杜宇鑫　程英曜

杜宇鑫，陳英曜，葉楓，俞超

摘要：柑桔黑斑病是一種真菌型致病菌引起的高發(fā)性病害，對柑桔產(chǎn)業(yè)的危害極大。本文綜述總結了黑斑病病原菌的發(fā)現(xiàn)、檢測方法，以及遺傳多樣性分析技術，以期為該病的預防診斷提供參考。

關鍵詞：柑桔；黑斑病；病原菌；研究進展

柑桔是全球重要的水果品種之一，我國也是柑桔的種植地，種植柑桔品種繁多。柑桔黑斑?。–itrus Black Spot，CBS）是一種針對柑桔發(fā)作的真菌型病害，主要危害果實和葉片產(chǎn)生褐色或黑色病斑，CBS是柑桔產(chǎn)地的高發(fā)性病害。近年來，隨著柑桔出口量的增長和感病品種的推廣，CBS問題日益突顯。但國內，有關CBS的研究報導較少，本文就黑斑病病原菌的發(fā)現(xiàn)、檢測方法及遺傳分析進行歸納分析，希望對后續(xù)該病害的防治有所幫助。

1病原菌的發(fā)現(xiàn)

1895年，Benson初次在澳大利亞一柑桔園中發(fā)現(xiàn)CBS，并發(fā)表CBS病果的圖片。1948年，Kiely在澳大利亞東南部發(fā)現(xiàn)CBS病菌為柑桔球座菌并命名為Guignardia citdcarpa Kiely，該病菌屬子囊菌門、腔菌綱、座囊菌目、座囊菌科、球座菌屬。Mcalpine初次將該病害病原鑒定為柑桔莖點霉Phoma citricmpa McAlpine。1973年，Van der Aa經(jīng)過翻閱資料和從新檢測模式菌，將柑桔莖點霉歸到葉點霉屬，重新命名為柑桔葉點霉菌Phyllosticta citricarpa McAlpine VanderAa。因國外發(fā)現(xiàn)并研究較早，所以對國內研究帶來諸多便利條件。

1919年日本學者澤田兼吉在臺灣澤田兼吉發(fā)現(xiàn)CBS，隨后Lee報導了我國南部地區(qū)CBS調研情況。Fawcett在1936年記錄CBS在我國福建、云南、浙江等主要產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)。朱偉生和曾憲銘對引起CBS的病原菌先后做了全面報導。肖育貴、呂良瓊等對檸檬黑星病病原菌進行系統(tǒng)研究，認為誘發(fā)檸檬黑斑病的病原是球殼孢目科莖點霉屬的真菌（Phoma catracarpa）。蒲占清等對浙江臺州地區(qū)CBS的發(fā)生情況進行了調查研究，發(fā)現(xiàn)臺州黃巖地區(qū)CBS染病比較普遍，其中當?shù)卦缃邸⒙酆忘S巖蜜柑染病較嚴重。

2病原菌的檢測

2.1形態(tài)鑒定

柑桔果皮病斑的分生孢子和孢子器的顯微形態(tài)可作為鑒定柑桔葉點霉的根據(jù)。如果病斑上有分生孢子器，可直接用顯微鏡檢查其分生孢子器和分生孢子特征；如無分生孢子器，則可誘導帶病斑的果皮形成分生孢子器。但誘導產(chǎn)生分生孢子器至少需要5d。鑒定柑桔葉點霉可從病灶組織中分離培養(yǎng)并在特定培養(yǎng)基上形成具有特征性的菌落和分生孢子。但是，病菌培養(yǎng)緩慢，生長出典型的菌落至少需要2～3d，分離過程中常常受生長較快的其余類真菌的污染。而且，果實上的內生菌P.capitalensis也會干擾依據(jù)培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)的診斷。這些傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法不但需要熟練的技術人員操作，而且耗時耗力，操作相對隨機。許多植物病原菌在侵染后具有相似的癥狀，這給識別病原菌帶來困難，不夠準確，需要多種方法來做同一檢測”。

產(chǎn)生類似CBS的病斑也有其他真菌或昆蟲的侵害的可能性。這些因素對依據(jù)癥狀診斷CBS帶來困難。故開發(fā)了一些較為準確、高效的分子鑒定方法。

2.2分子檢測

2.2.1基于ITS序列的PCR檢測。基于種群特異性的ITS序列PCR檢測對于黑斑病已經(jīng)成為當前標準的檢測方法。

Bonants等分析病原菌（P.citdcarpa）和非致病病原菌（P.capitalensis）的ITS區(qū)域，分別設計出特異性引物GCF3/GCR7和GCF2/GCR4。特異性引物GCF3/GCR7可以鑒定出60%～70%沒有分生孢子器的病斑，鑒定出90%具有分生孢子器的病斑。為了更快地區(qū)分這2個種，Meyer等發(fā)明了一天快速區(qū)分2個種的方法，通過分析ITS區(qū)域設計了針對于致病病原菌的特異性引物CITRIC1/ITS4 580bp，針對于非致病病原菌的特異性引物CAMEL2/ITS4 430bp，利用設計好針對不同種的特異性引物可以在短時間內快速鑒定病原菌。為提高鑒定病原菌的效率，Peres等在對比之前設計的種特異性引物發(fā)現(xiàn)P.citricarpa特異性引物CITRIC1/ITS4不能擴增出單個病斑提取的病原菌DNA，即檢測靈敏度較低。因此在ITS區(qū)域設計了靈敏度高、特異性好的特異性引物GCN/GCMR，該引物可以擴增單個病斑提取的病原菌DNA，該靈敏度分別是引物GCF3/GCR7和CITRIC1/ITS4的10倍、100倍。

