吳江文，朱美意，歐陽(yáng)軍，周濤，曹東

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 急診外科，新疆 石河子 832008）

Neuritin與HSP60在大鼠肝損傷組織中的表達(dá)及其意義*

吳江文，朱美意，歐陽(yáng)軍，周濤，曹東

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 急診外科，新疆 石河子 832008）

目的研究大鼠肝損傷后不同時(shí)間Neuritin和熱休克蛋白60（HSP60）的表達(dá)，探討Neuritin和HSP60在大鼠肝損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。方法將126只SD大鼠隨機(jī)分為肝損傷組、骨折組和正常組，分別檢測(cè)各組術(shù)后6 h、12 h、1d、3d、5d、7d和14d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）濃度，并取肝組織行蘇木精-伊紅和免疫組織化學(xué)法染色，觀察肝臟病理學(xué)改變及Neuritin、HSP60的表達(dá)。結(jié)果肝損傷組大鼠血清ALT、AST濃度在6 h、12 h、1d時(shí)高于骨折組、正常組（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)法結(jié)果表明，肝損傷組大鼠Neuritin和HSP60的表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（6 h除外）高于骨折組、正常組（P＜0.05），且兩者的表達(dá)水平均呈先升高后降低的趨勢(shì)，骨折組大鼠HSP60的表達(dá)水平在12 h、1d時(shí)高于正常組（P＜0.05），骨折組大鼠Neuritin的表達(dá)水平與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論Neuritin與HSP60相互作用，可能是促進(jìn)肝損傷修復(fù)的重要因素。

肝損傷；骨折；Neuritin；熱休克蛋白60

肝損傷在腹部損傷中十分常見，然而肝損傷修復(fù)分子機(jī)制仍未明確[1-2]。Neuritin是NEDIVI等[3]從大鼠海馬cDNA文庫(kù)中篩選鑒定出與可塑性相關(guān)的候選基因，其在神經(jīng)發(fā)育及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。目前Neuritin與肝損傷修復(fù)的研究較少，課題組應(yīng)用基因信息學(xué)技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)[4]，在胎腦中發(fā)現(xiàn)多條與Neuritin有相互作用的蛋白質(zhì)和基因，其中包含熱休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）。因此本實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠肝損傷模型，探討Neuritin和HSP60在大鼠肝損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)，以及可能的作用機(jī)制和意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SD大鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（新）2011-0003，飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（新）2011-0001。

1.2 主要試劑及儀器

Neuritin多克隆抗體（型號(hào)AF283）（美國(guó)R&D公司），HSP60單克隆抗體（型號(hào)ab59457）（英國(guó)Abcam公司），相應(yīng)二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。免疫組織化學(xué)法石蠟包埋機(jī)及石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的復(fù)制126只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為肝損傷組、骨折組和正常組，每組42只。各組再按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6 h、12 h、1d、3d、5d、7d、14d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)（各6只）。肝損傷組參照第三軍醫(yī)大學(xué)大鼠肝臟損傷動(dòng)物模型[5]，骨折組采用股骨截股模型，大鼠麻醉后，取右下肢股外側(cè)切口暴露股骨干，用電動(dòng)擺鋸將股骨中段鋸斷，克氏針逆行插入經(jīng)股骨大轉(zhuǎn)子穿出，將克氏針順行插入骨折遠(yuǎn)端復(fù)位骨折，將大轉(zhuǎn)子根部針尾部克氏針折彎后剪除多余部分，逐層閉合切口。正常組做空白處理。

1.3.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）濃度的監(jiān)測(cè)麻醉后打開大鼠腹腔，用采血管自下腔靜脈采血5 ml，立即4000 r/min離心8 min，取上清液送往石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，由固定的專業(yè)人員利用全自動(dòng)生化儀監(jiān)測(cè)血清ALT、AST濃度。

