武彬+劉雪蘭+石天虹+閻佩佩+倫忠杰+王昭霖+井慶川

摘要：為研究凝乳酶在334～343 K熱失活動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，利用Arrhenius方程，分別計(jì)算得到了不同溫度下，凝乳酶的熱失活速率常數(shù)k、半衰期t1/2，并最終計(jì)算得到了凝乳酶的失活活化能Ea為（539.58±1.55）kJ/mol。335～343 K時(shí)，數(shù)據(jù)線性回歸擬合結(jié)果較好，凝乳酶的熱失活符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。在較低的334 K時(shí)，失活速率常數(shù)的線性回歸分析擬合度較低，凝乳酶在保溫前期失活速率常數(shù)偏高，而后期偏低，曲線斜率前后差別顯著，提示凝乳酶的熱失活可能存在中間過(guò)渡產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：凝乳酶；熱失活動(dòng)力學(xué)；熱穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：S879.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）12-0110-04

Abstract To study the thermal deactivation kinetics behavior of rennin， the Arrhenius equation was used to obtain the deactivating rate constant （k） and half-life （t1/2） at different temperatures （334～343 K）. Then， the activation energy （Ea） of deactivated rennin was obtained， which was （539.58±1.55） kJ/mol. When the temperature was in the range of 335～343 K， the deactivating rate constants could be well fitted with linear regression， which suggested that the deactivation of rennin was in accordance with the first-order kinetics model. At the lower temperature of 334 K， the curve of deactivating rate constant had lower linear fitting degree. The deactivating rate constant was on the high side at earlier stage but on the low side at later stage of heat preservation， and the curve slope was significantly different between earlier and later stages， which indicated that transition-state intermediate might be existent in the deactivation process of rennin.

Keywords Rennin； Thermal deactivation kinetics； Thermostability

凝乳酶是從小牛皺胃中發(fā)現(xiàn)的一種酸性天門冬氨酸蛋白酶，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵，產(chǎn)物之一的副κ-酪蛋白凝結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并在Ca2+存在的情況下使牛奶凝結(jié)[1]。凝乳酶是制作乳酪必需的酶制劑，但必須在凝乳完成后進(jìn)行加熱滅活，以盡量降低凝乳酶的蛋白酶活力，否則會(huì)使乳酪出現(xiàn)苦味和質(zhì)構(gòu)缺陷[2，3]。

小牛皺胃凝乳酶一直是乳酪生產(chǎn)所用的酶制劑，但其產(chǎn)量有限。因此，研究者分別從動(dòng)物、植物、微生物中[4-6]，以及利用基因重組等方法尋找凝乳酶的低成本替代品。不同來(lái)源的凝乳酶熱穩(wěn)定性有一定差別，Mohanty等[4]從水牛胃中提取到的凝乳酶熱穩(wěn)定性高于小牛凝乳酶。本課題組以畢赤酵母表達(dá)的微小毛霉凝乳酶在55℃保溫20 min就會(huì)完全失活[7]。為了深入研究凝乳酶耐熱性的差異，以及為乳酪生產(chǎn)提供指導(dǎo)，有必要準(zhǔn)確測(cè)定凝乳酶的熱穩(wěn)定性。

失活動(dòng)力學(xué)是研究酶熱穩(wěn)定性的經(jīng)典方法[8]，熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)（熱失活速率常數(shù)、半衰期以及失活活化能等）能夠更準(zhǔn)確、更直觀地反映酶的熱穩(wěn)定性，常用于不同狀態(tài)下酶熱穩(wěn)定性的比較。如：Gouda等[9]研究了葡萄糖氧化酶的熱失活作用，以及不同無(wú)機(jī)鹽提高其熱穩(wěn)定性的機(jī)理。劉晶萍等[10]采用失活動(dòng)力學(xué)方法比較了果膠酶在溶液中和棉織物上的熱穩(wěn)定性。李君蘭等[11]測(cè)定了鮮棗脂氧合酶的熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并與甜玉米進(jìn)行了對(duì)比。張東浩等[12]在失活動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，詳細(xì)研究了海藻糖對(duì)脂肪酶的保護(hù)機(jī)理。本研究通過(guò)測(cè)定334～343 K條件下凝乳酶活力隨時(shí)間的變化情況，并根據(jù)Arrhenius方程計(jì)算得到凝乳酶的熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以便用作與其他來(lái)源凝乳酶熱穩(wěn)定性的比較，同時(shí)為乳酪生產(chǎn)過(guò)程中凝乳酶滅活工藝的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

凝乳酶購(gòu)自Sigma公司；脫脂奶粉購(gòu)自伊利實(shí)業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凝乳酶活力測(cè)定 凝乳酶活力測(cè)定采用Arima法[13]：凝乳酶用0.02 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋800倍，凝乳時(shí)間為40 s，將其作為初始酶液。取初始酶液0.5 mL，35℃預(yù)熱5 min后加入到5 mL 35℃預(yù)熱的pH 6.0、含1%CaCl2的10%脫脂牛乳中，計(jì)時(shí)至管壁出現(xiàn)顆粒，記錄凝乳時(shí)間（t）。以35℃ 40 min凝乳1 mL的酶量為1個(gè)酶活力單位（1 U）。其活力計(jì)算公式如下：

