陳均 項一丹 王梓茂

摘要：熒光原位雜交（FISH）分子技術(shù)目前在腫瘤檢測、產(chǎn)前診斷及血液類疾病治療等應(yīng)用越來越普遍，因其觀測結(jié)果客觀、準確，很受臨床檢測部門青睞。但是FISH技術(shù)的成本并不低，樣本還處于人工處理為主的階段，工作強度大，人員素養(yǎng)要求高，極大妨礙了FISH技術(shù)的推廣和普及。通過對樣本處理工藝的研究，本文基于單片機STM32F107為主控芯片提出設(shè)計一種高通量自動脫蠟設(shè)備，以STM32F103為電機驅(qū)動板芯片，控制三軸位移平臺按照實驗流程依次將樣本切片移動到指定的試劑缸中反應(yīng)，實現(xiàn)樣本切片的自動脫蠟處理。

關(guān)鍵詞：STM32；脫蠟；自動化； 高通量；精確控制

中圖分類號：TP311 文獻標識碼：A 文章編號：1009-3044（2018）29-0235-04

Abstract： Fluorescence in situ hybridization （FISH） molecular technology is increasingly used in tumor detection， prenatal diagnosis and treatment of blood diseases. Because of its objective and accurate observation results， it is very popular among clinical testing departments. However， the cost of FISH technology is not low， and the sample is still in the stage of manual processing. The work intensity is high and the personnel literacy requirements are high， which greatly hinders the promotion and popularization of FISH technology. Based on the research of sample processing technology， this paper proposes a high-throughput automatic dewaxing device based on STM32F107 as the main control chip. The STM32F103 is used as the motor driving chip. The three-axis displacement platform is controlled to move the sample slice to the experimental flow. The reaction in the designated reagent cylinder enables automatic dewaxing of the sample sections.

Key words： STM32； dewaxing； automation； high throughput； precise control

組織石蠟切片的常規(guī)脫蠟方法是人工將切片依次放入裝有不同試劑的試劑缸中進行脫蠟處理。該脫蠟方法中不僅操作煩瑣，需要多個反應(yīng)腔體，而且需要有專人進行操作，容易出現(xiàn)操作順序錯誤。為了改善這種情況，到目前為止，改良的脫蠟方法有通過蠕動泵抽送，或通過對腔體抽真空來完成試劑更換，但這些方法都還是存在制作成本高的缺點。目前國內(nèi)社區(qū)醫(yī)院及生物研究所對切片進行脫蠟的手段大部分都是人工在操作，脫蠟設(shè)備步驟煩瑣，使用的試劑部分對人體有傷害，這樣使得在操作中如有步驟的遺漏或是試劑的混用將會導(dǎo)致脫蠟的失敗。為了防止在切片脫蠟中實驗人員對切片的煩瑣操作導(dǎo)致切片的不均一性及不成功，提高脫蠟效率，保證脫蠟質(zhì)量，實現(xiàn)全自動脫蠟，已成為未來病理檢測和各個社區(qū)醫(yī)院及生物研究所的迫切需要和技術(shù)發(fā)展趨勢。在這樣的環(huán)境下致使我們開發(fā)了一套能夠?qū)M織切片進行脫蠟、蛋白酶消化等過程的自動化設(shè)備。

1高通量自動脫蠟儀整體設(shè)計

系統(tǒng)采用一主多從的樹形架構(gòu)。主控板以STM32F107為控制核心，通過總線通信組織協(xié)調(diào)各子板共同完成整個系統(tǒng)的業(yè)務(wù)功能。系統(tǒng)包含兩類共四個從機模塊：X軸電機驅(qū)動、Y軸電機驅(qū)動、Z軸電機驅(qū)動、溫度控制模塊，各從機模塊均以STM32F103為核心，分別完成步進電機驅(qū)動和溫度控制的功能。通過一主多從的協(xié)調(diào)配合，系統(tǒng)能夠穩(wěn)定高效地完成所有動作。另外，本課題開發(fā)了一套串口屏程序，提供良好的人機交互操作。

2 機械設(shè)計

2.1 三軸位移平臺

本設(shè)計中三軸位移平臺主要用于承載機械臂勾手進行定位，使勾手能夠準確地移動到染色架下方將其提起，因此三軸位移平臺的負重比較小，采用懸臂式結(jié)構(gòu)，能夠讓整個設(shè)備的結(jié)構(gòu)更加輕便，與此同時也起到了節(jié)約成本的作用。其中，X軸安裝在設(shè)備背板處，Y軸通過滑塊和X軸連接在一起，Z軸同樣是固定在Y軸的滑塊上。機械臂勾手固定安裝在Z軸的滑塊上，利用這一套三軸位移平臺，機械臂勾手可以運動到行程內(nèi)的任意位置鉤取及放置染色架，從而實現(xiàn)樣本切片與不同試劑的反應(yīng)。

