鄭鳳屏，戴 勇

作者單位:518020深圳，深圳市人民醫(yī)院暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科

眾所周知，真核基因經(jīng)剪接后會(huì)產(chǎn)生成熟信使RNA(messenger RNA，mRNA)和多種mRNA亞型［1］，而環(huán)狀 RNA(circular RNA，circRNA) 是非規(guī)范選擇性剪接所產(chǎn)生的，將剪接供體連接到上游剪接受體而形成的無(wú)5'至3'極性、5'帽化和3'聚腺苷酸化的共價(jià)閉合環(huán)［2-3］。共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)使Circ-RNA具有RNase R抗性，且半衰期超過(guò)48 h。根據(jù)circRNA所包含的序列，circRNA可以分為3種，即外顯子circRNA、內(nèi)含子cricRNA和含有外顯子和內(nèi)含子序列的circRNA。最近的研究表明，在人和果蠅中，數(shù)百個(gè)circRNA比它們相應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)水平更高［4］。上述發(fā)現(xiàn)沖擊了長(zhǎng)期以來(lái)的想法，即circRNA是拼接錯(cuò)誤的副產(chǎn)物［5-8］。到目前為止，盡管大多數(shù)circRNA的作用是未知的，但有報(bào)道顯示circRNA具有miRNA海綿作用和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能［9-10］，由于miRNA在自身免疫性疾病中的重要性以及circRNA可作為miRNA海綿的作用，推測(cè)在circRNA和自身免疫性疾病之間可能存在特定的聯(lián)系，circRNA可能是未來(lái)自身免疫性疾病的治療靶點(diǎn)。本文對(duì)circRNA的識(shí)別、功能及其與人類疾病的關(guān)系進(jìn)行綜述，探索circRNA在自身免疫性疾病的潛在作用。

1 CircRNA的識(shí)別

隨著生化富集策略、計(jì)算方法和深度測(cè)序的出現(xiàn)，大量的circRNA在古生菌、果蠅和人類中被發(fā)現(xiàn)［11-12］。例如在用核糖體RNA耗竭和RNase R消化處理的人成纖維細(xì)胞系中，通過(guò)MapSplice［13］的作圖鑒定了大約25 000個(gè)來(lái)源于約15%轉(zhuǎn)錄基因的circRNA。然而，以下幾個(gè)問(wèn)題對(duì)circRNA的研究帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，如TopHat融合、MapSplice、find_circ、segemehl和CIRI這5種方法對(duì)circRNA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)circRNA表現(xiàn)出不同的靈敏度和精度，不同的RNA文庫(kù)處理和嚴(yán)格的參數(shù)水平發(fā)現(xiàn)circRNA的全基因組鑒定也可能存在偏倚。因此需要尋找適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)鑒別具有轉(zhuǎn)拼、遺傳重排、逆轉(zhuǎn)錄酶模板轉(zhuǎn)換和串聯(lián)重復(fù)的circRNA［14］。

2 CircRNA作為miRNA的海綿

對(duì)于circRNA的功能，研究最為深入且最為明確研究的是小腦變性相關(guān)蛋白酶1(cerebellar degeneration-related protease 1，CDR1as)(又稱ciRS-7)可作為miR-7海綿的作用。人類CDR1擁有74個(gè)miR-7匹配位點(diǎn)，并密切結(jié)合Argonaute(Argonaute，AGO)蛋白家族，即一種miRNA效應(yīng)蛋白［15］。MiR-671以AGO2依賴性方式指導(dǎo)CDR1as的切割［16］。小腦變性相關(guān)蛋白1(cerebellar degeneration-related protine 1，CDR1)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在腦組織中與miR-7呈高度共表達(dá)，且在腦組織中也觀察到了由miR-7、AGO2和CDR1as組成的三元復(fù)合物，這些結(jié)果提示CDR1as具有海綿功能。CDR1能有效減少miR-7引起的敲除CDR1as基因的可能性，HEK293細(xì)胞中敲除CDR1as基因可抑制miR-7功能。此外，在Hela-CDR1as細(xì)胞中miR-671的高表達(dá)也可拮抗CDR1as對(duì)miR-7靶基因的作用。將CDR1as導(dǎo)入到斑馬魚(yú)胚胎中可逆轉(zhuǎn)由miR-7敲除引起的中腦體積的減小，且miR-7前體也可部分地挽救中腦體積的縮小。另一個(gè)具有miRNA海綿作用的circRNA是環(huán)狀Sry［9］。目前在環(huán)狀Sry中已識(shí)別出了16個(gè)miR-138靶位點(diǎn)，在環(huán)狀Sry存在的情況下，miR-138的敲除效率顯著降低。環(huán)狀Sry的海綿效應(yīng)不如CDR1as明顯，其原因可能是環(huán)狀Sry含量較少以及miR-138靶位點(diǎn)較少。值得注意的是，與人類同源性很高的小鼠Sry僅有一個(gè)miR-138靶位點(diǎn)。鋅指蛋白91(zinc finger protein 91，ZNF91)產(chǎn)生的circRNA有24個(gè)miR-23位點(diǎn)和39個(gè)miR-296位點(diǎn)，說(shuō)明circRNA具有螯合這些miRNA的作用［17］，此外還發(fā)現(xiàn)circRNA中miRNA靶位點(diǎn)的SNP降低［18］，這些研究均說(shuō)明circRNA具有miRNA海綿作用。目前已證實(shí)miRNA與多種疾病相關(guān)，因此推測(cè)作為miRNA海綿的circRNA與相關(guān)疾病可能也有關(guān)聯(lián)。

