張學(xué)典+蔡雨杏+汪泓

摘要：肝癌已經(jīng)成為常見(jiàn)的惡性腫瘤，組織切片顯微圖像的病理分析是診斷的主要手段，細(xì)胞的準(zhǔn)確分割是病理分析的重要環(huán)節(jié)。提出了一種新的基于H&E染色組織病理學(xué)圖像的肝癌細(xì)胞分割算法，首先用彩色卷積方法進(jìn)行主成分提取得到灰度圖像，在此灰度圖像的基礎(chǔ)上，進(jìn)行形態(tài)學(xué)處理；然后運(yùn)用快速?gòu)较驅(qū)ΨQ變換提取種子點(diǎn)作為前景標(biāo)記，進(jìn)行分水嶺分割；最后將分水嶺分割得到的輪廓線作為初始輪廓進(jìn)行GVF主動(dòng)輪廓分割，得到更為精確的輪廓線。分割結(jié)果的陽(yáng)性預(yù)測(cè)平均值達(dá)到0.89，召回率平均值達(dá)到0.9，證明了該算法細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性。Dice系數(shù)平均值為0.84，證明了本算法細(xì)胞分割區(qū)域的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：H&E；細(xì)胞分割；徑向?qū)ΨQ變換；分水嶺分割；主動(dòng)輪廓模型

DOIDOI：10.11907/rjdk.172017

中圖分類號(hào)：TP312

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-7800（2017）012-0081-05

Abstract：Liver cancer has become a common malignant tumor in the world. Analysis of histopathology images is one of the main methods for diagnosis and precise segmentation of cell and nuclei is the first step towards automatic analysis of histopathology images. A new nuclei segmentation method that works with H&E stained liver cancer histopathology images was proposed. The procedure can be concluded as the following steps： getting the grayscale image by color convolution， selecting seed points utilizing fast radial symmetry transform， marker-controlled watershed segmentation， getting final contour via active contour model. The evaluation was done in terms of positive predictive value， recall and Dice coefficient. The mean predictive value was 0.89 and the mean recall was 0.9 which indicates the accuracy of cell detection. The mean Dice coefficient was 0.84 which indicates the accuracy of segmentation.

Key Words：H&E； cell segmentation； fast radial symmetry transform； watershed； ACM

0 引言

近年來(lái)，圖像處理與計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用加快了生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)光學(xué)顯微鏡細(xì)胞圖像進(jìn)行細(xì)胞參數(shù)的定量分析，可以輔助醫(yī)師判別細(xì)胞病變狀態(tài)，從而在一定程度上減輕醫(yī)務(wù)人員的工作負(fù)擔(dān)，具有很大的應(yīng)用潛力。因此，細(xì)胞圖像處理逐漸成為醫(yī)學(xué)圖像處理領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[1]。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞圖像的病理學(xué)識(shí)別，重點(diǎn)在于細(xì)胞圖像分割，即從顯微鏡細(xì)胞圖像中提取出所需的細(xì)胞區(qū)域，從而為后續(xù)定量分析作必要的準(zhǔn)備。

截至目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)細(xì)胞圖像的分割技術(shù)進(jìn)行了大量研究。其中主要有兩類研究，一類是針對(duì)顯微鏡低倍物鏡采集的低分辨率大圖像分割，這類分割主要是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核、實(shí)質(zhì)細(xì)胞區(qū)域的定位；另一類是針對(duì)顯微鏡高倍物鏡采集的高分辨率細(xì)胞圖像，這類分割主要是實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞、重疊細(xì)胞圖像的分割。醫(yī)生能夠通過(guò)快速數(shù)碼掃描獲得整張圖片，從而進(jìn)行病理學(xué)分析。H&E染色是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)，但由于組織的多樣性和復(fù)雜性，H&E染色圖像的自動(dòng)化分析仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。自動(dòng)化分析數(shù)字顯微圖像的第一步是細(xì)胞和細(xì)胞核的分割。Cosatt等[2]采用霍夫變換確定種子點(diǎn)，并對(duì)每個(gè)種子點(diǎn)運(yùn)用主動(dòng)輪廓模型進(jìn)行演化得到細(xì)胞輪廓；Kong等[3]采用基于GVF的主動(dòng)輪廓模型提取細(xì)胞核；Vink等[4]將聚類算法與主動(dòng)輪廓模型相結(jié)合，提取乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核；Wahlby等[5]采用H最小值變換提取種子點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分水嶺分割；Hafiane等[6]采用模糊聚類方法和多相水平集相結(jié)合提取細(xì)胞核；Al-Kofahi等[7]提出一種多尺度LoG濾波方法提取細(xì)胞核的中心作為種子點(diǎn)進(jìn)行分水嶺分割；Yang等[8]運(yùn)用基于梯度的彩色Snake算法分割血細(xì)胞。

