蘇玉，趙潔，吳俊

(1.北京積水潭醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100035；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

骨折后深靜脈血栓形成患者的內(nèi)源性抗凝能力評(píng)價(jià)

蘇玉1，趙潔2，吳俊1

(1.北京積水潭醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100035；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044)

目的觀察骨折后下肢深靜脈血栓形成(DVT)患者的內(nèi)源性抗凝能力及其在DVT形成中的作用。方法選擇北京積水潭醫(yī)院骨折后下肢DVT患者95例作為DVT組，體檢健康者100例作為健康人對(duì)照組。收集患者術(shù)后第3天枸櫞酸鈉抗凝血漿標(biāo)本，檢測(cè)纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)和D-二聚體(DD)；用Thrombopath發(fā)色底物顯色法檢測(cè)內(nèi)源性抗凝能力指標(biāo)Protac凝血抑制率(PICI)；收集患者血清檢測(cè)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。結(jié)果DVT組FDP、DD均高于健康人對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，DVT組PICI(%)低于健康人對(duì)照組(82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P<0.01)；DVT組≥65歲患者較<65歲患者PICI下降約4.8%(P<0.05)；當(dāng)PICI的cut-off值為84.2%時(shí)，卡方檢驗(yàn)顯示，DVT與健康人對(duì)照組PICI陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相關(guān)性分析顯示PICI與FDP、DD呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)(r分別為-0.318、-0.336和0.284，P均<0.01)；Logistic回歸分析顯示PICI是靜脈血栓的危險(xiǎn)因素，OR值為1.243(P<0.01)。結(jié)論骨折后血栓患者的內(nèi)源性抗凝能力降低。

內(nèi)源性抗凝能力；深靜脈血栓；骨折；Protac凝血抑制率

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是骨科患者的嚴(yán)重并發(fā)癥[1-2]。根據(jù)北京積水潭醫(yī)院血管外科的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，創(chuàng)傷性DVT發(fā)病率高達(dá)43.2%[3]。DVT發(fā)病原因復(fù)雜，人體內(nèi)源性抗凝系統(tǒng)功能異常會(huì)增加靜脈血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。目前，常用的DVT實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)有D-二聚體(D-dimer，DD)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation products，F(xiàn)DP)等[6-8]，而內(nèi)源性抗凝檢查的實(shí)驗(yàn)成本較高[9]，尚缺乏能全面有效地評(píng)價(jià)患者內(nèi)源性抗凝能力的獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

HemosIL Thrombopath試劑是一種新的評(píng)價(jià)內(nèi)源性抗凝功能的商品化檢測(cè)試劑，將患者血漿分為2份，一份加入促凝試劑以激活凝血酶，另一份加入促凝試劑和蛇毒提取物Protac試劑以激活內(nèi)源性抗凝過(guò)程；2份血漿分別通過(guò)自動(dòng)化血凝分析儀檢測(cè)吸光度并計(jì)算Protac引起的凝血抑制率(protac-induced coagulation inhibition percentage，PICI)。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)用HemosIL Thrombopath試劑檢測(cè)骨折血栓患者內(nèi)源性抗凝能力的報(bào)道，本研究用病例對(duì)照研究評(píng)價(jià)骨折血栓患者內(nèi)源性抗凝能力，并分析其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2016年5月至2017年5月于北京積水潭醫(yī)院血管外科就診的下肢骨折后DVT患者95例(DVT組)，入組標(biāo)準(zhǔn)為：曾于7日內(nèi)發(fā)生下肢骨折，于北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手術(shù)治療，術(shù)前經(jīng)靜脈血管造影確診DVT、使用低分子量肝素抗凝治療，術(shù)后使用利伐沙班抗凝治療，由于華法林對(duì)內(nèi)源性抗凝能力存在影響，故嚴(yán)格排除曾使用華法林的患者。DVT組男45例，女50例，年齡21～87歲，中位年齡為61歲，股骨骨折43例，脛腓骨骨折24例，膝關(guān)節(jié)骨折15例，踝關(guān)節(jié)骨折10例，多發(fā)骨折3例。選取同期于北京積水潭醫(yī)院社區(qū)保健科就診的性別、年齡相匹配的體檢健康者100例(健康人對(duì)照組)，無(wú)血栓病史，無(wú)抗凝藥物治療史，其中男57例，女43例，年齡36～81歲，中位年齡60歲。2組年齡、性別比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2標(biāo)本采集和處理 骨科手術(shù)后3 d采集DVT組患者靜脈血，抽血前曾使用利伐沙班常規(guī)抗凝治療。采集DVT組患者靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，用于內(nèi)源性抗凝能力、FDP和DD檢測(cè)。枸櫞酸鈉抗凝血在室溫下以2 000×g離心10 min，即刻檢測(cè)FDP和DD；隨后2 h內(nèi)分離血漿，-80 ℃凍存，用于后續(xù)的內(nèi)源性抗凝能力檢測(cè)，在檢測(cè)前，37 ℃水浴融解凍存的血漿標(biāo)本。采集DVT組患者靜脈血于分離膠真空采血管，室溫下靜置15 min，2 000×g離心10 min分離血清，即刻檢測(cè)高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。

