鄭博元，王華軍，鄭小飛，陳述祥

腱骨結(jié)合部損傷及愈合問題廣泛存在于全身各關(guān)節(jié)，在膝關(guān)節(jié)交叉韌帶、肩關(guān)節(jié)肩袖以及跟腱止點(diǎn)等重要位置尤顯突出。在美國，肌腱勞損約占運(yùn)動損傷的30%～50%，每年約有20萬例前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）出現(xiàn)撕裂[1]；而肩袖損傷約占肩關(guān)節(jié)疾病的50%，發(fā)病率隨年齡增長而逐步升高，美國每年用于肩袖手術(shù)及康復(fù)的費(fèi)用高達(dá)70億美元。但韌帶重建后長期療效并不樂觀，約有32%的ACL重建患者預(yù)后不滿意，10%需要再次手術(shù)，肩袖修復(fù)術(shù)后再斷裂率也高達(dá)30%～94%[2-3]。牢固的腱骨愈合是保證韌帶重建成功并發(fā)揮功能的關(guān)鍵[4]，而腱骨損傷和愈合的不同階段均受到多種生物因子和信號通路的調(diào)控。進(jìn)一步明晰生物因子及其信號通路的調(diào)控機(jī)制和作用，同時從基因?qū)用嫱ㄟ^非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）調(diào)控生物因子，對改善腱骨愈合質(zhì)量、加快腱骨愈合速度、降低重建術(shù)后的再斷裂率具有重要意義。

1 腱骨愈合過程與生物因子

腱骨連接界面從肌腱過渡到骨通?？煞譃榧‰欤ɡw維結(jié)締組織）層、非鈣化纖維軟骨層、鈣化纖維軟骨層和骨組織層，這種組織結(jié)構(gòu)有利于載荷傳遞以及應(yīng)力的分散。修復(fù)手術(shù)很難恢復(fù)原有組織結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性，通常只是形成了富含Ⅲ型膠原的瘢痕組織，在載荷傳遞以及拉應(yīng)力分散等方面明顯不足，也因此容易再次受到損傷[5]。術(shù)后腱骨愈合通常經(jīng)歷3個連續(xù)時期[6]：①第1周炎癥期，炎癥細(xì)胞吞噬壞死組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等一系列生物因子；②第2周修復(fù)期，上述生長因子明顯增多，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成以及骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的增殖分化；③第3周開始進(jìn)入重塑期，膠原逐漸排列整齊，新形成的骨與肌腱移植物進(jìn)行重塑，機(jī)械強(qiáng)度提高。

1.1 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）

白細(xì)胞介素能夠協(xié)調(diào)白細(xì)胞、免疫細(xì)胞和紅細(xì)胞生長因子，通過傳遞細(xì)胞信息影響造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，在腱骨愈合過程中往往起到促炎作用。Haslauer等[7]發(fā)現(xiàn)在腱骨愈合的早期階段，IL-8和IL-6分泌增加并可募集和激活中性粒細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)急性炎癥的進(jìn)展。而炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-1能夠抑制肌腱衍生祖細(xì)胞（tendonderived progenitor cells，inTPC）向肌腱、軟骨和骨骼分化，阻礙細(xì)胞外基質(zhì)和蛋白聚糖的分泌，減緩腱骨愈合[8-9]。Lin等[10]通過敲除IL-4或IL-6的小鼠模型，驗(yàn)證了促炎癥因子IL-6和抗炎癥因子IL-4在肌腱愈合中的相反作用。由于早期炎癥反應(yīng)對腱骨愈合不利，因此在術(shù)后早期，應(yīng)盡可能抑制IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子的作用，同時提高IL-4等抗炎因子的正性效應(yīng)。