1.3.3 肝臟組織切片蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）及病理學(xué)觀察肝損傷組取損傷處肝組織，骨折組和正常組均取左側(cè)肝葉組織，切取的肝組織經(jīng)甲醛固定后制作石蠟切片，行HE染色，常規(guī)顯微鏡下觀察并記錄。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Neuritin與HSP60的表達(dá)。采用Envision兩步法：取制作好的肝組織切片，烘干后脫蠟至水，加熱修復(fù)抗原，3%雙氧水H2O210 min封閉；添加相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜；震洗后滴加相應(yīng)第二抗體，37℃孵育30 min；震洗，顯色后進(jìn)行蘇木精核復(fù)染，經(jīng)脫水、透明后封片保存。光鏡下觀察Neuritin、HSP60的表達(dá)，以胞漿呈棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果評(píng)分采用AB值法。A：按切片中細(xì)胞有無(wú)顯色及深淺評(píng)分，細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分；顯色為淺黃色計(jì)1分；深黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。B：按切片中顯色細(xì)胞比例評(píng)分，顯色細(xì)胞＜1/3切片中細(xì)胞總數(shù)計(jì)1分；1/3～2/3細(xì)胞顯色計(jì)2分；＞2/3細(xì)胞顯色計(jì)3分。每例樣本積分= A×B。每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)無(wú)重疊視野，評(píng)分后取算術(shù)平均值進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST濃度比較

肝損傷組大鼠血清ALT、AST濃度在6 h、12 h、1d時(shí)高于骨折組和正常組（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)3組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。骨折組AST濃度在6 h、12 h、1d時(shí)升高，且與肝損傷組及正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、2。

2.2 肝臟病理學(xué)變化

光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織。肝損傷組大鼠6 h～1d可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，周邊見紅色出血帶，肝竇內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，部分肝細(xì)胞水腫；肝損傷后3和5d，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，仍可見出血，肝小葉周邊細(xì)胞普遍增大，胞漿水腫，局部點(diǎn)狀壞死，偶見核分裂象，肝血竇周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肝損傷后7和14d，出血明顯減少，仍見淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)皮細(xì)胞明顯增多，可見新生毛細(xì)血管形成。骨折組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部細(xì)胞質(zhì)疏松，可見少量炎癥細(xì)胞。見圖1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)ALT濃度比較 （n =6，u/L，±s）

注：?與正常組、骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 104.17±4.07? 424.50±10.84? 64.00±7.15? 40.33±7.56 44.83±11.70 36.33±9.95 43.17±6.18骨折組 44.00±5.02 43.00±4.56 42.33±5.46 38.17±6.24 39.67±8.98 42.00±5.41 43.17±10.30正常組 38.83±6.61 40.00±6.19 42.17±9.95 39.50±5.89 47.00±7.04 41.50±6.65 43.50±8.45 F值 277.617 4981.180 15.767 0.184 0.956 0.960 0.0030.000.003 P值 0.000 0.000 0.000 0.834 0.407 0.405 0.997

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)AST濃度BJ （n =6，u/L，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)AST濃度BJ （n =6，u/L，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 271.00±15.831）2）787.67±32.681）2）210.17±18.691）2） 93.50±12.80 76.50±7.14 69.83±9.13 63.33±9.13骨折組 127.50±7.011） 185.17±10.741） 143.00±19.601） 83.17±9.63 69.83±12.60 65.00±7.62 67.33±8.61正常組 65.50±8.552） 68.83±12.772） 77.33±14.282） 77.00±9.19 71.83±10.15 67.50±9.40 71.33±6.56 F值 536.192 1990.628 90.890 3.688 0.673 0.458 1.088 P值 0.000 0.000 0.000 0.050 0.525 0.641 0.362

圖1 肝臟病理學(xué)變化 （HE染色×200）

2.3 肝臟組織Neuritin、HSP60的表達(dá)

2.3.1 Neuritin光鏡下觀察Neuritin、HSP60均表達(dá)于細(xì)胞漿，著色肝細(xì)胞圍繞匯管區(qū)分散排列。肝損傷組在各時(shí)間點(diǎn)（6 h除外）Neuritin評(píng)分高于骨折組和正常組（P＜0.05）；各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨時(shí)間推移，表達(dá)呈先升高后下降的趨勢(shì)。隨時(shí)間推移，骨折組與正常組的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2和表3。