1.3主要儀器和試劑 ACL-TOP 500型血凝分析儀(美國(guó)Werfen公司)和HemosIL Thrombopath發(fā)光底物顯色試劑(美國(guó)HemosIL公司)用于內(nèi)源性抗凝能力PICI檢測(cè)；CS-2100型血凝分析儀(日本Sysmex公司)及FDP(日本積水公司)及DD(德國(guó)西門子公司)試劑用于FDP和DD檢測(cè)。7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)和HDL-C試劑(北京柏定公司)用于HDL-C檢測(cè)。

1.4PICI、FDP、DD和HDL-C的檢測(cè) 在滿足質(zhì)量控制規(guī)則的條件下，用發(fā)光底物顯色法檢測(cè)PICI：將血漿標(biāo)本稀釋后分裝入2個(gè)反應(yīng)杯，分別加入激活物A(含有蛇毒提取物Protac)和激活物B(不含Protac)；37 ℃孵育，同時(shí)檢測(cè)2個(gè)反應(yīng)杯的A值(ThP-A和ThP-B)，單位為吸光度變化/分鐘(mAbs/min)，PICI=(ThP-A-ThP-B)/ThP-B×100%。用膠乳免疫比濁法檢測(cè)FDP，用顆粒增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)DD，用直接法-過(guò)氧化氫酶清除法檢測(cè)HDL-C。

2 結(jié)果

2.1健康人和骨折后DVT患者的內(nèi)源性抗凝能力評(píng)價(jià) DVT組與健康人對(duì)照組FDP(μg/mL)分別為11.8(6.8，16.7)和1.2(1.1，1.5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，DD(mg/L FEU)分別為4.59(2.43，7.53)和0.24(0.15，0.37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

健康人對(duì)照組和DVT組PICI(%)分別為87.8±3.6和82.8±7.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。DVT組內(nèi)源性抗凝能力平均降低約5.7%；健康人對(duì)照組和DVT組PICI的最高值幾乎一致，分別為94.6%和94.8%，而最低值分別為75.9%和45.4%。見(jiàn)圖1。

注：長(zhǎng)線表示平均值，短線表示標(biāo)準(zhǔn)差，虛線表示cut-off值。

圖1 健康組與血栓組內(nèi)源性凝血能力PICI比較

根據(jù)HemosIL Thrombopath試劑盒說(shuō)明書推薦和文獻(xiàn)報(bào)道[9]，用100例健康人的PICI平均值減1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差得到cut-off值，為84.2%，以此cut-off值作列聯(lián)表進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.1，P<0.01)。DVT組PICI陽(yáng)性患者為48%(46/95)，約二分之一的DVT骨折后血栓患者存在內(nèi)源性抗凝功能異常，見(jiàn)表1。

表1 DVT組與健康人對(duì)照組的內(nèi)源性抗凝能力比較

2.2血栓患者中不同性別、年齡和骨折部位的內(nèi)源性抗凝能力評(píng)價(jià) 健康人對(duì)照組男性PICI(%)為87.6±3.6，女性為88.7±3.5，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.470)；≥65歲34人，<65歲66人，PICI(%)分別為87.6±3.6和88.1±3.5，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.651)。

DVT組不同性別、骨折部位患者PICI差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但≥65歲患者較<65歲患者的PICI下降(P<0.05)，平均值下降約4.8%。見(jiàn)表2。

表2 DVT患者不同性別、年齡和骨折部位的內(nèi)源性抗凝能力評(píng)價(jià)

參數(shù)人數(shù)(百分比)PICI(%)P性別 男45(47.4%)82.1±8.70.376 女50(52.6%)83.4±5.5年齡 <65歲59(62.1%)84.3±7.2<0.05 ≥65歲36(37.9%)80.3±6.4骨折部位 股骨43(45.2%)80.7±8.30.515 脛腓骨24(25.3%)85.1±5.3 膝關(guān)節(jié)15(15.8%)83.5±6.7 踝關(guān)節(jié)10(10.5%)84.7±5.2 多發(fā)骨折3(3.2%)83.6±3.0

2.3PICI與FDP、DD、HDL-C的相關(guān)分析和logistic回歸分析 分析PICI與FDP和DD的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，PICI與FDP和DD存在負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.318(95%CI：-0.439～-0.186)和-0.336(95%CI：-0.455～-0.205)，P均<0.01；分析PICI與HDL-C相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，HDL-C與PICI呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.284(95%CI：0.142～0.413)，P<0.01。

將健康人對(duì)照組和DVT患者組的性別、年齡和PICI進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示僅PICI有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，OR值1.243(95%CI: 1.149～1.344)，PICI是DVT的危險(xiǎn)因素。

