范雪萍，馮志彬,*，房美芳，張 娟，陳國忠，李麗娜

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

特基拉芽孢桿菌L-天冬氨酸α-脫羧酶的異源表達(dá)及高密度發(fā)酵

范雪萍1，馮志彬1,*，房美芳1，張 娟2，陳國忠1，李麗娜1

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

L-天冬氨酸α-脫羧酶（L-aspartate α-decarboxylase，PanD）能選擇性脫去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。以特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）PanD37的基因組為模板，擴(kuò)增PanD表達(dá)基因panD，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a（＋）-panD，轉(zhuǎn)入Escherichia coli BL21（DE3）成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。利用搖床和發(fā)酵罐優(yōu)化培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，確定最佳培養(yǎng)條件為：37 ℃培養(yǎng)8 h，加入終濃度0.5 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）降溫至26 ℃誘導(dǎo)，采用葡萄糖為碳源并控制初始質(zhì)量濃度為5 g/L，發(fā)酵過程中采用pH-stat方式補(bǔ)料。在此基礎(chǔ)上利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，酶活力最高可達(dá)1 109.8 U/mL，OD600nm達(dá)到106.3。全細(xì)胞催化100 g/L L-天冬氨酸，反應(yīng)10 h物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化率為99.2%。構(gòu)建的重組菌經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后具有較高的細(xì)胞濃度和PanD活力，為生物法β-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供理論支持。

特基拉芽孢桿菌；大腸桿菌；L-天冬氨酸α-脫羧酶；異源表達(dá)；β-丙氨酸

β-丙氨酸是一種重要的精細(xì)化工品和藥物中間體，廣泛用于合成肌肽、泛酸鈣、巴柳氮、帕米磷酸鈉及聚β-氨基丙酸等生化產(chǎn)品[1-4]。化學(xué)合成法是目前β-丙氨酸的主要生產(chǎn)方法，存在成本高、工藝條件苛刻、副產(chǎn)物較多及環(huán)境不友好等缺點(diǎn)，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)工藝被認(rèn)為是最有前景的替代方法。生物轉(zhuǎn)化法是以L-天冬氨酸為生產(chǎn)原料，利用微生物胞內(nèi)L-天冬氨酸α-脫羧酶（L-aspartate α-decarboxylase，PanD）催化L-天冬氨酸脫α位羧基生產(chǎn)β-丙氨酸[5]。因此生物生產(chǎn)法的研究重點(diǎn)是尋找到一個(gè)合適的PanD并進(jìn)行高效的異源表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)PanD僅存在于微生物和植物中，是泛酸合成途徑中的關(guān)鍵酶[6-10]。目前報(bào)道的PanD主要來源于大腸桿菌[11]（Escherichia coli）、結(jié)核分枝桿菌[12]（Mycobacterium tuberculosis）、沙門菌[13]（Salmonella typhimurium）、谷氨酸棒桿菌[14]（Corynebacterium glutamicum）及幽門螺桿菌[15]（Helicobacter pylori）等菌屬。目前研究較多的是E. coli，在結(jié)構(gòu)解析、自剪切機(jī)理及酶學(xué)性質(zhì)方面取得不少成果，已證實(shí)PanD為丙酮?；蕾囆偷拿擊让福枰诜g后通過電子重排促使肽鏈斷裂，形成丙酮?；钚灾行腫5]。亦有關(guān)于E. coli PanD（PanDE.c）工程表達(dá)的研究報(bào)道[16-18]，但大多數(shù)酶活力低下，且重組PanDE.c在宿主E. coli內(nèi)多以未激活的酶原形式存在，必須在PanZ或PanM蛋白的作用下才能在常溫下進(jìn)行剪切形成丙酮?；鵞19]。Nicole等[20]克隆了C. glutamicum PanD（PanDC.g）和PanDE.c的合成基因并在E. coli中表達(dá)，PanDC.g活力約為PanDE.c活力的15.5 倍，且無需PanZ或PanM蛋白完成自剪切過程形成丙酮?；?。因此，近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于PanD的研究更多的鎖定在C. glutamicum上。趙連真等[21]克隆PanDC.g在E. coli BL21（DE3）中表達(dá)，酶活力高達(dá)9 4.1 6 U/m L，是目前為止報(bào)道的最高水平。Shen Yan等[22]對重組PanDC.g酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行充分研究，并以此為基礎(chǔ)應(yīng)用于β-丙氨酸催化合成，36 h可產(chǎn)生12.85 g/L的β-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率為97.2%，相較于PanDE.c有不少程度提高。Song等[23]利用E. coli W3110胞內(nèi)異源擴(kuò)增PanDC.g，同時(shí)強(qiáng)化表達(dá)天冬氨酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，構(gòu)建從葡萄糖開始的β-丙氨酸全合成途徑，經(jīng)39 h發(fā)酵β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到32.3 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率13.5%，為應(yīng)用PanD合成β-丙氨酸開啟了一條新思路。以上研究表明PanDC.g在生產(chǎn)β-丙氨酸方面取得較大的進(jìn)步，但仍然存在酶活力不夠高、產(chǎn)物濃度低、轉(zhuǎn)化率低及生產(chǎn)周期長的缺點(diǎn)，和化學(xué)法相比仍無明顯的成本優(yōu)勢，距離工業(yè)應(yīng)用尚有一段距離。

