趙航衛(wèi)，張遠耕，韓 雨，李炳聰，劉志強

(山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006)

硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是一種無色、易燃、帶有臭雞蛋氣味的酸性氣體，濃度較高時會對生物體產(chǎn)生毒性。1989年，科學家檢測到人腦中的內(nèi)源H2S含量為0.7 μg/g，大鼠腦中達1.6 μg/g，推斷H2S可能存在一定的生理作用[1]。H2S是具有親水性和親脂性的兩性分子，能夠自由穿越生物膜，現(xiàn)已成為第3種氣體信號分子，其在生物體內(nèi)的生理功能備受關(guān)注[2-3]。已有研究表明，H2S參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的多種過程，如促進種子萌發(fā)和根形態(tài)建成[4-8]，增加葉綠素含量[7]和光合作用[9]，延緩花的衰老[10]等。此外，H2S在植物響應各種非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[2]。

植物內(nèi)源H2S可以是以半胱氨酸(Cys)為底物，由半胱氨酸脫巰基酶(Cysteine desulfhydrases，CDes)催化Cys降解產(chǎn)生[11]；也可以通過葉片吸收大氣中的H2S獲得；或者在亞硫酸鹽還原酶的作用下，將SO32-直接還原生成H2S。硫酸鹽、亞硫酸鹽、Cys、以羰基相連的含硫化合物和SO2均可作為H2S合成的底物[12]。目前，植物中主要研究的CDes包括以L-Cys為底物的LCD和DES及以D-Cys為底物的DCD[13]，其中，LCD定位于細胞核，DCD定位于線粒體，DES定位于細胞質(zhì)[14]；鑒于L-Cys是植物體內(nèi)Cys的主要存在形式，推測以L-Cys為底物的CDes是內(nèi)源H2S生成的主要貢獻者[15-16]。

紫外(UV)輻射的增強對地球生命系統(tǒng)有著多方面的影響，生命系統(tǒng)特別是植物系統(tǒng)，對較強的UV輻射有明顯的響應[17]。較強的UV輻射會使植物的光合能力下降，農(nóng)作物的植株變矮、開花延遲、產(chǎn)量降低，種子萌發(fā)受抑制[18-20]，葉綠素和光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)受損[17,21-22]，植株器官的碳庫分配平衡被改變[20,23-24]，蛋白質(zhì)含量下降等。UV輻射會引起DNA損傷和基因突變，植物受到較強UV輻射會提高相關(guān)抗性基因的表達[25]。隨著臭氧層的日益破壞，環(huán)境中的紫外輻射不斷增加，UV-C對植物的傷害逐漸引起人們的關(guān)注。

擬南芥經(jīng)紫外脅迫及生理濃度H2S處理后，通過檢測植株的丙二醛含量、葉片的葉綠素含量、光合特性相關(guān)指標以及谷胱甘肽合成基因和DNA損傷修復相關(guān)基因表達變化，研究紫外脅迫下H2S對擬南芥的損傷修復作用，旨在為H2S及其制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)及處理

試驗材料為哥倫比亞野生型擬南芥Col-0(WT)以及H2S產(chǎn)生酶LCD基因(At3G62130)突變體lcd和DES基因(At5G28030)突變體des。野生型和突變體材料處理方式如表1所示。UV波長254 nm，強度60 μW/cm2。

表1 擬南芥紫外線與H2S處理Tab.1 Treatment with UV and H2S of Arabidopsis

1.2 生理指標的測定

1.2.1 丙二醛(MDA)含量的測定 稱取鮮質(zhì)量為0.75 g的樣品，加入0.75 mL 5%的TCA溶液研磨，勻漿后8 000 r/min離心10 min。取0.5 mL上清，加0.5 mL 0.67%的TBA溶液，在100 ℃水浴30 min，冷卻后10 000 r/min離心5 min。分別測定上清在450，532，600 nm處的吸光度值A(chǔ)[26]。

MDA含量(mmol/g)=(6.45×(A532-A600)- 0.56×A450) ×Vt/(Vs×W)

①

式中，Vt為提取液總體積(mL)，Vs為測定用提取液體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.2 葉綠素含量的測定 取新鮮植物葉片，擦干凈表面，剪去葉中脈，只取葉片。稱取一定質(zhì)量的葉片，記為W，加少量的石英砂及1 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，8 000 r/min離心1 min。取上清稀釋10～20倍，分別測定665，649 nm處的吸光度值A(chǔ)[27]。