3 circRNA與人類疾病

3.1 circRNA與癌癥

相關(guān)的研究已逐漸揭示出circRNA與癌癥之間的關(guān)系。與正常結(jié)腸樣本相比，結(jié)腸腫瘤組織中環(huán)狀與線性RNA的總豐度和比例降低，并與增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān)［19］。食管鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸直腸癌中的Cir-ITCH表達(dá)低于腫瘤周?chē)M織。Cir-ITCH可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin途徑從而增加ITCH的表達(dá)，Cir-ITCH在兩種癌癥中的畸變可通過(guò)有缺陷的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)這些病癥的發(fā)展［16，20］?？紤]到circRNA的穩(wěn)定性，目前的研究主要集中于其是否具有作為腫瘤診斷和病理特征的生物標(biāo)志物的潛力方面。例如，研究表明胃癌組織中Has_circ_002059的表達(dá)明顯少于非腫瘤組織，而has_circ_002059的低表達(dá)與腫瘤快速遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和腫瘤-轉(zhuǎn)移瘤的階段明顯相關(guān)［21］。Has_circ_0001649在肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)組織中的表達(dá)量明顯低于相鄰肝組織，其表達(dá)量與HCC腫瘤大小和腫瘤栓塞的發(fā)生有關(guān)。此外，肝癌細(xì)胞系中的has_circ_0001649減少可增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMP)活性，從而利于HCC轉(zhuǎn)移［22］。目前發(fā)現(xiàn)circRNA在胰腺導(dǎo)管腺癌 (pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中的表達(dá)也出現(xiàn)異常［23］。改變內(nèi)含子-外顯子序列方法構(gòu)建的針對(duì)miR-21和miR-221的circRNA海綿在抑制細(xì)胞增殖和遷移及促進(jìn)人黑素瘤細(xì)胞系的凋亡方面較線性miRNA海綿作用更強(qiáng)，提示circRNA治療癌癥是可行的［24］。

3.2 CircRNA與其他疾病

除了癌性疾病之外，circRNA還參與其他疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。Circ-ANRIL表達(dá)、編碼LNK/ARF轉(zhuǎn)錄水平和rs1075278與動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病 (atherosclerotic vascular disease，ASVD)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNP)的基因型有關(guān)，而鄰近外顯子15的一對(duì)SNP可影響ANRIL基因的剪接［25］，9p21.3中的常見(jiàn)SNP通過(guò)影響ANRIL基因轉(zhuǎn)錄和/或剪接來(lái)調(diào)節(jié)LNK/ARF基因的表達(dá)。這項(xiàng)研究首次證實(shí)了circRNA與人類ASVD之間的關(guān)聯(lián)。circRNA在腦組織中含量豐富，同時(shí)也充當(dāng)著miR-7海綿的角色，因此阿爾茨海默病 (Alzheimer disease，AD)患者海馬CA1樣品中的CD1Ras明顯低于對(duì)照者海馬CA1樣品［26］。CD1Ras的減少可能導(dǎo)致miR-7海綿功能的缺陷，可能是基因在散發(fā)性AD腦中下調(diào)的主要原因。同樣，CD1Ras/miR-7途徑在胰島素轉(zhuǎn)錄和分泌中的作用也受到關(guān)注。MiR-7過(guò)表達(dá)可使胰島素mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，并使小鼠胰島細(xì)胞中分泌量降低，而CD1Ras的過(guò)表達(dá)能夠顯著上調(diào)胰島素mRNA表達(dá)并且胰島細(xì)胞中的分泌顆粒增加。CD1Ras改善胰島β細(xì)胞功能的作用是通過(guò)Myrip和Pax6這兩個(gè) miR-7靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)［27］，此外CircRNA 100783與CD28丟失的CD8+T細(xì)胞衰老相關(guān)［28］。