1.2 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）

MMPs家族因需要鈣鋅等離子輔助而得名，對彈力蛋白、膠原蛋白等起降解作用，參與組織的發(fā)育、創(chuàng)傷乃至移植的愈合重塑。MMP-1、MMP-2以及金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）在小鼠和兔的腱骨界面表達(dá)，提示其參與腱骨修復(fù)的重塑過程[11-12]。Pastenak等[11]的組織學(xué)和生物力學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，通過阻斷MMPs活性可促進(jìn)腱骨愈合，正常情況下MMPs對基質(zhì)的分解作用不利于腱骨愈合進(jìn)程。如欲恢復(fù)腱骨結(jié)合的生物及力學(xué)特性，必須抑制MMPs的產(chǎn)生，其中一個重要思路是增加內(nèi)源性抑制劑TIMPs數(shù)量，以拮抗其對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用。

1.3 生長因子（growth factor，GF）

1.3.1 TGF-βTGF-β是一個調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的家族，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有β1、β2、β3等 3個亞型。部分亞型在損傷修復(fù)過程中可促進(jìn)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集以抑制慢性炎癥，具有調(diào)節(jié)自身免疫和抑制移植排斥反應(yīng)的作用。Kovacevic等[13]在岡上肌修復(fù)術(shù)中于腱骨表面添加TGF-β3，發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)早期纖維軟骨生長，增加新骨形成、Ⅰ型～Ⅲ型膠原比例以及膠原纖維規(guī)整性等方面，TGF-β3添加組均優(yōu)于對照組。另有研究表明，TGF-β1可誘導(dǎo)干細(xì)胞向韌帶細(xì)胞或組織分化，具有促進(jìn)術(shù)后腱-骨愈合的功能[14]。

但也有研究指出，TGF-β1并不能促進(jìn)腱骨結(jié)合部位形成4層正常生理結(jié)構(gòu)，只是促進(jìn)了纖維瘢痕組織的增生，當(dāng)TGF-β1受到抑制時，纖維化、脂肪浸潤和肌肉萎縮等不利情況將顯著減少[15]。有學(xué)者從纖維軟骨面積、膠原組織和骨形成等方面來衡量TGF-β3的無瘢痕愈合潛能，結(jié)果表明，磷酸鈣+TGF-β3組的愈合效果反而比磷酸鈣組更差，提示TGF-β3對腱骨愈合過程具有干擾作用[16]。

有關(guān)TGF-β在腱骨愈合中扮演的角色，不同實(shí)驗(yàn)得出完全不同的結(jié)論，其原因可能是實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图皩?shí)驗(yàn)過程不同，多種生長因子之間存在尚未明確、難以控制的相互作用和干擾，其機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

1.3.2胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）IGF與胰島素高度同源，其中IGF-1具有刺激肌腱細(xì)胞有絲分裂和基質(zhì)合成的作用，可調(diào)控細(xì)胞增殖和機(jī)體生長發(fā)育。有研究證實(shí)IGF-1可延長肌腱干細(xì)胞的多向分化時間，對其增殖和維持表型起到積極的促進(jìn)作用[17]；IGF-1和TGF-β1聯(lián)合使用還可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為腱細(xì)胞，經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用處理的韌帶結(jié)構(gòu)較單一應(yīng)用具有更強(qiáng)的最大拉伸負(fù)荷能力[18]。而一旦敲除IGF基因，受損的肌肉和肌腱就會呈現(xiàn)出不穩(wěn)定的愈合反應(yīng)[19]，這也反向證明IGF-1可促進(jìn)腱細(xì)胞的分化，并提高肌腱的韌性和強(qiáng)度。

1.3.3血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）VEGF能夠促進(jìn)損傷組織的血管新生，通過激活一氧化氮合酶增加毛細(xì)血管的通透性[20]。既往研究證明其在腱骨愈合過程中可促進(jìn)愈合組織的再血管化，提高愈合韌帶的強(qiáng)度，且不會增加黏連，但內(nèi)源性VEGF生成不足，

