李玉洋+辛寒曉+范學明+劉麗英+孫中濤

摘要：為提高水稻惡苗病生防菌多粘類芽孢桿菌SH15的固態(tài)發(fā)酵水平，以農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物——菌糠為主要培養(yǎng)基成分，以活菌數(shù)及芽孢數(shù)為指標，通過單因素試驗及響應面試驗對菌株SH15的最適工藝進行優(yōu)化。結果表明，菌株SH15最適工藝：菌糠20 g、麩皮8 g、初始含水量60.75%、硫酸錳0.50%、發(fā)酵溫度33.21℃、發(fā)酵時間144 h。在此條件下，發(fā)酵基質中多粘類芽孢桿菌SH15的活菌數(shù)、芽孢數(shù)、芽孢率分別為5.02×109 cfu/g、4.61×109 cfu/g、91.8%。此工藝為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定理論依據(jù)。

關鍵詞：固態(tài)發(fā)酵；菌糠；多粘類芽孢桿菌；工藝優(yōu)化

中圖分類號：S482.2+92文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0119-07

Abstract Paenibacillus polymyxa SH15 is a biocontrol strain against Fusarium moniliforme. In order to improve its solid fermentation level， the optimum technology was optimized by using single factor analysis and response surface experiment. The medium was mainly mushroom bran， and the bacteria and spore yields were used as indicators. The results showed that the optimal technology for SH15 was 20 g of mushroom bran， 8 g of wheat bran，60.75% of initial water content， 0.50% of manganese sulfate， and fermented at 33.21℃for 144 hours. Under these conditions， the living bacteria number， the number of spores and spore rates in Paenibacillus polymyxa SH15 fermentation substrate were 5.02×109cfu/g， 4.61×109cfu/g and 91.8%.

Keywords Solid state fermentation； Mushroom bran； Paenibacillus polymyxa

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科類芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生多肽抗生素、拮抗蛋白、植物激素等多種生物活性物質，具有促進植物生長、提高作物產(chǎn)量、防治植物病害的作用。據(jù)研究表明，多粘類芽孢桿菌對辣椒疫病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、番茄猝倒病等多種植物病害均具有良好的防治效果[1-4]，是一類極具開發(fā)前景和應用價值的促生細菌和生防細菌。現(xiàn)已作為微生物肥料用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，取得了良好的應用效果。目前，多粘類芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)主要采用液態(tài)深層發(fā)酵，雖然生產(chǎn)效率高，但設備投資大，技術要求高，后處理過程能耗高，并產(chǎn)生大量的廢水，污染嚴重。而固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基原料來源廣、價格低、水耗與能耗小、無廢水與廢渣排放、無環(huán)境污染，作為微生物菌劑的一種清潔生產(chǎn)方式，日益受到重視[5，6]。

多粘類芽孢桿菌SH15是山東農(nóng)業(yè)大學微生物工程實驗室從水稻惡苗病發(fā)病田健康植株根際土壤中分離、篩選獲得的一株有益芽孢桿菌。前期研究表明，菌株SH15對水稻惡苗病防效較高，且促進植株生長，目前已應用于微生物菌劑及微生物肥料制備生產(chǎn)中。

周榮華等[7]采用液態(tài)發(fā)酵法于5 t發(fā)酵罐中培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌NR1，芽孢數(shù)為5×108 cfu/mL；趙國群等[8]以新鮮梨渣為主要原料于500 mL燒杯中，采用固態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌D1，芽孢數(shù)為47.8×108 cfu/g。因此，為提高水稻惡苗病生防菌多粘類芽孢桿菌SH15的發(fā)酵水平，本研究采用固態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)。一直以來，我國是世界上最大的食用菌生產(chǎn)國，每年產(chǎn)量達2 260×104 t，占世界總產(chǎn)量的75%以上[9]。菌糠是食用菌采收后剩余的栽培基質，隨著我國食用菌種植規(guī)模擴大，菌糠的產(chǎn)生量日益增多[10]，是一種資源豐富的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物。但目前菌糠只有少量被利用，大部分都被丟棄或焚燒，造成嚴重的環(huán)境污染和資源浪費[11]。菌糠富含有機質，營養(yǎng)豐富，除含有豐富的食用菌菌體蛋白外，還含有大量的纖維素與半纖維素。為此，本研究以菌糠為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分，不僅可以降低生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益，還可以提高菌糠資源的綜合利用水平，減少環(huán)境污染。本研究通過單因素試驗及響應面試驗對多粘類芽孢桿菌SH15固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以期為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料 平菇菌糠由泰安市食用菌研究所提供，曬干后過20目篩，其粗纖維和蛋白質含量分別為31.3%和10.2%。麩皮購自泰安市農(nóng)貿(mào)市場，其淀粉和蛋白質含量分別為46.9%和15.7%。

