呂春燕，楊天林，李進輝，吳程，王麗，陳昌金，趙梓亦

（成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 1.病理科，2.中心實驗室，四川 成都 610072）

PEDF、END在UUO腎組織的表達及ADSCs對其的影響*

呂春燕1，楊天林1，李進輝1，吳程1，王麗1，陳昌金2，趙梓亦2

（成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 1.病理科，2.中心實驗室，四川 成都 610072）

目的動態(tài)觀察大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）腎組織中色素上皮衍生因子（PEDF）及內(nèi)皮抑素（END）的變化，以及脂肪干細胞（ADSCs）對其的影響。方法復(fù)制UUO動物模型，以ADSCs進行干預(yù)，選取UUO術(shù)后第3、7和14天為時間點，觀察大鼠在UUO后腎損傷及纖維化的進程，以及PEDF和END蛋白的表達變化。結(jié)果腎損傷、纖維化程度及PEDF的表達隨梗阻時間延長而加重或增加。END在術(shù)后先增加后降低，但仍高于對照組。ADSCs干預(yù)在各個時間點均能使END和PEDF的表達降低。結(jié)論UUO后PEDF和END蛋白表達上調(diào)可能是梗阻后微血管損傷、血管生成調(diào)節(jié)異常介導(dǎo)的微血管閉塞產(chǎn)生的重要機制之一。ADSCs干預(yù)可通過抑制PEDF和END的表達，促進損傷血管的修復(fù)和新生血管的生成。

色素上皮衍生因子；內(nèi)皮抑素；表達；脂肪干細胞；影響

結(jié)石、腎盂輸尿管狹窄及腫瘤壓迫等梗阻性因素導(dǎo)致的腎積水是腎纖維化的常見病因。單側(cè)輸尿管結(jié)扎是上述疾病特征性的動物模型。梗阻所致的管周微血管損傷及血管生成調(diào)節(jié)異常是纖維化進程的重要表現(xiàn)之一[1-2]。色素上皮衍生因子（pigment epitheliumderived factor，PEDF）和內(nèi)皮抑素（Endostatin，END）是血管生成抑制因子，在血管生成調(diào)節(jié)異常中發(fā)揮一定作用。本研究結(jié)扎單側(cè)輸尿管復(fù)制腎纖維化動物模型，通過檢測PEDF和END的表達，探討PEDF和END在腎纖維化進程中的可能機制，以及脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

雄性SD大鼠70只（成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供），無特定病原體條件飼養(yǎng)，體重（250±20）g。隨機分為對照組（10只）、單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureter obstruction，UUO）組（30只）、干預(yù)組（30只），UUO組和干預(yù)組又分為UUO后第3、7和14天組，每組10只。

1.2 主要試劑和儀器

抗END、PEDF抗體（武漢博士德公司），免疫組織化學(xué)二抗為羊抗大鼠免疫球蛋白G（美國Invitrogen公司）。

1.3 UUO模型的復(fù)制及干預(yù)

1.3.1 UUO模型UUO組以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾及剔毛，手術(shù)切開左側(cè)腹皮膚至腹腔，游離左腎及輸尿管，在左側(cè)輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3處用1號絲線完全結(jié)扎離斷輸尿管，逐層連續(xù)縫合皮膚[3]。對照組手術(shù)方式同UUO組，進腹腔后僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。

1.3.2 ADSCs的制備與注射分離、培養(yǎng)ADSCs，收集第4代細胞，用PBS洗滌ADSCs 3次。每只大鼠于UUO模型復(fù)制成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射ADSCs和PBS懸液（3×106個/100 g）[4]。

