)pkd2突變體表現(xiàn)出體軸彎曲，心肌增生，左右不對(duì)稱(chēng)異常等缺陷[14-15], 但是纖毛的數(shù)目以及運(yùn)動(dòng)并沒(méi)有異常[16]。

斑馬魚(yú)的庫(kù)式泡(Kupffer’s Vesicle， KV)是早期發(fā)育過(guò)程中左右不對(duì)稱(chēng)的決定器官，其中分布著大量的纖毛。庫(kù)式泡在小鼠中的同源結(jié)構(gòu)是Node，Node與左右不對(duì)稱(chēng)的關(guān)系已經(jīng)有比較清楚的闡釋?zhuān)耗遗輦?cè)壁的動(dòng)纖毛驅(qū)動(dòng)其中的液體形成一個(gè)從左向右的水流，囊泡中纖毛可通過(guò)Polycystin-2 感受周?chē)后w的運(yùn)動(dòng)[17]，導(dǎo)致此處細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高[18]進(jìn)而引起一系列細(xì)胞命運(yùn)的決定。抑制鈣離子信號(hào)通路將會(huì)導(dǎo)致隨機(jī)的器官左右分布。

本研究利用CRISPR/Cas9方法構(gòu)建了斑馬魚(yú)pkd2的突變體，發(fā)現(xiàn)pkd2的突變可導(dǎo)致斑馬魚(yú)產(chǎn)生體軸背部彎曲，左右不對(duì)稱(chēng)等發(fā)育缺陷，而纖毛發(fā)育相對(duì)正常。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)體軸的背部彎曲并非由膠原蛋白的異常表達(dá)所導(dǎo)致，這一點(diǎn)與之前的報(bào)導(dǎo)并不一致[19]。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)抑制FGF信號(hào)通路可部分緩解斑馬魚(yú)pkd2體軸的彎曲程度，表明FGF信號(hào)可能參與調(diào)控體軸的發(fā)育。鑒于所獲得的pkd2突變體突變位點(diǎn)位于C端，編碼蛋白僅僅缺失所編碼蛋白的胞內(nèi)區(qū)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胞內(nèi)區(qū)對(duì)polycystin-2的功能至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型斑馬魚(yú)為T(mén)uebingen品系，胚胎收集后培養(yǎng)于E3培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度為28.5 ℃[20]。Cas9靶位點(diǎn)序列為5’-GAGCTCTATCAATGATATCC-3’，Cas9 mRNA，sgRNA合成方法均依據(jù)已報(bào)道的步驟[21]。以下引物用以擴(kuò)增一段包含靶位點(diǎn)的序列：5’-TCTTTTGCTCACAGTTTCACG-3’, 5’-AAAAACAGCCATAACG-3’。

1.2 原位雜交實(shí)驗(yàn)

取野生型和突變體胚胎，培養(yǎng)至18 h，剝?nèi)ヂ涯?，在含?.15% PTU的E3中繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，分別在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜。lefty2,col2a1a,col9a2基因克隆至T3載體。探針合成以及原位雜交實(shí)驗(yàn)均按照已報(bào)道的步驟[22]。圖像采集使用徠卡(Leica)公司M165FC顯微鏡。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)

胚胎于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，于PBST中洗2次，每次5 min；于蒸餾水中洗2次，每次5 min。在丙酮中洗一次，置于-20℃冰箱中20 min；于蒸餾水中洗2次，每次5 min；于PBST中洗2次，每次5 min；在包含2%山羊血清的PBD(1 ×PBS，1%小牛血清，1% DMSO)中封閉1 h；棄去封閉液，在加入乙?；⒐艿鞍卓贵w(1∶500，Sigma)的PBD孵育，置于4攝氏度冰箱過(guò)夜。棄去上清液，于PBD中清洗4次，每次30 min；在PBD中加入二抗(1∶500)以及鬼筆環(huán)肽抗體(1∶500, Invitrogen)，室溫孵育4 h；在PBST中洗4次，加入DAPI(1∶3 000)，室溫孵育20 min，于Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝。