3.3 CircRNA與自身免疫性疾病

就自身免疫性疾病而言，20世紀(jì)80年代就認(rèn)為CDR1是導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)疾病的重要基因，它不僅具有抑制免疫力和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，還可以產(chǎn)生抗DNA抗體，從而誘發(fā)自身免疫性疾?。?9-30］?，F(xiàn)已證實(shí) CDR1基因表達(dá)一種 CDR1as的環(huán)狀天然反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是人類的一種circRNA［31］。由此可見(jiàn)，circRNA參與自身免疫性疾病的發(fā)病和進(jìn)展。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)是一種原發(fā)性自身免疫性疾病，女性發(fā)病多見(jiàn)，男女患病比例為1:9［32］。SLE的特征是慢性炎癥過(guò)程，可產(chǎn)生針對(duì)各種自身抗原的自身抗體［33］，其嚴(yán)重程度可從輕度皮膚病變到主要器官(腎，肺，心臟和大腦)的嚴(yán)重?fù)p傷［34］。SLE的病因仍不清楚，但已發(fā)現(xiàn)同卵雙胞胎SLE患者的病變程度和表現(xiàn)具有高度的一致性，證實(shí)該病有一定的遺傳基礎(chǔ)［35］。除此之外，多個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)50多個(gè)基因與SLE發(fā)病有關(guān)，但在患遺傳性SLE的單卵雙胞胎中這些風(fēng)險(xiǎn)基因的突變位點(diǎn)不一致，因此給判斷環(huán)境或表觀遺傳因子在SLE中的作用帶來(lái)了一定困難［36］。目前公認(rèn)的與SLE發(fā)病相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制是miRNA基因調(diào)節(jié)，miRNA內(nèi)源非編碼RNA，長(zhǎng)度為19～25 bp，通過(guò)引導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯和轉(zhuǎn)錄過(guò)程調(diào)節(jié)基因表達(dá)［37］。例如，較低水平的miR-146a有助于SLE患者中I型IFN途徑的異?；罨?，miR-30升高則使SLE患者B淋巴細(xì)胞過(guò)度活化［38-39］。盡管在過(guò)去幾十年中對(duì)SLE發(fā)病機(jī)制的研究取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但該病的診斷和治療仍未達(dá)到預(yù)期效果。

目前我們對(duì)circRNA的認(rèn)知仍相當(dāng)有限，但已有關(guān)于miRNA在SLE的作用的研究報(bào)道，我們可對(duì)circRNA和SLE之間關(guān)系進(jìn)行分析。研究顯示，人類基因組編碼的約800個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)的基因約占三分之一，特別是人類的免疫基因［40-41］。在過(guò)去幾年中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些與T和B淋巴細(xì)胞活化［42-43］、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生［44-46］、DNA 甲基化［47］和特異性病理特征［48-49］相關(guān)的miRNA，認(rèn)為這些差異表達(dá)的miRNA是SLE診斷的生物標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)。除了這些有關(guān)的miRNA在SLE患者中的上述作用外，大多數(shù)功能重要的miRNA在免疫應(yīng)答過(guò)程中的表達(dá)并未改變［41］。例如，SLE患者的研究樣品中未發(fā)現(xiàn)miR-326的表達(dá)改變，而與 Th17細(xì)胞分化相關(guān)的miRNA則發(fā)生了改變［50］。circRNA表達(dá)的改變可影響其與miRNA的螯合能力，引起該miRNA基因靶標(biāo)的改變。然而，在這個(gè)過(guò)程中，miRNA的表達(dá)水平可以不受影響。以miR-7為例，在CD1Ras過(guò)表達(dá)后，內(nèi)源性miR-7的水平不受影響［49］。如果其他circRNA作用方式與CD1Ras相同，我們可以提出假設(shè)，即circRNA變化可影響免疫應(yīng)答中一些正常表達(dá)的miRNA的功能，從而促進(jìn)SLE的發(fā)病和進(jìn)展。因此，關(guān)于miR-236與SLE的關(guān)系，有可能是某些circRNA的減少導(dǎo)致其屏蔽而不是降低了其表達(dá)，從而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)SLE的發(fā)展。當(dāng)然我們不能排除circRNA可以下調(diào)某些miRNA的表達(dá)，如lncRNA［51-52］。因此，miRNA的海綿circRNA可以通過(guò)改變或者不改變miRNA靶點(diǎn)的表達(dá)而影響SLE的進(jìn)程。