1.3.3 腎組織形態(tài)學(xué)檢測取左腎腹側(cè)組織，以乙醇-乙酸-甲醛固定液固定24 h，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）及Masson氏染色觀察腎纖維化程度。采用金瑞日等[5]的方法進行半定量分析，即在400倍鏡下每張切片隨機采集10個不重疊視野，將呈現(xiàn)為綠色的纖維區(qū)域（去除腎小球和大血管）視作陽性目標(biāo)，以陽性面積與整個視野總面積的比值作為腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)（tubulointerstitial fibrosis index，TFI），取其平均值作為每例切片的TFI。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測PEDF、END的表達，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。在光鏡下進行PEDF、END定位及分布檢查。用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進行積分光密度分析。200倍光鏡下隨機選取除大血管外10個皮質(zhì)及外髓視野并拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析棕黃色陽性染色所占面積的百分比，取其均值作為該例組織的陽性單位值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析釆用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟大體改變

對照組腎臟大小正常，包膜光滑，切面腎盂腎盞無分離，皮髓質(zhì)分界清楚。UUO組和干預(yù)組腎臟體積不同程度增大，包膜緊張，術(shù)后第3天可見腎盂腎盞分離，并隨梗阻時間延長而擴張，分離增加，皮髓質(zhì)逐漸分界不清。見圖1。

圖1 腎臟大體改變

2.2 腎臟組織學(xué)改變

圖2 各組大鼠第3、7和14天腎臟組織學(xué)形態(tài) （HE染色×10）

圖3 各組大鼠第3、7和14天膠原改變 （Masson染色×10）

鏡下見對照組腎小球、腎小管形態(tài)及數(shù)量基本正常，間質(zhì)不擴張，偶見個別淋巴細胞浸潤[TFI為（0.023±0.001）]。UUO組、干預(yù)組第3和7天腎小球無明顯變化，第14天腎小球略萎縮減少；第3天可見腎小管變性，個別集合管擴張；第7和14天腎小管變性增加，可見壞死后再生，遠端小管、近端小管及集合管均有不同程度擴張，部分伴有萎縮；第14天偶見蛋白管型；第3天間質(zhì)略充血；第7和14天充血、水腫增加，淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤逐漸增強；第14天可見纖維母細胞聚集，伴膠原纖維沉積。干預(yù)組腎小球、腎小管及間質(zhì)的改變與UUO組相似，但程度和范圍較UUO組減輕。見圖2、3。

2.3 各組大鼠TFI比較

UUO組、干預(yù)組及對照組大鼠第3、7和14天TFI水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第3天，干預(yù)組與UUO組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而第7和14天干預(yù)組與UUO組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠各時間點腎纖維化指數(shù)比較 （±s）

表1 3組大鼠各時間點腎纖維化指數(shù)比較 （±s）

組別 第3天 第7天 第14天對照組 0.02±0.003 0.02±0.003 0.02±0.003 UUO組 0.13±0.019 0.31±0.017 0.65±0.012干預(yù)組 0.12±0.005 0.23±0.005 0.53±0.013 F值 26.138 215.186 1 051.973 P值 0.009 0.002 0.000

2.4 PEDF蛋白表達變化

各組腎組織PEDF均有一定表達。細胞定位為細胞漿。對照組PEDF在腎小球血管球、腎小管及間質(zhì)均呈弱陽性表達。第3、7、14天表達無區(qū)別。UUO模型組PEDF表達增強，除在腎小球血管網(wǎng)陽性表達外，在皮髓質(zhì)交界及部分髓質(zhì)腎小管上皮細胞、管周及腎間質(zhì)均呈強陽性表達。各時間點比較，PEDF表達隨梗阻時間延長而表達增加。干預(yù)組腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)也有明顯表達，但各時間點PEDF表達強度及范圍較UUO組窄，染色深度較UUO組淡。同一時間點組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后第3天，干預(yù)組與UUO組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后第7和14天，干預(yù)組與UUO組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2和圖4。

表2 各組大鼠各時間點PEDF光密度值比較 （±s）

表2 各組大鼠各時間點PEDF光密度值比較 （±s）

組別 第3天 第7天 第14天對照組 0.791±0.011 0.791±0.011 0.791±0.011 UUO組 1.323±0.086 1.638±0.145 4.533±0.287干預(yù)組 1.054±0.000 1.240±0.016 1.543±0.278 F值 10.803 13.021 22.787 P值 0.003 0.001 0.000