需要人工補(bǔ)充外源性VEGF以促進(jìn)腱骨愈合的血管化[21]。但也有研究得出相反的結(jié)論，認(rèn)為VEGF

可侵入內(nèi)皮細(xì)胞引起ECM蛋白水解，從而影響肌腱的愈合[22]；亦有研究表明，VEGF表達(dá)與血管密度增加、脂肪浸潤、肌肉萎縮呈正相關(guān)[23]。目前兩種不同的觀點(diǎn)均有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，同時還需明確VEGF與肌腱血管化之間的量效關(guān)系，以便更好地指導(dǎo)外源性VEGF的應(yīng)用。

1.3.4骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）BMP廣泛存在于骨基質(zhì)中，對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞起誘導(dǎo)促進(jìn)作用。BMP有20多種亞型，目前報道較多的

BMP-2、7、12、13、14均對腱骨愈合過程起促進(jìn)作用。其中BMP-2是誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的BMPs之一，可促進(jìn)干細(xì)胞成骨、成軟骨、成脂三向分化，促進(jìn)血管形成，同時也與肌腱病變中的軟骨組織變性、骨組織變性等有關(guān)。Schwarting等[24]的系列實(shí)驗(yàn)表明，BMP-2和BMP-7均可促進(jìn)多種目標(biāo)基因的表達(dá)，促使與腱骨愈合相關(guān)的堿性磷酸酶、骨鈣蛋白等多種指標(biāo)上調(diào)，促進(jìn)腱骨界面的組織分化，

從而加快腱骨愈合的進(jìn)程；Kabuto等[25]利用水凝明膠薄膜持續(xù)釋放BMP-7，使SD大鼠肩袖的腱骨界面在組織學(xué)及生物力學(xué)性能方面均得到增強(qiáng)。

BMP-14亦被稱為軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1）或生長分化因子5（growth differentiation factor 5，GDF-5），既可誘導(dǎo)骨與軟骨形成，又能誘導(dǎo)肌腱和韌帶形成，同時與細(xì)胞增殖及血管新生密切相關(guān)。BMP-12（又稱GDF-7）僅能誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱或韌帶樣組織分化，不能誘導(dǎo)骨及軟骨形成。運(yùn)用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12（rhBMP-12）修復(fù)綿羊肩袖損傷，可促進(jìn)腱骨結(jié)合處形成連續(xù)膠原纖維，使肌腱最大負(fù)荷強(qiáng)度顯著提高[26]。Jiang等[27]的研究結(jié)果則表明，與對照組及富血小板血漿組相比，局部注射BMP-13（又稱GDF-6）能促進(jìn)肌腱愈合，提高抗張力強(qiáng)度，有效降低再撕裂發(fā)生率。

1.3.5 PDGF PDGF是由血小板或平滑肌細(xì)胞分泌的堿性多肽因子，由A、B兩種亞基通過二硫鍵結(jié)合成 3種異構(gòu)體——PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB。其能促進(jìn)腱細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管新生及表面信號分子表達(dá)，加速肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生膠原。PDGF-BB的表達(dá)高峰通常出現(xiàn)在腱骨愈合炎癥期和修復(fù)期的過渡階段，Tokunaga等[28]的實(shí)驗(yàn)證明，PDGF-BB能使大鼠損傷肩袖重新恢復(fù)膠原纖維排列，力學(xué)性能大為提高，這與既往關(guān)于羊肩袖損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)論類似[29]。以上研究表明，PDGF在解剖形態(tài)和力學(xué)強(qiáng)度等方面均有助于腱-骨愈合。

亦有研究認(rèn)為PDGF對腱骨愈合并沒有確切的促進(jìn)和改善作用。Kovacevic等[30]發(fā)現(xiàn)，在大鼠肩袖愈合的早期階段，rhPDGF-BB可促進(jìn)黏連部位的細(xì)胞增殖和血管生成，但晚期對纖維軟骨形成或膠原纖維成熟沒有任何影響；Würger-Hauri等[31]將PDGF應(yīng)用于大鼠肩袖損傷修復(fù)，膠原纖維排列與對照組并無明顯差異；Uggen等[32]亦指出，采用PDGF涂層縫線修復(fù)羊?qū)录‰鞊p傷并未改善其力學(xué)強(qiáng)度?？梢?，對于PDGF的生物學(xué)作用還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)予以證明。