凝乳酶活力A=5×24000.5×t×n 。 （1）endprint

式中：A為凝乳酶活力，U；t為凝乳時(shí)間，s；n為稀釋倍數(shù)，本試驗(yàn)為1。

1.2.2 凝乳酶熱失活測(cè)定 1.5 mL離心管中加入0.6 mL凝乳酶液，放入水浴鍋中立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，水浴完成后立即轉(zhuǎn)入冰水中快速降溫至0℃，然后取0.5 mL酶液測(cè)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝乳酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，凝乳時(shí)間>40 s時(shí)，凝乳酶濃度與酶活力線性關(guān)系較好。將初始酶液繼續(xù)稀釋，使凝乳時(shí)間在40～600 s。以凝乳酶活力對(duì)初始酶液濃度作圖，得到凝乳酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線A=601.7X+9.658（R2=0.9990）（圖1）。

2.2 凝乳酶相對(duì)酶活的測(cè)定

凝乳酶在不同溫度保溫一定時(shí)間后殘余相對(duì)活力的計(jì)算公式為：

Ar=ApA0×100% 。 （2）

式中：Ar為保溫一定時(shí)間后凝乳酶殘余的相對(duì)酶活，%；Ap為保溫一定時(shí)間后凝乳酶的殘余活力，U；A0為未經(jīng)保溫的凝乳酶活力，U。

凝乳酶活力隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，溫度越高酶的失活速度越快。334 K保溫360 min，凝乳酶活力仍保留36.9%；而343 K保溫8 min已檢測(cè)不到酶活力（圖2）。

2.3 凝乳酶熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

在熱失活動(dòng)力學(xué)研究中，熱失活速率常數(shù)（k）、失活半衰期（t1/2）和失活活化能（Ea）是表征酶熱穩(wěn)定性的三個(gè)重要參數(shù)。不同溫度下的失活速率和半衰期反映生物酶失活快慢，熱失活活化能反映酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)弱。

當(dāng)凝乳酶的失活遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)時(shí)，則：

lnAr對(duì)保溫時(shí)間t作圖，結(jié)果如圖3所示。線性回歸的斜率即為熱失活速率常數(shù)的相反數(shù)（-k）。

凝乳酶半衰期的計(jì)算公式為：

根據(jù)（4）和（5）得到凝乳酶在不同溫度的熱失活速率常數(shù)k、線性回歸的相關(guān)系數(shù)R2以及半衰期t1/2（表1）。其中，335～343 K的線性回歸擬合結(jié)果較好，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。在較低的334 K擬合度不佳，其失活速率常數(shù)曲線，在90 min前后分為斜率不同的兩段，這表明凝乳酶在334 K的失活不符合一步失活反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。因此，在計(jì)算失活活化能時(shí)，不將該點(diǎn)計(jì)算在內(nèi)。

式中，T為反應(yīng)的絕對(duì)溫度，K；Ea為失活活化能，J/mol；R為氣體常數(shù)。以lnk對(duì)1/T作圖，通過(guò)直線的斜率可計(jì)算得到失活活化能Ea為（539.58±1.55） kJ/mol。

3 討論與結(jié)論

蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵、疏水作用、分子間作用等作用力維持著蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。酶的熱失活過(guò)程主要原因是由于分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，酶分子的結(jié)構(gòu)或者構(gòu)象被破壞，蛋白質(zhì)鏈松散化，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，導(dǎo)致了酶催化功能的喪失[14]。凝乳酶在334～343 K的失活速率差異極大，在334 K保溫360 min凝乳酶活力仍可保留36.9%；而在343 K保溫8 min，已檢測(cè)不到酶活力。以相對(duì)酶活的對(duì)數(shù)lnAr對(duì)保溫時(shí)間t作圖，335～343 K線性回歸擬合較好，說(shuō)明在該溫度范圍內(nèi)，凝乳酶的熱失活符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，其斜率即為熱失活速率常數(shù)的相反數(shù)（-k）。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Arrhenius方程，計(jì)算得到了凝乳酶的失活活化能Ea為（539.58±1.55） kJ/mol。

然而，該方法僅適用于較高溫度下凝乳酶熱失活性質(zhì)的表征。在335 K凝乳酶熱失活速率常數(shù)曲線的擬合度有所降低，而334 K線性回歸相關(guān)指數(shù)只有0.8325，該曲線分成了斜率不同的兩段。根據(jù)張東浩等[12]采用的二步失活動(dòng)力學(xué)模型擬合不符合一步失活動(dòng)力學(xué)模型的數(shù)據(jù)，取得了較好的結(jié)果，其模型如下：

Ek1E1k2E2

該模型能夠較好地解釋334 K凝乳酶的熱失活速率常數(shù)曲線擬合的結(jié)果，提示凝乳酶的熱失活可能存在中間過(guò)渡產(chǎn)物。根據(jù)二步失活動(dòng)力學(xué)模型，分子熱運(yùn)動(dòng)能部分破壞凝乳酶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使凝乳酶由初始狀態(tài)E，轉(zhuǎn)變?yōu)槿钥杀３忠欢ù呋δ艿呋氏陆档腅1。在較高溫度下，分子熱運(yùn)動(dòng)十分劇烈，使凝乳酶分子內(nèi)外界面基團(tuán)和水分子形成的氫鍵和其他次級(jí)鍵快速斷裂，E1催化活力也快速喪失，此時(shí)k2>>k1，中間產(chǎn)物E1對(duì)酶活力的影響較小。當(dāng)溫度較低時(shí)，k2

參 考 文 獻(xiàn)：

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