圖4 各組大鼠第3、7和14天腎臟PEDF改變 （SP×10）

2.5 END蛋白表達變化

END表達于細胞漿。對照組個別腎小球弱表達END，腎小管及間質(zhì)幾乎無表達。UUO組腎小管上皮細胞及灶區(qū)間質(zhì)表達END，術(shù)后第7天表達最強，幾乎所有腎小管均呈陽性表達，在間質(zhì)呈片狀表達。術(shù)后第14天，腎小管及間質(zhì)表達減弱，但較第3天強。術(shù)后第3、7和14天，UUO組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組相應(yīng)時間點表達強度及范圍均較UUO組減少；第3天僅個別腎小管上皮細胞弱陽性表達；第7天時也僅約1/2呈中等強度陽性表達，第3和14天，干預(yù)組與UUO組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第7天，干預(yù)組與UUO比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3和圖5。

表3 各組大鼠各時間點END光密度值比較 （±s）

表3 各組大鼠各時間點END光密度值比較 （±s）

組別 第3天 第7天 第14天對照組 2.040±0.059 2.040±0.059 2.040±0.059 UUO組 3.347±0.317 16.400±1.586 5.508±0.292干預(yù)組 3.220±0.193 5.446±0.079 4.309±0.369 F值 11.014 35.490 38.822 P值 0.001 0.000 0.000

圖5 各組大鼠第3、7和14天END改變 （SP×10）

3 討論

血管生成是指從原先存在的毛細血管中形成新生血管的過程，包括選擇性降解血管基底膜及其周圍的細胞外基質(zhì)，內(nèi)皮細胞的分裂、轉(zhuǎn)移和增殖，管腔結(jié)構(gòu)及血管外膜的形成等過程。這些過程可能被特定的分子如成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子、干擾素、腫瘤壞死因子及血小板源性生長因子等啟動；此外，血管增生也能被某些血管生成抑制性分子調(diào)節(jié)，如血管抑素、END、血小板反應(yīng)素、抗凝血酶-3及PEDF等。其互相及其他自然存在的刺激因子和抑制因子之間的平衡密切調(diào)控正常血管系統(tǒng)的靜默狀態(tài)。當(dāng)促血管新生因子增加和/或抑制血管新生因子減少時，正常血管系統(tǒng)的靜默狀態(tài)失衡，導(dǎo)致血管增生[6]。血管生成與抑制所致的血管生成調(diào)節(jié)障礙在腎纖維化的形成中發(fā)揮重要作用。目前對于上述啟動因子已有較多研究，而對于抑制性分子的研究還很少，探討血管生成抑制因子，有利于該類藥物的開發(fā)研究；目前國內(nèi)外尚未見ADSCs對血管生成抑制性因子影響的研究，本研究是ADSCs治療早期腎纖維化形成機制的一個有力補充。

PEDF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的天然的新生血管抑制因子，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因家族，包含2個相應(yīng)的功能抗原決定簇，34肽和44肽。34肽是負責(zé)抗血管生成方面的作用，能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成，并且誘發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡[7]。目前，人們對PEDF的研究大多集中于其與糖尿病增殖性視網(wǎng)膜病變的關(guān)系[8-10]，而關(guān)于PEDF與腎纖維化關(guān)系的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠的腎臟中有PEDF表達，主要分布于腎小管上皮細胞和腎小管間質(zhì)，少量分布于腎小球。當(dāng)發(fā)生輸尿管梗阻時，PEDF表達增加，通過阻斷細胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，抑制損傷血管的修復(fù)，從而加強腎纖維化的發(fā)生。而ADSCs可以抑制PEDF的表達，抑制梗阻所致的管周微血管損傷與閉塞，從而減輕腎纖維化。