本算法研究的是針對(duì)高分辨率H&E染色細(xì)胞圖像與重疊細(xì)胞圖像的分割。無(wú)論是哪類細(xì)胞圖像的分割，目前的分割算法大多是圍繞主動(dòng)輪廓模型、分水嶺算法、像素聚類或者上述方法的結(jié)合，再加上一些預(yù)處理和后處理以及探測(cè)和定位過(guò)程。上述算法大多需要通過(guò)后處理剔除錯(cuò)誤細(xì)胞，且大部分針對(duì)的不是H&E染色圖像，故本文提出一種將前景標(biāo)記分水嶺和主動(dòng)輪廓模型相結(jié)合的算法，對(duì)H&E染色的組織病理學(xué)圖像中的細(xì)胞核進(jìn)行分割。本算法結(jié)合了多種處理算法，在預(yù)處理方面采用形態(tài)學(xué)重建方法，前景標(biāo)記方法采用快速?gòu)较驅(qū)ΨQ變換，相比于傳統(tǒng)算法能產(chǎn)生更好的分割效果，在分水嶺分割結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行主動(dòng)輪廓模型分割能夠提高準(zhǔn)確性。本算法的評(píng)價(jià)性能指標(biāo)主要有3項(xiàng)：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、召回率、Dice系數(shù)。其中陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和召回率評(píng)價(jià)的是細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性，Dice系數(shù)評(píng)價(jià)的是細(xì)胞分割區(qū)域的準(zhǔn)確性。

1 前景標(biāo)記分水嶺與主動(dòng)輪廓模型結(jié)合算法

本文采用的算法流程如圖1所示。首先對(duì)彩色圖像進(jìn)行主成分分析，得到含有蘇木精顏色信息的灰度圖像，然后用形態(tài)學(xué)操作進(jìn)行預(yù)處理，去除干擾成分，得到較好的細(xì)胞核輪廓，再運(yùn)用快速?gòu)较驅(qū)ΨQ變換提取種子點(diǎn)，將種子點(diǎn)標(biāo)記在原圖中，在進(jìn)行后景標(biāo)記后運(yùn)用分水嶺變換完成預(yù)分割，將預(yù)分割得到的輪廓線作為主動(dòng)輪廓模型的初始輪廓，進(jìn)行曲線演化得到最終輪廓。下文將詳細(xì)介紹本文算法中用到的關(guān)鍵算法。

1.1 前景標(biāo)記分水嶺

1.1.1 主成分分析

H&E染色圖像細(xì)胞分割的第一步是主成分提取，本文采用了Ruifrok[9]提出的彩色分離技術(shù)，該技術(shù)主要利用亮場(chǎng)條件下的顯微圖像信息能運(yùn)用朗伯定律進(jìn)行模擬分析這一事實(shí)，相機(jī)獲取圖像時(shí)探測(cè)到R、G、B三個(gè)信道的光強(qiáng)，而從單色染色的圖像中獲取特定染料的吸收系數(shù)。由于細(xì)胞核被蘇木精染成了紫色，提取蘇木精染色部分并轉(zhuǎn)化成灰度圖，本算法的后續(xù)步驟都是基于該灰度圖。

利用該矩陣進(jìn)行彩色卷積即可將圖像中三種染料的染色圖像分離出來(lái)，達(dá)到主成分提取的效果。

1.1.2 形態(tài)學(xué)處理

經(jīng)過(guò)分離得到的蘇木精染色圖像仍有比較雜亂的結(jié)構(gòu)，這會(huì)阻礙種子點(diǎn)的選取和最后的分割。本算法通過(guò)一系列形態(tài)學(xué)灰度重建操作將這些結(jié)構(gòu)濾除[10]。使用形態(tài)學(xué)開(kāi)重建可以將小于結(jié)構(gòu)元素的亮目標(biāo)去除，類似地，使用形態(tài)學(xué)閉重建可以將小于結(jié)構(gòu)元素的暗目標(biāo)去除，交替進(jìn)行這兩個(gè)操作可以產(chǎn)生較為平滑的圖像。另外，可以通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)元素的大小獲得想要的圖像細(xì)節(jié)。在蘇木精圖像中，先進(jìn)行形態(tài)學(xué)開(kāi)重建，再進(jìn)行形態(tài)學(xué)閉重建。結(jié)構(gòu)元素大小要根據(jù)所需細(xì)胞核大小、圖像分辨率和濾除結(jié)構(gòu)的大小進(jìn)行選擇。