葉綠素a濃度(Ca)=13.95×A665- 6.88×A649

②

葉綠素b濃度(Cb)=24.96×A649- 7.32×A665

③

葉綠素a含量=Ca×V/(1 000×W)

④

葉綠素b含量=Cb×V/(1 000×W)

⑤

總?cè)~綠素含量=Ca×V/(1 000×W)+Cb×V/(1 000×W)

⑥

式中，V為提取液總體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 光合特性指標的測定 使用CB-1102便攜式光合蒸騰儀(北京雅欣理儀科技有限公司)檢測凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間二氧化碳濃度(Ci)(測定時要求光源充足且穩(wěn)定，空氣中CO2含量穩(wěn)定[28])。

1.3 基因表達檢測

1.3.1 TRIzol法提取擬南芥RNA與反轉(zhuǎn)錄 取0.05 g的樣品于研缽中，加入1 mL TRIzol溶液，研磨成勻漿，在室溫下靜置5 min，離心取上清；加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s并靜置2 min。在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清；加入0.4 mL異丙醇并混勻，-20 ℃靜置10 min。在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，去乙醇并晾干，加入25 μL DEPC H2O溶解[29]。以RNA為模板，以O(shè)ligod(T)為引物，建立反轉(zhuǎn)錄體系，反應程序為：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min[30]。

1.3.2 RT-qPCR 用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行Quantitative real-time PCR檢測。數(shù)據(jù)采集與分析使用IQ5軟件，以UBQ(At5G20620)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量[30-31]?；虮磉_檢測引物如表2所示。

表2 RT-qPCR引物Tab.2 The list of RT-qPCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外脅迫下H2S對擬南芥MDA含量的影響

紫外線照射會對植物造成氧化損傷，細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，且MDA含量(以鮮質(zhì)量計)與膜脂的過氧化程度呈正相關(guān)[32-33]，其可作為衡量氧化損傷的指標。本試驗測量MDA含量來探究紫外線對擬南芥的損傷以及H2S的修復作用。UV處理20 min擬南芥體內(nèi)的MDA含量升高，自然光培養(yǎng)24 h后MDA含量下降，但黑暗條件培養(yǎng)的植株MDA含量沒有顯著下降；生理濃度外源H2S處理24 h可降低MDA含量，并且在光照條件下作用更加明顯。LCD+UV+L處理和LCD+UV+D處理的MDA含量間無明顯差異，但二者較LCD+UV都有所降低；DES+UV+L處理和DES+UV+D處理的MDA含量較DES+UV處理降低，并且光照條件下比黑暗條件下降低；DES+UV處理的MDA含量較WT+UV處理增加，LCD+UV處理較WT+UV處理減少(圖1)。

2.2 紫外脅迫下H2S對擬南芥葉片葉綠素含量的影響

葉綠素是吸收可見光譜中特定波長光的有色分子，主要吸收藍光和紅光，葉綠素分子由吸收光的卟啉環(huán)和使葉綠素固定在類囊體膜上的疏水性葉綠醇組成。葉綠素易被氧化或還原，高強度(≥180 μW/cm2)的紫外照射會破壞葉綠素，而低強度的紫外可提高葉綠素含量[19]，通過測量葉綠素含量可探究H2S在擬南芥響應紫外線中的作用。

CK. 未處理的WT；UV. 紫外處理；L. 自然光；D. 黑暗處理；LCD和DES分別表示對應基因的突變體；不同小寫字母表示各處理組間差異顯著性(P<0.05)。圖2-3同。

CK.Untreated WT; UV.Ultraviolet treatment; L.Natural light; D.Dark; LCD and DES.Respectively the corresponding mutant gene;Lowercase letters expressing the significant difference between the treatment groups(P<0.05). The same as Fig.2-3.

圖1紫外脅迫下H2S在光照和黑暗下對擬南芥體內(nèi)MDA含量的影響
Fig.1TheeffectsofH2SonMDAcontentsinArabidopsisunderlightordarkafterUVstress

由圖2-A可知，與CK相比，UV處理后的植株葉綠素a含量都升高，其大小依次為：WT+UV+D+H2S >WT+UV+L+H2S=WT+UV+L=WT+UV+D>WT+UV；LCD+UV+D>LCD+UV+L = LCD+UV；DES+UV+L > DES+UV+D>DES+UV。