基于ITS序列的PCR檢測方法無法準確無誤地鑒定該菌。故出現(xiàn)基于RAPD的檢測方法。

2.2.2 qPCR檢測方法。定量聚合酶鏈式反應（qPCR）是當今世界用于最先進核酸分子診斷技術之一，具有操作簡單、檢測時間短、精度高等特點，已被廣泛用于定量化檢測真菌病原菌。

Brouwershaven等用PCR和qPCR檢測技術對采用不同方法提取的病源菌DNA進行ITS序列的檢測，結果發(fā)現(xiàn)qPCR的檢測精確度最高，可以檢測較低濃度的柑桔黑斑病病原菌DNA。為了得到致病菌和非致病菌準確且快速高效檢測，van GENT-PELZER等在ITS區(qū)域設計探針，利用qPCR的方法區(qū)分P.cilri-carpa和P.Capitalensis，特異性和靈敏度都優(yōu)于普通PCR方法。Stringari等在隨機擴增多態(tài)性DNA標記技術（RAPD）的基礎上設計出針對P.citricarpa的特異性引物。

由于基于qPCR的檢測技術精度較高而被專家學者采用，但其依然存在對儀器設備要求高、需要采用熒光染料和對引物要求高等弊端。

3病原菌遺傳多樣性分析

3.1 RAPD分子標記技術

柑桔葉點霉會導致果皮呈現(xiàn)黑色病斑。因病斑與柑桔球座菌誘發(fā)的病斑類似，所以Danyelle等對收集的樣本進行擴增DNA（RAPD）和序列的擴增區(qū)域特征分析（SCARS），結果表明這2種方式都能有效地區(qū)別致病菌和非致病菌在形態(tài)學上十分相似的病菌。

Possiede等用RAPD技術對已具有苯菌靈（Benomyl）抗性的柑桔球座菌進行檢測，猜想可能由于菌株擁有復雜的基因從而使該菌株對苯菌靈產(chǎn)生抗性。此外，Chirlei和Tedford等通過RAPD分析研究柑桔球座菌發(fā)現(xiàn)病菌的基因相似程度與寄主不相關，Ricardo等用熒光素標記的選擇性擴增片段長度多態(tài)性技術（Fluorescent Amplified Fragment Length Poly-morphism，fAFLP）對疑似CBS樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)CBS致病病菌和非致病病菌發(fā)源于共同的祖先，但環(huán)境等因素會引發(fā)其進化。

基于RAPD檢測雖然有操作方便、不需要基因克隆、靈敏度好，能表現(xiàn)出豐富的多態(tài)位點等優(yōu)點，但也有諸多弊端，例如模板濃度、PCR的循環(huán)次數(shù)等都會因RAPD的檢測重復性差而導致失敗。

3.2 AFLP分子標記技術

擴增片段長度多態(tài)性技術（AFLP）并連系限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記技術（RFLP）和PCR技術優(yōu)點，同時兼?zhèn)淞烁咝?、可靠性、可重復性和所需DNA微量性的優(yōu)點。Baayen等利用限制性內切酶Mspl和EcoRI用AFLP技術對樣本進行分析得出與ITS序列的結果相同并確定出柑桔球座菌。

AFLP分子標記技術雖然具有RAPD和RFLP穩(wěn)定性高的優(yōu)點，但也需要較高的純度和反應條件。所以也可采取第2代ISSR標記技術。

3.3 ISSR分子標記技術

Zietkeiwitcz等建立一種在微衛(wèi)星基礎上的分子標記技術（ISSR）。為得到柑桔葉點霉菌種遺傳多樣性分析的ISSR反應的合適體系，王興紅等針對一系列影響較大的因素對ISSR反應體系進行優(yōu)化。

與之前方法相比，不需了解物種遺傳背景、操作便捷、引物設計簡單以及成本低廉都是ISSR分子標記技術的優(yōu)勢。但該技術缺點則是易受許多因素的干擾，在不適宜的條件下會導致圖譜拖帶、擴增條帶彌散甚至消失，嚴重影響后期的鑒定和分析。因此在ISSR技術進行分析之前，需要找到適合的條件，以確保試驗的準確性。盡管此標記方法弊端較多但也在諸多方面體現(xiàn)出其優(yōu)于其他技術標記手段的方面，并且為今后采用ISSR分子標記技術對遺傳多樣性的分析打下堅實理論和技術的基礎。

4展望

早期的形態(tài)學鑒定雖具有直觀便捷的優(yōu)勢，但在準確分析判定和區(qū)分方面依然存在很大弊端，雖然分子檢測技術的推廣鑒定CBS上升了一個臺階，但由于各種檢測技術都存在其自身的利弊，所以今后在研究和鑒定CBS時應選取適合的技術。

目前大多數(shù)柑桔產(chǎn)區(qū)在病害暴發(fā)時噴灑化學農(nóng)藥?；瘜W農(nóng)藥有無法在自然界中降解毒性并損害人們身體的弊端。在未來應更深入地開展研究，尤其是在抑菌方向可篩選一些天然提取物制成更科學更綠色更健康的生物農(nóng)藥，并在一定程度上能夠抑制CBS的生長，不但為農(nóng)民的經(jīng)濟收益帶來保障，而且為保護環(huán)境作出重要貢獻，也對黑斑病的研究和防治提供更多參考和幫助。