1.1.2 菌種 多粘類芽孢桿菌（P.polymyxa）SH15：由山東農(nóng)業(yè)大學微生物學實驗室分離、鑒定并保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，pH 7.0，121℃高壓滅菌20 min。

三角瓶種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，pH 7.0，121℃高壓滅菌20 min。endprint

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：菌糠20 g，麩皮8 g，初始含水量60%。

1.2 試驗儀器

超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱，上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電熱恒溫水浴鍋JY5002、JA1003電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液的制備 種子活化：將多粘類芽孢桿菌SH15接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)：將活化的種子取1環(huán)接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)20 h，菌濃度為108cfu/mL。

1.3.2 菌糠與麩皮配比的選擇 將菌糠與麩皮以10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5等不同質量比進行混合，并分別稱取28 g放入500 mL三角瓶中，121℃滅菌60 min。接入10%的種子液，30℃恒溫培養(yǎng)72 h。發(fā)酵期間，每隔12 h搖瓶一次，發(fā)酵結束后，測定菌體生長量與芽孢數(shù)。重復3次。

1.3.3 發(fā)酵時間的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，按1.3.2進行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h取樣一次，測定菌體生長量與芽孢數(shù)，發(fā)酵156 h。重復3次。

1.3.4 初始含水量的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，控制不同的初始含水量，即40%、50%、60%、70%、80%等，按1.3.2進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間144 h，發(fā)酵結束后，測定菌體生長量與芽孢數(shù)。重復3次。

1.3.5 添加無機鹽的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，分別加入0.5%（w/w）氯化鈉、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀，以不添加任何無機鹽為對照，按1.3.2進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)144 h。測定菌體生長量與芽孢數(shù)，以評價上述無機鹽對菌體生長和芽孢生成的影響。并在此基礎上對最適無機鹽含量優(yōu)化，設0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%（w/w）5個濃度。

1.3.6 發(fā)酵溫度與裝瓶量的影響 菌糠發(fā)酵培養(yǎng)基調整為菌糠20 g、麩皮8 g，初始含水量60%、硫酸錳0.35 g。分別于不同溫度（25、30、33、36、39℃）與不同裝瓶量（20、28、40、50、60 g）的條件下進行單因素試驗，按1.3.2進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)144 h，發(fā)酵結束后，測定菌體生長量與芽孢數(shù)，以確定最佳發(fā)酵溫度與裝瓶量。

1.3.7 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，選取初始含水量、硫酸錳、發(fā)酵溫度3個影響較大的因素，以活菌數(shù)及芽孢數(shù)為響應值進行響應面試驗，試驗因素與水平如表1所示。

1.3.8 活菌數(shù)和芽孢數(shù)的計數(shù)方法 活菌計數(shù)方法：采用平板菌落計數(shù)法測定樣品中活菌數(shù)（cfu/g，以濕質量計）[12]。芽孢計數(shù)法：將待測樣品80℃水浴加熱15 min，殺死未產(chǎn)芽孢的細菌，然后再采用平板菌落計數(shù)法測定芽孢數(shù)（cfu/g，以濕質量計）[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0，處理間的差異顯著性分析采用Duncans新復極差法。

2 結果與分析

2.1 菌糠與麩皮比的影響

本試驗采用平菇菌糠作為培養(yǎng)基質。由于平菇菌絲體將基質中難溶性物質分解為可溶性物質，因而適合用作固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。麩皮是小麥面粉加工的副產(chǎn)物，含有較多的淀粉、蛋白質等營養(yǎng)物質，而且價格低廉。因此，在多粘類芽孢桿菌SH15固態(tài)發(fā)酵時，添加不同比例的麩皮，可以增加菌糠營養(yǎng)和提高菌糠的通透性。由圖1可知，純菌糠作為培養(yǎng)基發(fā)酵72 h時，多粘類芽孢桿菌SH15的活菌數(shù)僅為1.21×109 cfu/g，與純麩皮培養(yǎng)時的活菌數(shù)差異顯著（P﹤0.05），這表明單純的菌糠并不適合多粘芽孢桿菌SH15生長。隨著麩皮含量增加，活菌數(shù)大幅度升高，這表明麩皮可改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成，有利于菌體生長。當菌糠與麩皮的質量比為10∶4時，活菌數(shù)達最多，為2.08×109 cfu/g，而后降低。因此，宜選取菌糠與麩皮質量比10∶4作為最佳配比組合，進行下一步研究。

