王艷，杜弢，曾翠云，陳紅剛

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

·中藥農(nóng)業(yè)·

甘肅省黃芩灰霉病的發(fā)生及其病原鑒定

王艷1*，杜弢1，曾翠云1，陳紅剛1

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

目的據(jù)2013—2016年調(diào)查，甘肅省黃芩灰霉病發(fā)生嚴(yán)重，常年發(fā)病率為10～15%，嚴(yán)重度2～3級(jí)。本研究旨在明確該病在甘肅省的發(fā)生情況及其病原菌的分類地位，為該病的防控提供一定的理論依據(jù)。方法通過植物病害田間調(diào)查確定病害發(fā)生情況，將形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合確定病原分類地位。結(jié)果黃芩灰霉病癥狀主要表現(xiàn)為在葉片和莖稈上形成褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)整株葉片干枯，植株死亡。病原菌分生孢子梗褐色，多隔，長寬450.0～716.6 μm×9.4～18.8 μm；分生孢子長橢圓形至橢圓形，無色，大小8.2～16.5 μm ×5.9～8.2(平均10.6×7.3) μm?；谛螒B(tài)學(xué)和rDNA ITS基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將黃芩灰霉病病原鑒定為灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)。結(jié)論黃芩灰霉病在甘肅省各個(gè)黃芩產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，依據(jù)病害傳播規(guī)律，將栽培措施和藥劑噴施相結(jié)合進(jìn)行病害的防治。

黃芩；灰霉?。恍螒B(tài)學(xué)；系統(tǒng)發(fā)育分析；病原鑒定

黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi為唇形科多年生草本植物，性寒、味苦，具清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，常用于治療濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽等癥[1-2]，是我國常用的大宗藥材之一。野生黃芩主要分布于我國長江以北大部分地區(qū)，河北承德為其道地產(chǎn)區(qū)，素有“熱河黃芩”之稱[3-4]。隨著黃芩的應(yīng)用范圍的擴(kuò)大和市場需求量的逐年增大，自20世紀(jì) 90年代開始，我國許多省區(qū)開始野生馴化和人工栽培黃芩[5]，目前在我國黑龍江、山西、河北、甘肅、山東、內(nèi)蒙古等地形成了新的栽培產(chǎn)區(qū)，在甘肅省隴南、天水、蘭州、金昌、武威等地區(qū)均有大面積的種植[6-7]。

但是隨著人工栽培黃芩面積的逐年擴(kuò)大，黃芩病害已成為制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。國內(nèi)目前報(bào)道黃芩真菌性病害主要有5種，分別為：白粉病ErysiphecichorocearumDC.[8]、根腐病Fusariumspp.、莖枯病PhomaasparageSacc.[9]、灰霉病BotrytiscinereaPers.和灰斑病PhyllostictamenthaeBres.[10-11]。其中灰霉病是其主要病害，在各產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。河北承德在2008—2009年對(duì)河北省黃芩灰霉病進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查和研究，并提出了一定防治建議[11]。在我省該病自2011年在隴西縣被首次發(fā)現(xiàn)，病害發(fā)病率為10%，嚴(yán)重度為1～2級(jí)[10]，近年來該病已擴(kuò)展至渭源、隴西、和政、天水等地，病害發(fā)病率上升至10～15%，嚴(yán)重度2～3級(jí)，呈現(xiàn)逐年擴(kuò)大的趨勢。目前國內(nèi)對(duì)黃芩灰霉病的病原僅進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的鑒定，本文旨在通過調(diào)查確定黃芩灰霉病在甘肅省的發(fā)生情況，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的手段對(duì)該病的病原進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為該病的有效防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查時(shí)期、地點(diǎn)和方法

2013年7月至2016年10月，對(duì)甘肅省定西市渭源縣鍬峪鄉(xiāng)大田、隴西縣藥材示范園及大田、和政藥用植物園等的22個(gè)田塊，在苗期、成株期、采收期進(jìn)行了黃芩灰霉病的調(diào)查，采取“Z”字型5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)調(diào)查10株，記載發(fā)病率，嚴(yán)重度。采集典型病株，壓制標(biāo)本，以備病原分離及鑒定。

1.2 病原菌的分離

選取葉部和莖干上癥狀典型病斑，切取病健交界處組織，在0.1%升汞中消毒1 min，用無菌水沖洗3次后，轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，置于25 ℃下黑暗培養(yǎng)，5天后進(jìn)行純化并于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