在完成了以上兩個(gè)操作之后，細(xì)胞核的主輪廓往往不規(guī)則且?guī)в忻?，為解決該問(wèn)題，本算法提出用一個(gè)比較小的結(jié)構(gòu)元素進(jìn)行閉操作，可以在不影響主輪廓位置的情況下，簡(jiǎn)化目標(biāo)形狀，消除毛刺，去除不必要的粘連。結(jié)構(gòu)元素尺寸為之前開(kāi)操作和閉操作結(jié)構(gòu)元素大小的一半。

當(dāng)然，選取能適用于所有圖像的結(jié)構(gòu)元素是不可能的，結(jié)構(gòu)元素大小應(yīng)根據(jù)想要移除的結(jié)構(gòu)大小進(jìn)行選擇。若結(jié)構(gòu)元素過(guò)大，會(huì)失去圖像細(xì)節(jié)，若結(jié)構(gòu)元素過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致某些子結(jié)構(gòu)無(wú)法去除，都會(huì)影響分割效果。故對(duì)于不同尺度的圖像，選用的結(jié)構(gòu)元素也不同。

1.1.3 快速?gòu)较驅(qū)ΨQ變換

快速?gòu)较驅(qū)ΨQ變換是一種提取徑向?qū)ΨQ中心的變換，在某種程度上類似于霍夫圓變換，二者的主要區(qū)別在于：前者主要考察一幅圖像中每個(gè)像素點(diǎn)對(duì)它周圍鄰域內(nèi)像素點(diǎn)的作用（貢獻(xiàn)），而后者則主要考察一個(gè)像素點(diǎn)的鄰域?qū)Ξ?dāng)前像素點(diǎn)的作用（貢獻(xiàn)）[11]。該算法的算法復(fù)雜度為O（KN），其中K為原圖像總像素點(diǎn)數(shù)，N為考察的N*N的鄰域范圍。該算法原本用于人臉識(shí)別，后來(lái)被用于淋巴瘤細(xì)胞的自動(dòng)分析，Chekkoury[12]將該變換用于乳腺癌切片細(xì)胞的分割。

大部分細(xì)胞核的輪廓具有高度徑向?qū)ΨQ性，故本算法運(yùn)用該變換進(jìn)行細(xì)胞核定位。為定位細(xì)胞核，可以忽略梯度最大值信息，僅需要利用該算法計(jì)算圖像的方向投影圖。該算法尤其適用于細(xì)胞核和背景區(qū)域?qū)Ρ榷容^低的情況。

1.1.4 前景后景標(biāo)記與分水嶺分割

普通的分水嶺算法容易導(dǎo)致過(guò)分割，故在經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)處理之后，本算法運(yùn)用標(biāo)記控制的分水嶺算法進(jìn)行圖像分割[13]。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)選擇圖像的放大倍數(shù)，設(shè)定半徑的集合為N，得到的快速?gòu)较蜃儞Q結(jié)果S，再利用h最小值變換，得到S的局部最小值，得到的局部最小值點(diǎn)即為用作前景標(biāo)記的種子點(diǎn)。h最小值變換公式如下：

其中，ρ為形態(tài)學(xué)灰度重建的腐蝕算子，h為深度參數(shù)，該變換會(huì)壓縮所有深度小于h的點(diǎn)。

運(yùn)用分水嶺算法還需標(biāo)記出背景，本算法采用背景圖的形態(tài)學(xué)骨架作為背景標(biāo)記，得到圖像的前景后景標(biāo)記之后，通過(guò)在標(biāo)記處添加局部最小值改變Sobel梯度最大值圖像，該圖像是分水嶺分割的關(guān)鍵分割函數(shù)。

1.2 GVF Snake

分水嶺算法得出的細(xì)胞輪廓不一定準(zhǔn)確，故本文將改進(jìn)的分水嶺算法得出的細(xì)胞輪廓作為初始輪廓，通過(guò)基于梯度矢量流的主動(dòng)輪廓模型得到更為精確、平滑的細(xì)胞輪廓。

1.2.1 GVF Snake基本思想

Snake模型是圖像中一條表示突出形狀的曲線，可以用v（s）=（x（s），y（s） ），s∈（0，1）表示，該曲線在內(nèi)力和外力的共同作用下，朝著物體的邊界或感興趣的圖像特征移動(dòng)。內(nèi)力體現(xiàn)的是曲線本身具有的特性，如光滑性、連續(xù)性等，并根據(jù)所需特征計(jì)算外力，如邊緣等。