由圖2-B可知，不同處理葉綠素b的含量WT+UV+D=WT+UV+D+H2S>WT+UV+L+H2S=WT+UV+L>WT+UV=CK；LCD+UV+D>LCD+UV>LCD+UV+L；DES+UV+L>DES+UV+D>DES+UV。

由圖2-C可知，不同處理總?cè)~綠素的含量：WT+UV、WT+UV+L+H2S、WT+UV+D+H2S、WT+UV+L高于CK，其中，WT+UV+D+H2S最高；LCD+UV+D>LCD+UV>LCD+UV+L；DES+UV+L和DES+UV+D較DES+UV增加。

圖2 紫外脅迫下H2S在自然光和黑暗下對擬南芥葉片葉綠素的含量的影響Fig.2 The effictes of H2S on chlorophyll content of Arabidopsis leaves under light or dark after UV stress

2.3 紫外脅迫下H2S對擬南芥光合特性的影響

紫外照射可以影響植物葉片中的葉綠素含量，破壞植物葉片的柵欄組織、海綿組織及氣孔的細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)，破壞細胞的氧化還原和碳—氧平衡，進而影響植物的光合作用，所以，通過對光合作用特性參數(shù)的測定來探究紫外脅迫下H2S對擬南芥光合作用的影響。

不同處理凈光合速率(Pn)的大小順序為，CK=WT+UV=WT+UV+L=WT+UV+L+H2S>WT+UV+D+H2S = WT+UV+D；LCD+UV=LCD+UV+L>LCD+UV+D；DES+UV=DES+UV+L>DES+UV+D，說明擬南芥凈光合速率在黑暗條件下比光照下低(圖3-A)。

不同處理蒸騰速率(Tr)的大小順序為，CK=WT+UV+L+H2S>WT+UV+D+H2S =WT+UV+L>WT+UV = WT+UV+D；LCD+UV=LCD+UV+L>LCD+UV+D；DES+UV=DES+UV+L=DES+UV+D，表明UV能明顯降低擬南芥的蒸騰速率，光照和H2S均能緩解UV引起的蒸騰速率下降(圖3-B)。

UV處理會減小擬南芥野生型和突變體材料的氣孔導度(Gs)，光照能增加擬南芥的氣孔導度，光照和黑暗處理對外源和內(nèi)源H2S均無明顯影響(圖3-C)。對于胞間CO2濃度(Ci)，UV處理后擬南芥胞間CO2濃度升高，且突變體高于野生型(圖3-D)。

2.4 紫外脅迫下H2S對GSH合成和DNA修復基因表達量的影響

紫外照射會導致植物DNA鏈上2個相鄰嘧啶核苷酸的共價聯(lián)結(jié)，形成嘧啶二聚體，直接損害DNA；還會誘導植物細胞產(chǎn)生活性氧自由基，間接損害DNA。谷胱甘肽(GSH)是清除活性氧的重要物質(zhì)。GSH1和GSH2基因編碼合成谷胱甘肽，PARP1和PARP2編碼DNA損傷修復酶基因。本試驗通過檢測上述基因mRNA水平的變化來探究H2S對紫外脅迫的緩解作用。

圖3 在紫外脅迫下H2S對擬南芥光合特性的影響Fig.3 The effects of H2S on the photosynthetic characteristics of Arabidopsis after UV stress

擬南芥于UV處理后培養(yǎng)24 h，GSH1轉(zhuǎn)錄水平在光照或黑暗培養(yǎng)條件下均升高，與H2S處理無關(guān)；GSH2轉(zhuǎn)錄水平在黑暗條件下的升高與H2S處理無關(guān)，但是光照條件下H2S處理可誘導GSH2轉(zhuǎn)錄升高；PARP1只在H2S處理的黑暗培養(yǎng)下表達升高；而PARP2在黑暗培養(yǎng)下表達升高，但與H2S處理無關(guān)(圖4)。

圖4 紫外脅迫下H2S對相關(guān)基因表達量的影響Fig.4 The effect of H2S on related gene expression after UV stress

2.5 H2S和UV對植物的生理影響的可能機制

根據(jù)其他相關(guān)研究及本試驗的結(jié)果，獲得H2S和UV對植物的生理影響模式圖(圖5)，圖中實線表示紫外線的作用，虛線表示H2S的作用。

“→”和“┬”分別表示促進和抑制。“→” and “┬”represent promotion and inhibition respectively.