2.2 發(fā)酵時間的影響

從圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)逐漸增加，當發(fā)酵144 h時達到最大值，為2.69×109 cfu/g。發(fā)酵前72 h，沒有觀察到芽孢；當發(fā)酵96 h時，才有少部分菌體形成芽孢，芽孢率僅為23.1%；此后，芽孢數(shù)快速增加，144 h時達最多，為1.97×109 cfu/g。因此，多粘類芽孢桿菌SH15較適發(fā)酵時間為144 h。周榮華等[7]研究表明，多粘類芽孢桿菌NR1發(fā)酵40 h時，就能形成大量芽孢，而本研究中，多粘類芽孢桿菌SH15芽孢形成緩慢，這與趙國群等[8]研究相符，可能與固態(tài)發(fā)酵及菌種不同有關。然而，發(fā)酵時間長會造成生產(chǎn)效率低和增加染菌機率。因此，縮短多粘類芽孢桿菌SH15于菌糠發(fā)酵培養(yǎng)基上的發(fā)酵時間有待進一步研究。

2.3 初始含水量的影響

初始含水量是影響芽孢桿菌生長的重要因素之一，含量過高或過低，都不能使芽孢數(shù)量到達最大值。含水量較高時，基質多孔性降低，減少基質內氣體的體積和交換，還增加染菌機率；而含水量低時，基質膨脹程度低，微生物生長受抑制[14]。圖3表明，隨著初始含水量的增加，活菌數(shù)和芽孢數(shù)也逐漸增加，當初始含水量為60%時，活菌數(shù)及芽孢數(shù)最多，分別為2.69×109 、1.97×109cfu/g。超過60%時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)逐漸遞減。

2.4 無機鹽對芽孢形成的影響

芽孢不是細菌生活史中不可缺少的部分，而是在不適條件下，產(chǎn)芽孢桿菌形成的一種抗逆性休眠體。它的形成受很多因素影響，其中關鍵因素包括培養(yǎng)基中無機鹽的種類及含量。由圖4可知，添加無機鹽對菌體生長和芽孢形成影響較大。與未添加無機鹽的菌糠發(fā)酵培養(yǎng)基（對照）相比，添加氯化鈉、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀均可促進菌體生長，尤其硫酸錳，使活菌數(shù)增加了63.9%，達到了4.41×109 cfu/g。然而，無機鹽對芽孢形成的影響不同于對菌體生長的影響。添加氯化鈉、硫酸鎂及碳酸鈣抑制了多粘類芽孢桿菌SH15產(chǎn)芽孢，致使芽孢率明顯降低，而添加硫酸錳和磷酸二氫鉀可促進芽孢形成，尤其是硫酸錳，使得芽孢數(shù)達到4.23×109 cfu/g，芽孢率達到95.9%。所以選取硫酸錳作為無機鹽。endprint

由圖5可知，隨著硫酸錳用量增加，活菌數(shù)和芽孢數(shù)不斷增加，當硫酸錳用量為0.5%（w/w）時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)達最大，而后下降。所以選取硫酸錳最佳用量為0.5%。

2.5 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度是影響多粘類芽孢桿菌生長的重要因素之一。由圖6所示，在25～33℃范圍內，隨著溫度升高，活菌數(shù)和芽孢數(shù)都隨之增加，且發(fā)酵溫度為33℃時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)都到達最大值。當發(fā)酵溫度超過33℃時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)都顯著下降。這表明高溫不利于多粘類芽孢桿菌SH15的生長和芽孢形成。

2.6 裝瓶量的影響

多粘類芽孢桿菌是一類好氧微生物，溶氧對其生長及芽孢形成影響非常大[15]。固態(tài)發(fā)酵中，培養(yǎng)基裝瓶量直接影響氧氣供給。由圖7可知，隨著培養(yǎng)基裝瓶量的增加，活菌數(shù)和芽孢數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為裝瓶量增加，導致氧氣的供給減少。為此，在實際固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中，要特別注意氧氣的供給，控制好氧氣供給工藝參數(shù)。本研究選取較適宜的裝瓶量為28 g。

2.7 響應面試驗結果

響應面試驗結果如表2。采用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二元多項回歸擬合，獲得活菌數(shù)Y1和芽孢數(shù)Y2的二元多項回歸方程：