2.3.2 HSP60肝損傷組HSP60的表達(dá)水平也呈先升高后下降的趨勢(shì)，且在12 h、1d、3d、5d、7d、14d時(shí)的評(píng)分高于骨折組和正常組（P＜0.05）。骨折組HSP60的表達(dá)隨著時(shí)間變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在12 h、1d時(shí)表達(dá)水平較正常組高（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和圖3。

圖2 Neuritin在肝組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法染色×200）

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)Neuritin評(píng)分比較 （n =6，分，±s）

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)Neuritin評(píng)分比較 （n =6，分，±s）

注：?與正常組、骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 0.73±0.16 1.57±0.23? 2.23±0.29? 3.47±0.33? 4.07±0.30? 2.90±0.27? 1.97±0.23?骨折組 0.43±0.19 0.27±0.20 0.47±0.24 0.60±0.18 0.57±0.29 0.37±0.23 0.43±0.15正常組 0.30±0.11 0.47±0.16 0.43±0.15 0.44±0.16 0.31±0.10 0.27±0.16 0.40±0.17 F值 1.194 71.129 113.611 324.421 420.035 254.788 131.890 P值 0.330 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)HSP60評(píng)分比較 （n =6，分，±s）

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)HSP60評(píng)分比較 （n =6，分，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 1.90±0.27 3.10±0.211）2） 3.40±0.281）2） 4.57±0.291）2） 6.10±0.281）2） 4.03±0.291）2） 2.87±0.321）2）骨折組 1.57±0.29 2.53±0.271） 2.90±0.211） 1.56±0.30 1.50±0.21 1.47±0.21 1.67±0.21正常組 1.70±0.21 1.27±0.162） 1.50±0.212） 1.53±0.24 1.60±0.28 1.37±0.23 1.57±0.32 F值 2.452 109.128 103.929 235.374 621.300 223.514 37.381 P值 0.120 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 HSP60在肝組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法染色×200）

3 討論

Neuritin最初被認(rèn)為是一條高度限制在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的基因，ZITO等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Neuritin基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth fact，NGF）的應(yīng)答,從而刺激神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)及神經(jīng)元細(xì)胞的遷移。在胎鼠腦發(fā)育時(shí)期，Neuritin過(guò)表達(dá)可以阻斷Caspase-3的活性,而抑制皮層細(xì)胞的凋亡。Neuritin可以作為NGF共同發(fā)揮作用的下游因子，與神經(jīng)組織可塑性密切相關(guān)[7]。然而隨著研究深入，Neuritin在機(jī)體其他組織中也有表達(dá)，并介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)外組織的再生，Neuritin促進(jìn)真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集和增殖，在血管領(lǐng)航和網(wǎng)絡(luò)形成中發(fā)揮導(dǎo)向作用[8]。Neuritin與肝損傷修復(fù)的研究鮮見報(bào)道，日本學(xué)者在切除70%小鼠肝臟后，Neuritin在肝臟的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，隨著肝臟再生，Neuritin基因表達(dá)也上升[9]。本研究結(jié)果也證實(shí)，Neuritin在肝臟組織中表達(dá)，并且在肝臟損傷后Neuritin表達(dá)水平從12 h開始呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，貫穿于肝臟損傷后的修復(fù)進(jìn)程，而且其表達(dá)水平高于骨折組和正常組，因此筆者推定Neuritin參與肝組織的損傷、修復(fù)過(guò)程，可能對(duì)肝細(xì)胞的發(fā)育或再生起重要作用，具有潛在的臨床價(jià)值。