在PDA上培養(yǎng)7d的菌落上加入無菌水，并用滅菌的玻棒刮取分生孢子，配制成濃度為每亳升1×104個(gè)的孢子懸浮液，用手動(dòng)噴霧器噴灑于室內(nèi)盆栽黃芩植株葉片表面，以噴灑無菌水的植株作為對(duì)照。將所有植株分別置于密封的塑料小溫室內(nèi)，在12 h光照/12 h黑暗的條件保濕24 h后，取出置于室內(nèi)，每天觀察記錄發(fā)病情況，并對(duì)接種后發(fā)病的葉片進(jìn)行病菌再分離。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察

對(duì)采集的病害標(biāo)本描述癥狀，光學(xué)顯微鏡下觀察病原形態(tài)，測定分生孢子梗及分生孢子的大小，觀察培養(yǎng)病菌培養(yǎng)特性，參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行病菌鑒定。

1.5 病原菌核糖體DNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增與分析

1.5.1 病原菌DNA的提取 將菌株接種到PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，并用封口膜將培養(yǎng)皿封住，25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7d后，用滅菌的解剖針刮取菌絲體，應(yīng)用真菌基因組DNA的提取采用UNIQ-10 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)Sangon Biotech(Shanghai)Co.，Ltd.)提取病原菌DNA。

1.5.2 rDNA ITS的PCR擴(kuò)增 ITS rDNA的PCR擴(kuò)增采用真菌的通用引物，正向引物ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C，反向引物ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC[14]，由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，反應(yīng)液為：10×PCR buffer(含MgCl220 mmol·L-1)5 μL，dNTP (10 mmol·L-1)0.5 μL，引物ITS1和ITS4各2.5 μL(10 μmol·L-1)，Taq酶(2 U·μL-1)2 μL(以上試劑由生工生物公司合成和提供)，模板DNA 2 μL，在Biometre PCR擴(kuò)增儀((Biometra Tg PCR，德國)上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 sec，53 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀進(jìn)行觀察并照相。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行純化和測序。

1.5.3 序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)測序所得菌株完整的ITS序列在 GenBank登錄，并進(jìn)行BLASTn搜索，下載相似序列以及葡萄孢屬的19種菌的ITS序列，選用核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(登錄號(hào)：GU229817)作為外群，用Clustal X(1.81)進(jìn)行多重序列比對(duì)(multiple alignment)，通過 MEGA 6.0采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

病原菌主要為害葉片、葉柄、嫩莖、花器。葉片多自葉緣發(fā)病，向內(nèi)擴(kuò)展呈長橢圓形褐色病斑，稍現(xiàn)輪紋，常在葉背長出灰褐色霉?fàn)钗?，粗壯的分生孢子梗肉眼可見，莖稈受害產(chǎn)生大型長條形病斑，莖稈四周的霉?fàn)钗锶缑?見圖1A)，上部組織全部變褐，全株葉片干枯死亡(見圖1B)。殘花上亦長出褐色絲狀物及灰色孢子球。

2.2 病原

挑取組織上病原觀察，病原菌菌絲無色至淡褐色，粗1.2～1.8。分生孢子梗褐色，多隔，長寬450.0～716.6 μm ×9.4～18.8 μm，直或稍彎曲，壁上有小瘤突。分生孢子長橢圓形、橢圓形。無色，一端稍細(xì)，大小8.2～16.5μm×5.9～8.2(平均10.6×7.3)μm。該病在我省隴西、渭源、和政大田均有發(fā)生，發(fā)病率10～15%，嚴(yán)重度2～3級(jí)。

注：A.莖稈、葉片上癥狀；B.田間病株圖1 黃芩灰霉病癥狀

2.3 致病性測定

將通過常規(guī)組織分離獲得的菌株TCM-106在室內(nèi)接種健康植株，經(jīng)接種的葉片5 d后即出現(xiàn)明顯褪綠小型斑點(diǎn)，迅速擴(kuò)展成不規(guī)則形小型斑塊，10 d后葉片上癥狀明顯，對(duì)照不發(fā)病。對(duì)接種發(fā)病后的病斑再次進(jìn)行病菌的分離，可獲得與原分離菌株一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌為黃芩灰霉病的致病菌。據(jù)菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特性，初步確定該病原菌為葡萄孢屬真菌(Botytissp.)。

2.4 黃芩灰霉病病原rDNA ITS系統(tǒng)發(fā)育研究

經(jīng)ITS1和ITS4引物對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，得到長度為517 bp的rDNA-ITS序列，將序列提交至Genbank，獲得登錄號(hào)為KX100100。在GenBank中搜索并下載同源序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。該系統(tǒng)發(fā)育樹共22個(gè)菌株，包括外群S.sclerotiorum(登錄號(hào)：GU229817)，從系統(tǒng)發(fā)育樹可見，黃芩灰霉病菌(TCM-106)與4株Genbank登錄號(hào)分別為：AJ716294，KR094468，KP025968，KJ744343的灰葡萄孢菌B.cinerea聚類在一個(gè)分支上。因此，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合，確定黃芩灰霉病的病原為灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.