END是第XⅧ膠原C-末端的一個片段，可特異性抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移、侵襲和血管形成[11]。李愛軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血損傷的腎臟腎小球及腎小管細胞內(nèi)表達增加。呂臨靜等[13]研究發(fā)現(xiàn)，END蛋白在幼年單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟表達，術(shù)后1d即出現(xiàn)增強，隨著實驗時間的延長，病變的加重，上述表達趨勢明顯加強，7d時表達最強，然后隨病變的發(fā)展表達反而較前下降。本研究也發(fā)現(xiàn)，END隨梗阻時間而變化，先增強后減弱，但總體高于對照組。與MACIEL等[14]的研究結(jié)果一致。ADSCs在各個時間點均可降低END的表達，從而減輕腎間質(zhì)微血管損傷，減輕腎間質(zhì)纖維化。

干細胞是目前生命科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點[15]，ADSCs由于其免疫原性低、取材方便，可以塑形等優(yōu)點，成為干細胞研究領(lǐng)域的熱點。干細胞對早期腎纖維化形成的防治作用已有報道[16-18]。其作用方式多樣，對血管生成的調(diào)節(jié)作用，目前尚未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可以降低UUO大鼠腎各個時間點PEDF和END的表達，減輕其抑制血管修復(fù)作用，促進血管生成，改善腎間質(zhì)血供，從而影響纖維化的進程。

總之，幾乎所有慢性腎臟疾病進展到終末階段均表現(xiàn)為共同的病理變化—腎間質(zhì)纖維化。近年來開始重視腎間質(zhì)微血管病變在間質(zhì)纖維化中的作用，END和PEDF作為抗血管增殖蛋白，在腎間質(zhì)微血管損傷中具有重要作用。ADSCs可通過降低END和PEDF的表達，影響腎纖維化的進程。

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Expressions of PEDF and endostatin in rat kidney after unilateral ureteral obstruction and effect of adipose-derived stem cells on them*

Chun-yan Lü1, Tian-lin Yang1, Jin-hui Li1, Cheng Wu1, Li Wang1, Chang-jin Chen2, Zi-yi Zhao2
(1.department of Pathology, 2. Central Laboratory, the Aff i liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, Sichuan 610072, China)

ObjectiveTo observe thedynamic changes of pigment epithelium-derived factor (PEDF) and endostatin (END) expressions in renal tissues 3, 7 and 14days after unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats and the expression changes after the intervention of adipose-derived stem cells, so as to explore the possible mechanism of PEDF and END in UUO and the relationship between them and the effect of adipose-derived stem cells on the expressions of PEDF and END in the course of UUO.MethodsSeventy healthy adult male SD rats were randomlydivided into sham operation control group (10 rats), UUO group (30 rats) and intervention group (30 rats). The UUO model was produced by unilateral ureteral obstruction and the rats in the intervention group were injected with adipose-derived stem cells in 24 hours. On the 3rd, 7th and 14thday after ureteral obstruction, the progression of renal injury and fibrosis and the expressions of PEDF and END in rats were observed.ResultsThe renal injury and fibrosis got more severe with the prolongation of the time of obstruction, the expressions of PEDF and END in the UUO group were higher than those of the control group at each time point. The expressions of END and PEDF weredecreased at all time points after intervention by adipose-derived stem cells.ConclusionsThe upregulation of PEDF and END after UUO may be one of the important mechanisms of microvascular occlusion mediated by regulation abnormality of microvascular injury and angiogenesis. Intervention of adipose-derived stem cells can promote the repair of vascular injury and angiogenesis by inhibiting the expressions of PEDF and END.

pigment epithelium-derived factor; endostatin; expression; adipose-derived stem cell; effect

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.004

1005-8982（2018）02-0020-06

R692

A

2016-08-08

四川省衛(wèi)生廳項目（No：110520）；四川省成都市衛(wèi)生局項目（No：2014004）

（童穎丹 編輯）