一些研究者在初步的研究工作中發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，SLE患者單個(gè)核細(xì)胞中顯著差異表達(dá)的環(huán)狀RNA有745種，其中182種表達(dá)上調(diào)，563種表達(dá)下調(diào)。實(shí)時(shí)定量PC法驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)6種上調(diào)環(huán)狀RNA，即 has_ circ_ 0007337、has_ circ_0007891、has_ circ_ 0001349、 has_ circ_0046555、has_ circ_ 0046215、 has_ circ_0056536;也發(fā)現(xiàn)了5種下調(diào) circRNA，即 has_circ_0005480、has_circ_0001854、has_circ_0070113、has_ circ_ 0044468、 has_ circ_0006608，生物信息學(xué)提示環(huán)狀RNA可以通過(guò)與miRNA發(fā)生相互作用而調(diào)控SLE的發(fā)生及發(fā)展，由此可以得出，SLE患者單個(gè)核細(xì)胞環(huán)狀RNA的表達(dá)具有疾病特異性，顯著差異的和特異性表達(dá)的環(huán)狀RNA可作為SLE診斷的特異標(biāo)志物。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一種以外周滑膜關(guān)節(jié)慢性炎性病變、關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)進(jìn)行性不可逆性破壞為特征的全身性自身免疫性疾病。作者發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，RA患者外周血中顯著差異性表達(dá)的環(huán)狀RNA有584種，其中255種表達(dá)上調(diào)，329種表達(dá)下調(diào)［53］。此外，Ouyang等［54］分析了RA患者和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中circRNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與RA密切相關(guān)的環(huán)狀 RNA，分別是 circRNA092516、circRNA003524、 circRNA103047、 circRNA104871和circRNA101873，采用ROC曲線分析法進(jìn)行判斷，發(fā)現(xiàn)其中與RA高度相關(guān)且可作為RA診斷標(biāo)志物的是circRNA104781。因此認(rèn)為circRNA參與RA的發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程，可能是RA的診斷和治療靶點(diǎn)。上述研究表明，circRNA與自身免疫性疾病的關(guān)系值得關(guān)注，其內(nèi)在聯(lián)系需要進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。

4 展望

雖然從各種RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定circRNA面臨著挑戰(zhàn)，但大量的circRNA的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了對(duì)基因調(diào)控復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)。一般來(lái)說(shuō)，circRNA的形成取決于剪接機(jī)制，包括互補(bǔ)重復(fù)序列和內(nèi)含子在環(huán)化外顯子和環(huán)化外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子的長(zhǎng)度。到目前為止，盡管只有兩個(gè)circRNA被證實(shí)為真正的miRNA海綿，但推測(cè)更多circRNA的miRNA海綿作用將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，未來(lái)的研究熱點(diǎn)可能會(huì)更多地關(guān)注于circRNA的作用。circRNA中的miRNA結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于miRNA的螯合至關(guān)重要，可以通過(guò)修飾這些結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮circRNA對(duì)miRNA活性的抑制作用。比如，能夠利用其miRNA海綿的作用，以防止過(guò)表達(dá)的miRNA在自身免疫性疾病中造成的危害。這種治療可基于以下前提:miRNA是自身免疫性疾病的主要致病因素，而circRNA可以螯合miRNA。期望未來(lái)circRNA的更多功能被發(fā)現(xiàn)，利用其作為自身免疫性疾病的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的特性，為自身免疫性疾病及其他疾病的徹底治愈奠定基礎(chǔ)。