圖2 黃芩灰霉病菌(TCM-106)ITS rDNA序列分析

3 討論

3.1 病原

灰葡萄孢(無性態(tài)：BotrytisPers.，有性態(tài)：BotryotiniaWhetzel)是一種重要的植物病原菌，生長期和貯藏期的作物均可被侵染而引起灰霉病，癥狀表現(xiàn)為花腐、果腐及葉斑，病處形成大量的灰色霉層，即分生孢子梗和分生孢子[15]。該屬真菌共包括了22個(gè)種和一個(gè)雜交種[16]，大多數(shù)種寄主范圍較窄，只侵染一個(gè)或幾個(gè)相似種的寄主，灰葡萄孢(B.cinerea)侵染范圍最廣，可侵染200多種植物[15]。在甘肅省藥用植物病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，有多種藥用植物發(fā)生灰霉病，其中當(dāng)歸、甘草、黨參、知母、紫菀等的灰霉病均由灰葡萄孢B.cinerea.侵染引起[10]。在藥用植物種植過程中，一定要明確該病的病原，才能采取有效的防治措施，以免造成不必要的損失。

3.2 黃芩灰霉病的防治建議

針對(duì)黃芩灰霉病提出以下防治建議：(1)黃芩灰霉病菌多以菌絲體在病殘?bào)w上越冬，因此，初冬需徹底清除田間病殘組織，減少越冬菌源，可減輕來年病害的發(fā)生；(2)目前灰霉病在溫棚中多有發(fā)生，溫棚黃瓜、西葫蘆、西紅柿、茄子以及多種花卉上的灰霉菌可直接傳至黃芩引起侵染，特別是棚膜揭開后，孢子大量飛散，為周圍黃芩等植物提供了大量菌源，因此黃芩種植地遠(yuǎn)離溫棚和大棚蔬菜；(3)該病在低溫、高濕條件下發(fā)生嚴(yán)重，降雨多、露時(shí)長、濕度大、植株過密等條件下病害發(fā)生嚴(yán)重，因此種植過程中需降低田間濕度，注意通風(fēng)透光；(4)必要時(shí)需采用藥劑防治措施，可在發(fā)病初期噴施2%多抗霉素水劑200倍液、50%乙烯菌核利可濕性粉劑1000～1500倍液、40%嘧霉胺可濕性粉劑800～1000倍液、25%咪鮮胺乳油2000倍液及50%異菌脲可濕性粉劑1000倍液及65%硫菌·霉威可濕性粉劑1500倍液。

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PathogenIdentificationofGrayMoldonScutellariabaicalensisinGansuProvince

WANGYan1*，DUTao1，ZENGCuiyun1，CHENHonggang1

(GansuUniversityofChineseMedicine，Lanzhou730000，China)

Objective：During disease surveys on medicinal plants in Gansu province in 2013-2016，we found that gray mold onScutellariabaicalensiswas a serious disease with 10～15% disease incidence and 2～3 level of disease severity.The study of the disease incidence and the pathogen identification will provide scientific basis to the control of the disease.MethodsThe disease incidence in Gansu province was determined by field surveys.Morphological and molecular methods were combined to identify the pathogen.ResultsThe disease leads to leaf lesions and plant blight.The conidiophore of the causal pathogen is brown，multi septate，450.0～716.6 μm×9.4～18.8 μm in size；the conidia is aseptate，colorless，ellipsoidal，8.2～16.5 μm ×5.9～8.2(mean=10.6×7.3)μm in size.Based on morphological characteristics and rDNA internal transcribed spacer sequence analysis the fungi is identified asBotrytiscinereaPers.S.baicalensisgray mold appears in all the planting areas in Gansu province.ConclusionThe cultivation methods and chemical control methods should be combined to control this disease.

Scutellariabaicalensis；gray mold；morphology；phylogenetic analysis；pathogen identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.016

國家自然基金項(xiàng)目(31460013)；甘肅省自然基金(17JR5RA164)；甘肅省科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體(1606RJIA323)；中央財(cái)政引導(dǎo)地方科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目；省自然基金(1508RJZA011)

*

王艷，副教授，研究方向：藥用植物病理學(xué)；Tel：(0931)8765393,E-mail：gswangyan101@163.com

2017-07-04)