2.2 反應(yīng)缸

為了實現(xiàn)樣本切片的高通量處理，本設(shè)備中的反應(yīng)缸設(shè)計有4個放置染色架的工位，因此便具備了同時處理最多96片樣本的條件。由于脫蠟反應(yīng)過程中的脫蠟劑具有很強的腐蝕性，因此存放脫蠟劑的不銹鋼反應(yīng)缸必須鍍有特氟龍涂層才能保證正常使用。本設(shè)備中共使用了12個反應(yīng)缸，其中4個反應(yīng)缸中存放的試劑需要加熱，因此需要在其表面貼上加熱膜以及連接溫度傳感器，故而這四個反應(yīng)缸的排廢只能通過在其底部打孔通過蠕動泵抽取來實現(xiàn)。

2.3 整體結(jié)構(gòu)

完成了各功能模塊的設(shè)計后，開始進行設(shè)備的整體框架堆疊。根據(jù)設(shè)備的功能需求，我們考慮將其設(shè)計成雙層的結(jié)構(gòu)。打開設(shè)備蓋子后，用戶可看到表層放置有12個反應(yīng)缸，在設(shè)備開啟之前，用戶可將試劑倒入反應(yīng)缸中，并將裝有樣本切片的染色架放在反應(yīng)缸的指定工位，之后通過程序控制三軸位移平臺的移動即可將樣本切片按照預(yù)設(shè)流程移動到指定的染色缸中進行反應(yīng)。在設(shè)備底層中放置了對反應(yīng)缸進行排廢處理的蠕動泵，而右側(cè)則是電源及電路板的安裝固定位。這種設(shè)計能夠較好地避免設(shè)備發(fā)生試劑外泄時引起的短路以及元件的腐蝕損壞，防止發(fā)生安全事故。

3高通量自動脫蠟儀硬件電路設(shè)計

3.1 主控板電路設(shè)計

3.1.1 最小系統(tǒng)

和51單片機相同，STM32單片機的最小系統(tǒng)同樣包含有復(fù)位電路以及晶振時鐘電路。復(fù)位電路是在單片機啟動時能夠?qū)⒃鱾€部件都設(shè)置為初始狀態(tài)，并由初始狀態(tài)開始進行工作。在設(shè)計中采用RC按鈕式復(fù)位電路。時鐘電路對于某些單片機來說可有可無，因為部分單片機內(nèi)部有集成的振蕩電路，不接外部晶振也可以，但是精度比較低，可以用來進行低速通信或者信號處理。而在沒有集成時鐘電路的芯片中，則必須要外接時鐘晶振源。為了使系統(tǒng)更加穩(wěn)定可靠，這里使用外部時鐘電路。如下圖所示：

3.1.2 電源模塊

本系統(tǒng)中所要使用的電壓有+3.3V、+24V。+24V市場可以直接采購，而+3.3V則需要DC-DC芯片轉(zhuǎn)換得到，這里采用的是逐級降壓方式達到+3.3V，即提供了+5V電壓又可實現(xiàn)+3.3V的輸出。首先使用LM2596-5將電壓降至+5V，然后再使用ASM1117-3.3V穩(wěn)壓芯片將+5V穩(wěn)至+3.3V。電源電路根據(jù)各個穩(wěn)壓芯片的推介電路設(shè)計完成，電路中輸入是通過電容來完成電壓的濾波功能，輸出處電感與電容則是用來減小輸出電壓紋波，在24-5V電源中由于LM2596-5是開關(guān)型降壓調(diào)節(jié)器，當通電時電流正常流過，當關(guān)閉時電感里儲存的電需要放掉，連接了一個二極管放電，保證電路不斷電，所以該二極管又叫作續(xù)流二極管。電路板如圖6所示。

3.1.3 串口通信模塊

對于一個系統(tǒng)而言，與外界的通信顯得尤為重要，不僅可以獲取外界所發(fā)的指令或信號，也可給向外部傳達消息。這里采用的是基于串口通訊接口的RS485和RS232的通訊。串口中有三種通訊方式，分別是單工，顧名思義就是只能朝著一個方向傳輸；半雙工，可以雙向通訊，但同一時刻一個信道只允許朝著一個方向傳輸和全雙工，在任意時刻可以同時發(fā)送和接收。本文STM32F107芯片一共有5個USART是一個全雙工通用同步/異步串行收發(fā)模塊，這里使用USART1與顯示屏通信，電路原理圖如圖7所示。