1.4 FGF信號(hào)抑制劑處理實(shí)驗(yàn)

將pkd2突變體胚胎于18 hpf時(shí)期剝?nèi)ヂ涯?，置?5 μmol/L濃度SU5402的E3溶液培養(yǎng)至72 hpf，使用LeicaM165FC顯微鏡觀察并拍攝。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 pkd2突變體的構(gòu)建及鑒定

pkd2編碼一個(gè)6次跨膜蛋白，N端和C端均位于胞內(nèi)區(qū)，其編碼基因包含14個(gè)外顯子。使用CRISPR/Cas9技術(shù)得到了其突變體，靶位點(diǎn)位于第十個(gè)外顯子上，導(dǎo)致C端胞內(nèi)區(qū)的幾個(gè)重要結(jié)構(gòu)域發(fā)生移碼突變(見(jiàn)圖1A)。靶位點(diǎn)序列中包含有1個(gè)EcoRV酶切位點(diǎn)，敲除之后該酶切位點(diǎn)也隨之缺失。因此，可以通過(guò)在靶位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增出一段563 bp長(zhǎng)度的片段，用酶切的方法鑒定突變個(gè)體。野生型個(gè)體中，EcoRV將該片段完全消化成174和389 bp的兩段，而F1代雜合子只有部分片段能夠被消化(見(jiàn)圖1B)。

胚胎發(fā)育至第二天，pkd2突變體表現(xiàn)出典型的體軸向背側(cè)彎曲的表型。而且觀察到，體軸的彎曲程度隨著個(gè)體發(fā)育變得越來(lái)越嚴(yán)重，且純合突變個(gè)體無(wú)法存活至成年。有報(bào)道稱(chēng)，嗎啉環(huán)反義寡核苷酸干擾pkd2基因會(huì)導(dǎo)致腎臟囊腫的形成[14]，pkd2突變體中并未發(fā)現(xiàn)這種表型(見(jiàn)圖1C、D)。

2.2 纖毛觀察以及左右不對(duì)稱(chēng)缺陷

鑒于polycystin-2主要存在于纖毛上，對(duì)pkd2突變體的纖毛進(jìn)行了檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示，發(fā)育至第二天，pkd2突變體的腎管纖毛并未出現(xiàn)數(shù)目以及形態(tài)的異常(見(jiàn)圖2)，同時(shí)也未在其它組織纖毛上發(fā)現(xiàn)明顯異常(圖未出示)。進(jìn)一步使用lefty2這一心臟原基的標(biāo)記基因作為探針，對(duì)受精后22小時(shí)的野生型和pkd2突變體胚胎分別進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖3A)。結(jié)果表明，在野生型胚胎中，lefty2的表達(dá)幾乎都在身體左側(cè)(n=26)，只有極少數(shù)在身體右側(cè)(n=1)和中間(n=1)。發(fā)育早期尚無(wú)法區(qū)分pkd2純合突變體，我們觀察到在pkd2雜合突變體的后代中，有大約1/4出現(xiàn)lefty2表達(dá)在身體右側(cè)(n=6)和中間(n=7)的情況，其余約3/4表達(dá)在身體左側(cè)(n=35)(見(jiàn)圖3 B)。

2.3 pkd2突變體體軸彎曲與膠原蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)

之前報(bào)導(dǎo)pkd2突變體體軸彎曲可能是由于膠原蛋白的異常表達(dá)所致，因此我們檢測(cè)了所獲得突變體中膠原蛋白基因col2a1a,col9a2的表達(dá)狀況。與之前的結(jié)果不同，col2a1a,col9a2基因的表達(dá)在pkd2突變體和野生型中并沒(méi)有明顯區(qū)別(見(jiàn)圖4)。這說(shuō)明，膠原蛋白基因的表達(dá)異常不是導(dǎo)致pkd2突變體的體軸彎曲的直接原因。

(A．polycystin-2結(jié)構(gòu)域分析，使用SMART軟件，敲除位點(diǎn)位于第十外顯子；B.pkd2突變體的酶切鑒定；C. 發(fā)育至2天的野生型；D. 發(fā)育至2天的pkd2突變體斑馬魚(yú)。A. Structure and the mutant locus of polycystin-2, predicted by SMART software. Mutant has a 1-bp deletion in the tenth exon; B. Sample electrophoresis image for identification ofpkd2allele; C. External phenotype of 2dpf WT mutant embryo;D. External phenotype of 2dpfpkd2-/- mutant embryo.)

圖1pkd2突變體構(gòu)建
Fig.1 Generation of zebrafishpkd2mutant

(A.野生型； B.pkd2突變體。綠色：乙?；⒐艿鞍卓贵w標(biāo)記纖毛；藍(lán)色：DAPI；紅色：鬼筆環(huán)肽。 Cilia were visualized by anti-acetylated alpha-tubulin antibody showing in green.(Blue, DAPI; Red, phalloidin.)