Snake的數(shù)學(xué)模型是個(gè)能量公式，此能量公式是根據(jù)Snake曲線上的點(diǎn)在物體邊界時(shí)該公式取得最小值而建立的。因此， 定位物體的邊界問(wèn)題則轉(zhuǎn)化為對(duì)能量公式求最小值的問(wèn)題，即一個(gè)內(nèi)力和外力平衡方程：

其中，f為邊緣圖f的梯度場(chǎng)；μ是控制GVF場(chǎng)光滑性的參數(shù)，可以根據(jù)圖片的噪聲確定，噪聲越大，μ越大。

利用歐拉方程解出GVF場(chǎng)，同樣通過(guò)最小化能量函數(shù)實(shí)現(xiàn)曲線的演化。

本文運(yùn)用梯度矢量流迭代計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的終止輪廓，步驟如下：①由圖像梯度求出邊緣圖；②迭代計(jì)算得到GVF全局變量u、v；③由每個(gè)細(xì)胞核初始輪廓上的點(diǎn)（x，y）迭代計(jì)算出終止輪廓上點(diǎn)的坐標(biāo)值（xsnake，ysnake ）；④在原圖上標(biāo)記最終輪廓。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

本文選擇顯微鏡放大40倍的H&E染色的肝癌組織病理學(xué)細(xì)胞圖像進(jìn)行分割，圖片大小為572×567像素。

在進(jìn)行形態(tài)學(xué)處理時(shí)，為達(dá)到消除毛刺且同時(shí)保留細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的目的，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終形態(tài)學(xué)處理灰度重建的結(jié)構(gòu)元素大小選擇為8，則閉操作的結(jié)構(gòu)元素大小設(shè)為一半，即為4。由于圖像中每個(gè)細(xì)胞核的半徑都在10個(gè)像素左右，故快速?gòu)较驅(qū)ΨQ變換的半徑參數(shù)R設(shè)為10。在GVF主動(dòng)輪廓模型中，為了得到精確的輪廓，迭代次數(shù)設(shè)為150；GVF光滑性參數(shù)μ越小，最終的圖案圓形度越好，但是光滑性會(huì)變差。鑒于細(xì)胞具有良好的圓形度，同時(shí)也需要得到較為光滑的輪廓，故設(shè)定μ為0.2；彈性參數(shù)α控制Snake曲線的張力，由于細(xì)胞的輪廓比較精細(xì)，故α取一個(gè)較小的值0.05；剛性參數(shù)β影響曲線硬度，一般設(shè)置為0；黏性參數(shù)設(shè)置為0.1，外部力權(quán)重k影響外部力的大小，設(shè)置為0.5。其中一幅肝癌細(xì)胞分割過(guò)程及結(jié)果如圖4所示。本文還對(duì)另10幅相同放大倍數(shù)的肝癌細(xì)胞組織病理學(xué)圖像進(jìn)行了分割，從分割結(jié)果可以看出，除個(gè)別細(xì)胞分割不準(zhǔn)確，以及個(gè)別粘連細(xì)胞沒(méi)有分割出來(lái)外，其它細(xì)胞的分割較為準(zhǔn)確，達(dá)到了較好效果。分析分割不準(zhǔn)確的區(qū)域，可以發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞分割錯(cuò)誤是細(xì)胞核周圍組織染色較深導(dǎo)致的。

其中，TP為分割正確的細(xì)胞個(gè)數(shù)，F(xiàn)P為分割出的錯(cuò)誤細(xì)胞個(gè)數(shù)，F(xiàn)N為未被分割出的細(xì)胞個(gè)數(shù)，X為人工分割的基準(zhǔn)圖像，Y為算法分割出的圖像。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)本算法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和召回率都很高，在0.9左右，證明本算法的定位精確性較高；Dice系數(shù)也在0.8左右，分割出的輪廓接近真實(shí)的細(xì)胞核輪廓。

3 結(jié)語(yǔ)

本文主要處理的是H&E染色的肝癌組織細(xì)胞圖像，提出了一種將分水嶺算法與主動(dòng)輪廓模型相結(jié)合的算法，并采用快速?gòu)较蜃儞Q這種新方法進(jìn)行種子點(diǎn)提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本算法在細(xì)胞的定位和分割方面具有較好的準(zhǔn)確性，克服了傳統(tǒng)分水嶺算法過(guò)分割的問(wèn)題，可以用于細(xì)胞核的輪廓提取與定位。但是本算法采集的圖像屬于輕度肝癌圖像，細(xì)胞分布密度較為稀疏，還需要采集細(xì)胞密度較高的圖像驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

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（責(zé)任編輯：黃 健）