1.3.6 bFGF 又稱為FGF-2或FGF-β，由白細(xì)胞、肌腱細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等釋放產(chǎn)生，主要促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，在腱骨愈合過程中能刺激血管生成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖遷移，加速骨、軟骨和肌腱的修復(fù)。bFGF于肩袖損傷后5～9 d達(dá)到高峰，在整個修復(fù)過程中均表達(dá)為高度上調(diào)，有效促進(jìn)了新血管形成及成纖維細(xì)胞增殖[33]。Ide等[34]在大鼠肩袖損傷模型中局部給予bFGF后，明顯增強(qiáng)腱骨止點(diǎn)肌腱的成熟度和極限載荷強(qiáng)度。國內(nèi)外諸多研究均證實(shí)，bFGF可刺激腱周血管生成及膠原分泌，促進(jìn)肌腱愈合，增強(qiáng)肌腱強(qiáng)度，降低肌腱黏連可能[35-36]。

1.4 其他生物因子

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）在骨髓中合成，通過直接激活中性粒細(xì)胞影響炎癥過程，因此促進(jìn)G-CSF的連續(xù)釋放可提高肩袖修復(fù)的免疫組織學(xué)和生物力學(xué)性能[37]。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）參與介導(dǎo)TGF-β1信號通路，是纖維化的共因子[38]，能夠通過修改其他生長因子，促進(jìn)BMP-12在肩袖損傷修復(fù)中的致敏作用[39]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可抑制成骨細(xì)胞形成，提高破骨細(xì)胞活性，同時參與瘢痕形成過程，對腱骨愈合不利。Gulotta等[40]通過動物實(shí)驗(yàn)阻斷TNF-α，加速了大鼠的腱骨愈合過程。肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）則可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖分化，使腱骨愈合在組織學(xué)和力學(xué)兩個方面強(qiáng)度提高、速度加快[41-42]。

2 信號通路對腱骨愈合的調(diào)控作用

在腱骨愈合過程中，生物因子往往是通過信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用的。Wang等[43]在兔ACL重建模型中上調(diào)TGF-β的表達(dá)水平，進(jìn)而證實(shí)其具有促進(jìn)ACL愈合的作用，同時發(fā)現(xiàn)TGF-β/MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、c-jun and c-myc也隨之表達(dá)增加；隨后研究人員又通過TGF-β抑制實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了TGF-β/MAPK信號通路在腱骨愈合過程中的調(diào)節(jié)作用。江華基等[44]利用雄性SD大鼠構(gòu)建腱骨愈合模型，研究黃芩素對腱骨愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩素治療組腱骨愈合強(qiáng)度較對照組顯著升高，同時黃芩素可促進(jìn)WNT/β-catenin信號通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin、Runx2以及OCN蛋白的表達(dá)，因此認(rèn)為黃芩素通過激活WNT/β-catenin信號通路、促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化，加速了腱骨愈合的過程。張新濤等[45]在骨碎補(bǔ)總黃酮對大鼠腱骨愈合作用的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮的生物學(xué)作用是通過mTOR信號通路實(shí)現(xiàn)的，其下游標(biāo)記蛋白P-S6蛋白表達(dá)增加，P-4E/BP1蛋白表達(dá)降低，最終促進(jìn)了成骨相關(guān)蛋白Runx2以及OCN蛋白的表達(dá)。亦有研究發(fā)現(xiàn)COX-2/PGE2是腱骨連接中重要的力學(xué)信號通路，力學(xué)刺激可通過與PI3K/Akt的共同作用，對肌腱細(xì)胞凋亡和腱骨愈合過程進(jìn)行調(diào)控[46]。但目前信號通路的相關(guān)研究較少，關(guān)鍵信號通路的具體調(diào)節(jié)作用仍需進(jìn)一步明確。