圖2 野生型和pkd2突變體的腎管纖毛免疫組化

Fig.2 Immunostaining results of pronephric duct cilia in WT andpkd2mutantembryos

(lefty2在胚胎體軸左側(cè)，右側(cè)和中間位置的表達(dá)圖式；B.lefty2在野生型和pkd2突變體中表達(dá)位置的數(shù)量統(tǒng)計(jì)，L:左側(cè)；R：右側(cè)；M：中間。A～A″.Sample images showing expression oflefty2 in the Left, Right and Middle parts of embryos; B. Bar graph showing statistic results oflefty2 expression in WT andpkd2 embryos.)

圖3pkd2雜合子后代22 hpf胚胎lefty2原位雜交

Fig.3 Expression oflefty2 in 22 hpf WT andpkd2mutant embryos

(A～A’. 野生型(A)和pkd2突變體(A′)軀干部位col2a1a的表達(dá)圖式；B～B’.野生型(B)和pkd2突變體(B′)軀干部位col9a2的表達(dá)圖式。A～A’.Expression ofcol2a1ain wild type andpkd2 mutant embryos；B～B’.Expression ofcol9a2 in wild type andpkd2 mutant embryos.)

圖4 膠原蛋白基因col2a1a,col9a2原位雜交結(jié)果

Fig.4 In situ hybridization ofcol9a2col2a1aandcol9a2

2.4 FGF抑制劑可使pkd2突變體體軸彎曲缺陷部分恢復(fù)

為進(jìn)一步研究pkd2突變體胚胎體軸彎曲的原因，我們利用FGF受體抑制劑SU5402對(duì)突變體胚胎進(jìn)行了處理。在72 h的突變體胚胎中，體軸背部彎曲程度非常嚴(yán)重，而FGF抑制劑處理后的胚胎，體軸背部彎曲化程度發(fā)生了部分緩解，表明FGF信號(hào)在突變體體軸背部化彎曲過(guò)程中發(fā)揮一定作用(見(jiàn)圖5)。

(A～B.pkd2突變體3dpf胚胎，未經(jīng)SU5402處理(A)和處理后(B)。)

圖5 FGF信號(hào)抑制劑處理pkd2突變體胚胎

Fig.5Pkds2 mutant embryos treated with SU5402

3 討論

本文使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了新的pkd2突變體，并且對(duì)其表型進(jìn)行了初步的分析。不同于以往的pkd2突變體，在所獲斑馬魚(yú)突變體中，pkd2編碼的蛋白僅缺失其蛋白C端胞內(nèi)區(qū)(160個(gè)氨基酸)。雖然免疫組化的結(jié)果表明突變體纖毛發(fā)育基本正常，但突變體存在體軸背部彎曲，左右不對(duì)稱(chēng)等發(fā)育缺陷，表明C端胞內(nèi)區(qū)對(duì)polycystin-2功能的發(fā)揮至關(guān)重要。

此外，我們還在pkd2末端最后一個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了一個(gè)Cas9靶位點(diǎn)，F(xiàn)0代注射顯示胚胎有體軸彎曲的表型。這表明，polycystin-2末端的數(shù)個(gè)氨基酸的功能可能也是至關(guān)重要的。然而在與野生型交配后得到的F1代中，并沒(méi)有檢測(cè)到雜合突變體的存在。

嗎啉環(huán)反義寡核苷酸敲降pkd2可以使膠原蛋白基因col2a1a、col2a2表達(dá)增強(qiáng)，我們?cè)趐kd2突變體中并未觀察到這種現(xiàn)象。另外，敲降col2a1可以挽救pkd2體軸彎曲的缺陷。其原因可能是嗎啉環(huán)反義寡核苷酸會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生一些未知的影響，例如脫靶效應(yīng)等。另外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的pkd2基因敲除也可能會(huì)影響其它基因的表達(dá)，其中有可能包含膠原蛋白相關(guān)的基因[23]。隨著胚胎的發(fā)育，我們發(fā)現(xiàn)pkd2突變體的體軸彎曲程度在逐漸增大，這暗示著這一表型可能是某種因子持續(xù)表達(dá)或者作用的結(jié)果。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)使用FGF受體抑制劑處理pkd2突變體胚胎，可部分恢復(fù)突變體體軸彎曲的程度，表明FGF信號(hào)可能參與了胚胎體軸的發(fā)育調(diào)控。

總之，基因以及其表達(dá)調(diào)控是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，而pkd2突變體體軸彎曲等表型形成的機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。