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，60 μW/cm2的紫外(波長254 nm)照射20 min可增加擬南芥體內(nèi)MDA濃度和葉綠素a的含量，對葉綠素b含量無明顯影響；對凈光合速率(Pn)無明顯影響，會降低擬南芥的蒸騰速率(Tr)和氣孔導度(Gs)，提高擬南芥的胞間CO2濃度(Ci)；降低GSH2基因表達。H2S可以降低紫外引起的MDA升高；在黑暗培養(yǎng)下增加葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量；緩解紫外照射引起的蒸騰速率(Tr)下降，不影響凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)；促進GSH2和PARP1合成基因的表達量響應紫外照射。

紫外照射會增加植物體內(nèi)MDA濃度，紫外照射后擬南芥光照或黑暗處理24 h，MDA濃度均下降，即植物自身可以修復紫外線對其的氧化損傷；H2S處理可進一步降低MDA濃度；試驗所用lcd是H2S產(chǎn)生酶編碼基因LCD表達下調(diào)的突變體，des是H2S產(chǎn)生酶編碼基因DES缺失突變體[11]。des突變株經(jīng)紫外照射后MDA含量均大于相同條件處理后的野生型和lcd，表明內(nèi)源H2S對紫外氧化損傷有明顯的緩解作用。

植物可以根據(jù)光照強度的改變來調(diào)整自身的基因選擇性表達，進而改變植株內(nèi)的蛋白質(zhì)含量來適應光強度的改變[34-37]。小于30 min的UV-B輻射(55 μW/cm2)會提高擬南芥葉片的葉綠素含量[19]，光通量密度在3 975～5 300 μW/cm2的自然光也能夠增加葉綠素含量[35]；用30 W的紫外燈(UV-C)處理早熟禾，小于6 h的處理可使葉綠素含量上升[38]；本試驗表明，適度的紫外照射能夠增加葉綠素a和總?cè)~綠素含量，黑暗下H2S可進一步提高葉綠素a和總?cè)~綠素含量[39]，對葉綠素b含量無顯著影響。

H2S可以顯著促進4 ℃低溫處理的白菜幼苗凈光合速率(Pn)[40]，而本試驗中，各處理后的Pn表現(xiàn)為：WT+UV+D+H2S=WT+UV+D>LCD+UV+D>DES+UV+D，表明內(nèi)源H2S對UV引起的Pn下降有緩解作用，但外源H2S對Pn無明顯影響。

本試驗中，蒸騰速率(Tr)的大小順序為：WT+UV+L+H2S>WT+UV+L=LCD+UV+L>DES+UV+L，說明若要緩解UV引起的擬南芥Tr的減少，需要有H2S的存在，H2S在此方面可能發(fā)揮著類似開關(guān)或門控的作用。

有研究表明，H2S處理誘導植物氣孔孔徑減小[41-43]，本試驗通過光合蒸騰儀檢測得出，UV處理誘導擬南芥的氣孔導度(Gs)下降，后續(xù)的H2S處理對Gs無明顯影響，由于光合測定儀是通過采集CO2濃度、濕度、溫度和光合有效輻射等數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)處理反應Gs，因此，本試驗的結(jié)果與H2S促進氣孔關(guān)閉的試驗結(jié)果不一致。

甘草苗經(jīng)0，10.2，15.8，21.2 μW/cm2輻射強度的UV-B處理75 d，其胞間CO2濃度(Ci)會有小幅增加[44]，本試驗UV-C處理20 min后擬南芥野生型和突變體的Ci都增加，H2S無明顯影響。

本研究結(jié)果表明，當植物受到脅迫后，通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達來響應和緩解脅迫，做出適應性改變。H2S對擬南芥AtGSH1和AtPARP2基因的轉(zhuǎn)錄無明顯影響，誘導光照條件下AtGSH2轉(zhuǎn)錄升高；黑暗條件下AtPARP1升高，表明H2S對不同基因表達的調(diào)控需要不同的條件，即H2S基因表達調(diào)控的生理功能需要其他因素的協(xié)同作用，其作用機制還需要進一步的試驗證據(jù)。

研究UV-B對擬南芥的損傷和H2S對擬南芥作用的報道很多，但是研究UV-C及UV-C和H2S對植物共同作用的報道卻較少。本試驗對H2S在擬南芥響應UV-C中的作用進行了初步探究，其結(jié)果可為H2S及其制劑在農(nóng)業(yè)、園藝、林業(yè)等行業(yè)的使用提供一定的科學依據(jù)。

致謝：感謝山西大學生命科學學院裴雁曦老師及其課題組師兄師姐在試驗及手稿撰寫中的幫助。

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