3 腱骨愈合研究的潛在方向——非編碼RNA

隨著基因技術(shù)的發(fā)展，骨與軟骨的代謝機(jī)制研究已經(jīng)從蛋白、信號通路水平，逐步深入至分子生物水平。遺傳信息的傳遞可以概括為DNA→RNA→蛋白質(zhì)。其中RNA可以分為編碼RNA（也稱信使RNA，mRNA）和ncRNA兩大類。ncRNA包括長鏈ncRNA（lncRNA）和微小RNA(miRNA）等，因其未翻譯成蛋白質(zhì)，曾一度被視為垃圾RNA，但越來越多的證據(jù)表明，其活躍作用于細(xì)胞生物學(xué)的各個方面，與生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子以及炎癥、氧化應(yīng)激和代謝過程密切相關(guān)[47-48]。

腱骨愈合中的一系列病理生理過程，如局部炎癥反應(yīng)，血管新生，成纖維細(xì)胞增殖，骨、軟骨和肌腱韌帶組織壞死修復(fù)重生等，必然有ncRNA參與其中。Thankam等[49]通過炎癥與JAK2/STAT3信號通路研究miRNA表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)235個miRNAs表達(dá)改變。Ahn等[50]應(yīng)用mRNA微陣列分析方法，明確愈合與未愈合肩袖肌腱的遺傳差異，結(jié)果提示炎癥反應(yīng)基因的下調(diào)和細(xì)胞分化基因的上調(diào)與肩袖愈合有關(guān)。Chaudhury等[51]同樣采用微陣列技術(shù)，試圖通過分析研究不同類型肩袖撕裂的基因表達(dá)譜，進(jìn)一步了解病理改變與撕裂大小的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肩袖撕裂后可上調(diào)許多關(guān)鍵基因的表達(dá)，大、小肩袖撕裂組的基因表達(dá)譜與正常對照組差異顯著。

盡管外傷不受基因控制，但軟骨、肌腱以及韌帶的慢性勞損在一定程度上受基因控制，且急慢性損傷的修復(fù)均受基因調(diào)控。目前關(guān)于lncRNA在腱骨愈合中作用的研究相對較少，現(xiàn)有證據(jù)表明，lncRNA可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來調(diào)控下游基因的表達(dá)[51]，因此這些基因產(chǎn)物未來可能會成為治療失敗的生物標(biāo)志物或改善肌腱愈合的治療靶點(diǎn)，而針對lncRNA及其相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步研究，很有可能給腱骨愈合難題帶來新的希望。

4 問題及展望

肌腱（韌帶）與骨之間的愈合過程受多種因子及信號通路的調(diào)控，其機(jī)制目前尚未明確。多數(shù)生長因子在腱骨愈合過程中具有加速肌腱愈合、改善肌腱力學(xué)特性、減少術(shù)后肌腱黏連的重要作用。生長因子過多或缺乏都會產(chǎn)生不利影響；病變進(jìn)展的不同時期需要的生長因子不同，相同因子在不同病變進(jìn)展時期，所產(chǎn)生的作用也許完全相反。目前的研究報道大多數(shù)為一種細(xì)胞因子單獨(dú)應(yīng)用或兩種聯(lián)合使用，但實(shí)際的生理過程是受多種因子共同作用的影響。今后的研究方向之一是聯(lián)合應(yīng)用多種生物因子，以發(fā)揮最大優(yōu)勢。上游ncRNA對各種細(xì)胞因子的調(diào)控，以及生長因子對下游信號通路的具體調(diào)節(jié)作用亦需要進(jìn)一步明確。我們相信，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，lncRNA從基因?qū)用鎸Ω鞣N細(xì)胞因子的調(diào)控，將為腱骨愈合過程中細(xì)胞因子的研究及其應(yīng)用打開一扇新的窗戶。