HSP60是線粒體內(nèi)最主要的分子伴侶蛋白之一，生理狀況下其主要參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊等。在機(jī)體受到損傷時(shí)，HSP60作為一種應(yīng)激蛋白抵御各種損害因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激狀態(tài)下HSP60發(fā)揮分子伴侶作用，調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，從而保護(hù)細(xì)胞生存[10]。HSP60可以與抗凋亡因子Bcl-XL蛋白相互作用，當(dāng)激活線粒體凋亡通路時(shí)，HSP60過(guò)表達(dá)可增加Bcl-XL基因的表達(dá)，降低促凋亡因子Bax的表達(dá)量，從而穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制Caspase-3通路激活，減少細(xì)胞凋亡[11-12]。HSP60也可能參與肝臟的再生，SHI等[13]研究報(bào)道，HSP60在切除2/3小鼠肝臟組織后，修復(fù)早期表達(dá)升高，從而激活庫(kù)普弗細(xì)胞表面的Toll樣受體，分泌白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子，在肝臟損傷修復(fù)中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，骨折組12 h、1d時(shí) HSP60在肝臟表達(dá)量較正常組升高，AST濃度在6 h、12 h、1d時(shí)也升高，HSP60在骨折創(chuàng)傷后表達(dá)升高可能是作為應(yīng)激蛋白，抵御骨折創(chuàng)傷帶給肝細(xì)胞的危害。而在肝損傷組，HSP60的表達(dá)與Neuritin的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，從12 h開始升高，且高于骨折組和正常組，因此筆者認(rèn)為HSP60可能不僅僅作為一種應(yīng)激蛋白起防御保護(hù)作用，HSP60可能也參與了肝臟的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。

ALT、AST是反映各種功能的經(jīng)典指標(biāo)，ALT、AST升高及肝組織切片明確大鼠肝臟損傷，肝臟損傷后肝細(xì)胞通過(guò)強(qiáng)大的再生能力使自身結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，其修復(fù)過(guò)程有多種細(xì)胞及因子參與。本研究首次證實(shí)，Neuritin和HSP60在受損肝組織的時(shí)相性表達(dá)，都呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，而且筆者注意到HSP60與Neuritin在機(jī)體組織具有共同的作用。兩者都在蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用，都參與細(xì)胞周期及凋亡進(jìn)程，應(yīng)激狀態(tài)是都可以過(guò)表達(dá)或異位表達(dá)。

綜上所述，推測(cè)HSP60和Neuritin都可能參與肝臟的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程，兩者作用機(jī)制可能是HSP60和Neuritin的過(guò)表達(dá)及相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制受損肝細(xì)胞凋亡，輔助相關(guān)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)育，維持組織可塑性。本研究將為進(jìn)一步研究Neuritin和HSP60在肝損傷修復(fù)過(guò)程中的具體作用，以及機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為肝細(xì)胞受損后再生修復(fù)提供新思路。

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Expressions of neuritin and HSP60 in traumatically-injuried liver tissue of rats*

Jiang-wen Wu, Mei-yi Zhu, Jun Ouyang, Tao Zhou,dong Cao

(Department of Emergency Surgery, the First Aff i liated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832008, China)

ObjectiveTodetect the expressions of neuritin and HSP60 in traumatic liver tissues of rats at different time, anddiscuss the effect of neuritin and HSP60 on the repair of injuried hepatic tissue.MethodsOne hundred and twenty-six SD rats were randomlydivided into liver injury group (group A), fracture group (group B) and normal group (group C). In each group, the serum concentrations of ALT and AST were respectively measured at seven time points (6 and 12 h, 1, 3, 5, 7 and 14d), HE staining and immunohistochemical method were used todetect the expressions of neuritin and HSP60 in the liver tissue of the rats.ResultsAt the time of 6 h, 12 h and 1d, serum concentrations of ALT and AST in the group A were higher than those in the group B and the group C (P＜ 0.05). The immunohistochemical staining results indicated the expressions of neuritin and HSP60 in the group A at the time points from 12 h to 14d were significantly higher than those in the group B and the group C (P＜ 0.05). The expression of HSP60 in the group B was higher than that in the group C at 12 h and in 1d (P＜ 0.05). And the expressions of neuritin and HSP60 increased at first and thendecreased.ConclusionsThe interaction between neuritin and HSP60 may play an important role in hepatic self-repair after traumatic liver injury.

liver injury; fracture; neuritin; heat shock protein 60

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.002

1005-8982（2018）02-0008-06

R575.3

A

2016-11-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81560312）

歐陽(yáng)軍，E-mail：wenf010@163.com

（童穎丹 編輯）