Y1=50.01+0.33A+0.065B+0.49C-0.26AB+0.98AC-0.46BC-3.55A2-2.90B2-8.78C2 ；

Y2=45.88+1.08A+0.19B+2.52C-0.053AB+0.95AC-0.28BC-6.25A2-5.57B2-11.01C2 。

方差分析結果如表3所示，活菌數(shù)和芽孢數(shù)的兩個回歸模型均高度顯著（P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），相關系數(shù)R2分別為0.9972和0.9950，R2adj分別為0.9936和0.9886，表明其擬合度和可信度均較高，能夠很好地對發(fā)酵過程進行描述及預測。模型的一次項C、交互項AC和二次項A2、B2、C2對活菌數(shù)的影響極顯著（P<0.01），一次項A、交互項BC對活菌數(shù)的影響顯著（P<0.05）；一次項A、C和二次項A2、B2、C2對芽孢數(shù)的影響極顯著（P<0.01），交互項AC對芽孢數(shù)的影響顯著（P<0.05）。

為了更直觀地反映各因素對響應值的影響，利用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制其響應面圖，如圖8和圖9所示。

等高線的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形代表兩因素交互作用顯著，圓形則相反。由圖8可知AC、BC交互作用顯著，AB交互作用不顯著；從圖9看出，AC交互作用顯著，AB、BC交互不顯著，均與表3方差分析結果一致，并且響應面曲面開口向下，存在最大值，說明最佳點在考察的區(qū)域內。根據(jù)響應面試驗結果對活菌數(shù)和芽孢數(shù)進行回歸分析預測，得優(yōu)化后結果為初始含水量60.75%、硫酸錳0.5%、發(fā)酵溫度33.21℃，在此條件下，活菌數(shù)及芽孢數(shù)分別為5.01×109cfu/g和4.60×109cfu/g。

2.8 驗證

采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進行3次驗證試驗，獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)分別為5.02×109、4.61×109 cfu/g。實際值與預測值較接近，說明模型能夠有效反映各篩選因素對響應值的影響。此外，本研究與趙國群等[8]利用梨渣為主要原料進行多粘類芽孢桿菌D1固態(tài)發(fā)酵獲得的活菌數(shù)5.09×109 cfu/g、芽孢數(shù)4.78×109 cfu/g的研究結果相接近。

3 結論

本研究以廉價的菌糠為主要成分通過單因素試驗及響應面試驗對多粘類芽孢桿菌SH15固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝為菌糠20 g、麩皮8 g、初始含水量60.75%、硫酸錳0.5%、發(fā)酵溫度33.21℃、發(fā)酵時間144 h。在此條件下，活菌數(shù)及芽孢數(shù)分別為5.02×109 cfu/g和4.61×109 cfu/g。本研究獲得了較高的活菌數(shù)及芽孢數(shù)，表明菌糠含有豐富的營養(yǎng)物質，是一個良好的固態(tài)發(fā)酵原料，適合培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌SH15。菌糠作為固態(tài)培養(yǎng)基成分，不僅解決其被大量丟棄造成的環(huán)境污染，而且降低了生產(chǎn)成本，增加了經(jīng)濟效益。

初始含水量對芽孢桿菌的生長影響較大，含水量過低，不利于菌體對營養(yǎng)物質的利用，過高則芽孢游離晚，發(fā)酵周期延長[16]。趙國群等[8]用梨渣、麩皮進行多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵，初始含水量為58.20%；而本研究最適含水量為60.75%，這可能與培養(yǎng)基成分有關。培養(yǎng)基中添加無機鹽對菌體生長和芽孢形成影響很大。趙國群等[8]研究表明，添加質量分數(shù)為0.50%磷酸氫二鉀極大地促進多粘類芽孢桿菌的生長及芽孢形成；而本研究則添加0.5%硫酸錳對多粘類芽孢桿菌的生長和芽孢形成促進明顯，這也可能與培養(yǎng)基成分有關。適宜的溫度對微生物生長至關重要。趙國群等[8]研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌在34℃生長較好；本試驗中，多粘類芽孢桿菌在33.21℃生長最好，二者研究結果相接近。

本研究只在實驗室用小體積法對多粘類芽孢桿菌SH15固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，優(yōu)化后的工藝成本低，為下一步中試生產(chǎn)提供依據(jù)。此外，優(yōu)化后的工藝是否符合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)還需要進行驗證。本研究將進一步對多粘類芽孢桿菌SH15固態(tài)發(fā)酵菌劑的田間應用進行研究。

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