3 討論

2009年，Toulon等[9]首次報(bào)道了用HemosIL Thrombopath試劑檢測(cè)內(nèi)源性抗凝能力的多中心研究。隨后數(shù)篇關(guān)于內(nèi)源性抗凝能力檢測(cè)的文獻(xiàn)主要集中在腫瘤研究領(lǐng)域[10-12]。本研究首次用PICI評(píng)價(jià)骨科血栓患者的內(nèi)源性抗凝能力，其在臨床凝血狀態(tài)評(píng)價(jià)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，DVT組與健康人對(duì)照組FDP和DD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]；DVT患者PICI低于健康人對(duì)照組，約一半DVT患者存在內(nèi)源性抗凝缺陷；在DVT患者中，PICI最低值為45.4%，說(shuō)明該患者的內(nèi)源性抗凝能力下降較嚴(yán)重，此類患者的PICI檢測(cè)可能具有重要意義。在分析年齡與PICI關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，≥65歲老年患者PICI顯著下降，說(shuō)明年齡對(duì)內(nèi)源性抗凝能力存在一定影響。將DVT患者按骨折部位分組，不同骨折類型的PICI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明骨折部位不同對(duì)內(nèi)源性抗凝能力的變化影響不大。PICI與HDL-C呈正相關(guān)，HDL-C水平與內(nèi)源性抗凝能力可能存在聯(lián)系。HDL-C具有抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮等功能，可能是抗凝系統(tǒng)的保護(hù)因素[13]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用HemosIL Thrombopath檢測(cè)內(nèi)源性抗凝能力，可以有效檢出蛋白C及蛋白S通路異常、狼瘡抗凝物和Ⅴ因子Leiden突變[9]。但PICI只能評(píng)價(jià)整體的內(nèi)源性抗凝能力，不能測(cè)出具體哪一類機(jī)制異常。如發(fā)現(xiàn)DVT患者PICI偏低，內(nèi)源性抗凝下降，還應(yīng)檢測(cè)蛋白C、蛋白S、狼瘡抗凝物和Ⅴ因子Leiden等。PICI檢測(cè)無(wú)法明確內(nèi)源性抗凝能力異常的原因和機(jī)制，具有一定的局限性。

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Evaluationforendogenousanticoagulationpotentialofbonefracturepatientswithdeepvenousthrombosisformation

SUYu1,ZHAOJie2,WUJun1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,BeijingJishuitanHospital,Beijing100035; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,People′sHospital,PekingUniversity,Beijing100044,China)

ObjectiveTo evaluate the endogenous anticoagulation potential of bone fracture patients and its relationship with deep venous thrombosis formation (DVT).MethodsA total of 95 DVT patients after bone fracture and 100 healthy subjects as control from Beijing Jishuitan Hospital were included in this study. On the third day after orthopedic surgery, the citrated anticoagulant plasma samples were collected and fibrin degradation products (FDP) and D-dimer (DD) were measured. Protac-induced coagulation inhibition percentage (PICI) was measured with ThromboPath (ThP) chromogenic assay as the marker of endogenous anticoagulation potential. The serum samples from patients were collected to measure the concentration of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C).ResultsBoth FDP and DD values of DVT patient group were significantly higher than those of healthy control group (allP<0.01). The PICI (%) of DVT patients group was significantly lower than that of healthy control group (82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P<0.01). The PICI of patients ≥65 years old was 4.8 percent lower than that of the patients <65 years old (P<0.05) in DVT group. When the cut-off value for PICI was set as 84.2%, a significant difference was showed between DVT and control group by Chi-Square test (P<0.01). PICI was negatively correlated with FDP and DD (r=-0.318,-0.336,bothP<0.01), but positively correlated with HDL-C (r=0.284,P<0.01). Logistic regression analysis suggested that PICI was a risk factor of DVT with odds ratio 1.243 (P<0.01).ConclusionThe endogenous anticoagulation potential may be severely impaired in DVT patient after bone fracture.

endogenous anticoagulation potential; deep venous thrombosis; bone fracture; Protac-induced coagulation inhibition percentage

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.10

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)第五批高層次人才培養(yǎng)計(jì)劃(2015-3-034)；人社部留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目([2015]192)；首都特色臨床醫(yī)療研究(Z141107006614012)；教育部留學(xué)歸國(guó)人員科研啟動(dòng)基金([2013]693)。

蘇玉，1987年生，女，技師，博士，主要從事血栓分子標(biāo)志物研究;趙潔，1975年生，女，主管技師，大學(xué)本科，主要從事生物化學(xué)檢驗(yàn)工作。蘇玉和趙潔對(duì)該研究具有同等貢獻(xiàn)，同為第一作者。

吳俊，主任醫(yī)師，博士，研究生導(dǎo)師，E-mail:wujunpostbox@sina.com。

R446.11;R619

A

2017-08-29)

王海燕)