3.2溫控板電路設(shè)計

高通量脫蠟儀的溫控板主要功能是調(diào)節(jié)試劑溫度，使得在試劑在參加反應(yīng)的時候達到所需要的溫度。溫控板與主板之間采用CAN總線通信，通過DS18B20采集實時溫度，通過調(diào)節(jié)PWM波的占空比調(diào)節(jié)輸出功率，達到溫度穩(wěn)定控制的目的。根據(jù)加熱塊的材料以及和設(shè)定溫度和當前溫度的差值設(shè)定合適的快速升溫速率。

3.2.1 DS18B20溫度采集

DS18B20采用5V供電，可以將DS18B20與主控芯片直接連接，通過讀寫操作進行讀取溫度值。

3.2.2溫度控制

整個溫度控制的過程，可以根據(jù)經(jīng)驗或者實驗或者程序自整定出合適的加熱曲線，在整個加熱曲線的設(shè)置過程中，由于一些物質(zhì)溫度變化的滯后性，可能會導(dǎo)致溫度控制不準確，以及最后溫度穩(wěn)定精度。為了使得溫度在盡短的時間內(nèi)升到需要的溫度，并且能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)，在加熱的初期，一般采用快速加熱，并且溫度采樣周期盡可能快，形成快速的閉環(huán)反饋，不至于溫度超調(diào)，在中期縮減加熱速度，使得文段達到比較穩(wěn)定的狀態(tài)，再緩慢升溫。

如圖9所示，通過改變PA6端口輸出的PWM波的占空比，調(diào)節(jié)MOS管的導(dǎo)通和關(guān)斷時間，控制加熱塊的工作時間，達到溫度調(diào)節(jié)的目的。由于加熱塊所需工作電流較大，一般不采用直接用芯片直接驅(qū)動，而是使用大功率MOS管，間接控制加熱塊。

3.3電機驅(qū)動板電路設(shè)計

該芯片包含了邏輯模塊和功率模塊配合簡單的外圍電路即可實現(xiàn)步進電機的驅(qū)動功能，電路設(shè)計十分簡單，最低低至兩路信號（脈沖、方向）控制即可。參考芯片的推薦電路及現(xiàn)有的驅(qū)動板電路，設(shè)計的電路原理圖如圖10所示，主要包含細分電路，是由一個3位撥碼開關(guān)控制電機的8種細分；電位器，調(diào)整驅(qū)動電流的大小和衰減模式選擇電壓；正反轉(zhuǎn)控制端口；一路脈沖輸入端口；電機接線端。電機驅(qū)動板作為設(shè)備的一個子板，與主板之間采用CAN總線通信。

4 高通量自動脫蠟儀的軟件設(shè)計

軟件設(shè)計主要以脫蠟處理流程為中心，通過運動控制切換不同試劑與切片進行反應(yīng)，輔助以溫度控制。通過上位機發(fā)送命令，下位機接收到命令，并對上位機發(fā)送的命令進行判斷，如果命令沒有錯誤，再對命令解碼，然后執(zhí)行相對應(yīng)的硬件動作。上位機開發(fā)是基于串口屏，串口屏具有良好的人機交互界面，能夠很直觀簡潔地讓用戶進行操作。下位機程序的開發(fā)是基于 Keil μVision5 平臺，包括了 STM32F107 和 STM32F103 兩款芯片，能夠很好地融合。

下位機程序以完成整個脫蠟流程為主要目的，配合溫度控制程序?qū)崿F(xiàn)整個實驗所需要的溫度條件。下位機的程序主要包括接收來自顯示屏的操作指令和根據(jù)實驗流程給其他子板發(fā)送命令。整個下位機程序以脫蠟實驗流程為主要功能，包括初始化、烤片、脫蠟、通透、酶消化、洗滌、脫水和干片幾個步驟，每個步驟對應(yīng)相應(yīng)的試劑位置，程序運行到相應(yīng)流程時，通過控制三軸運動，使得樣本切片運動到指定區(qū)域，完成實驗流程。

顯示屏主要是顯示一些基本參數(shù)以及供用戶設(shè)置參數(shù)，作為人機交互的直接媒介，對于用戶的使用體驗至關(guān)重要，它賦予了用戶最簡潔、自然和方便的使用方式。觸摸屏因其反應(yīng)速度很快、交流直觀、堅固耐用、節(jié)省空間等諸多優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各大智能設(shè)備，如計算機、手機、游戲機、平板電腦等。

5結(jié)束語

該裝置能夠自動化實現(xiàn)石蠟病理切片的脫蠟、蛋白酶消化等過程。實現(xiàn)傳統(tǒng)制片過程中煩瑣步驟的自動化處理：完成石蠟切片的全自動脫蠟、脫水和酶消化的功能。而脫蠟后的病理切片可以用來進行細胞FISH實驗，廣泛應(yīng)用在臨床疾病的診斷上，如腫瘤，血液病，產(chǎn)前診斷等。

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【通聯(lián)編輯：唐一東】