鄧思穎等[24]外源表達(dá)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、C. glutamicum及E. coli的PanD，通過酶學(xué)性質(zhì)比對發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬PanD具有更好的熱穩(wěn)定性和酶學(xué)特性，具有更強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到1 株高活性PanD的特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）[25]，在簡單優(yōu)化培養(yǎng)基的情況下酶活力可達(dá)44.57 U/mL，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。以此菌panD基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建了基因工程菌，可溶性表達(dá)PanD。同時(shí)為提高PanD的表達(dá)量，對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行高密度發(fā)酵，提高菌體密度的同時(shí)保持單位細(xì)胞合成目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)能力，以實(shí)現(xiàn)PanD活力的大幅度提高，為β-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌E. coli BL21（DE3）用于轉(zhuǎn)化宿主，B. tequilensis PanD37提供panD基因，以上菌種均由應(yīng)用微生物研究室保藏；質(zhì)粒pET32a（＋）購買于Novagen公司。

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、核酸限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA連接酶 大連寶生物公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒 上海生工生物有限公司；β-丙氨酸、氨芐青霉素 阿拉丁試劑（上海）有限公司；AccQ·Fluor試劑 美國Waters公司；豆粕水解液山東陽成生物科技公司；其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 15 g/L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油20 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，豆粕水解液20 g/L，K2HPO413 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，丁二酸1.5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，微量元素母液5 mL/L，pH 7.0；微量元素母液：FeSO4·7H2O 10 g/L，ZnSO4·7H2O 2 g/L，CuSO4·5H2O 2 g/L，CaCl22 g/L，H3BO30.3 g/L，Na6Mo7O240.1 g/L，1 mol/L HCl溶液溶解并儲于棕色試劑瓶中；補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油500 g/L，豆粕水解液40 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 7.0。滅菌條件皆為：121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；PCR儀美國Bio-Rad公司；ZWY-111G恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KB高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16B高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；BGZ-5自控發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備公司；高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）（色譜柱為Waters AccQ-TagTM柱（150 mm×3.9 mm，4.0 μm）） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆與重組菌構(gòu)建

根據(jù)B. tequilensis全基因組（LGRW01000001）中PanD的基因序列信息設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切位點(diǎn)（粗體表示）的上游引物F-PanD：5’-AAGGAT CCGAAGGAGATATACCATGTATCG-3’；含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（粗體表示）的下游引物R-PanD：5’-TTCTC GAGCTACAAAATTGTACGGGCGGGTTC-3’。通過細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取得到B. tequilensis PanD37基因組DNA，并以該基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括10×Ex Taq buffer（Mg2＋Plus）4 μL，dNTPs mixture 4.5 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL，模板1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，用dd H2O補(bǔ)足至50 μL。PCR參數(shù)為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，并用DNA凝膠回收試劑盒純化目標(biāo)DNA片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分別酶切載體pET32a（＋）及panD片段，然后用DNA連接酶將panD片段與載體連接并轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒pET32a（＋）-panD（圖1），進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證和DNA序列測序。

圖1 重組質(zhì)粒pET32a（）-panD的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pET32a (+)-panD

1.3.2 重組PanD的表達(dá)與SDS-PAGE分析

將重組菌接種于含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。以1%接種量轉(zhuǎn)接到含有100 mg/L氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600nm約為0.5～0.8后加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)約16 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，無菌水洗滌2 次，重懸于pH 7.0、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，冰浴下超聲破碎，12 000 r/min離心10 min，取上清酶液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.3 培養(yǎng)條件

1.3.3.1 搖瓶培養(yǎng)

挑取1 環(huán)新鮮斜面菌種接入含50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，加氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)6 h，作為種子液。按5%接種量將種子液接入含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，降溫至30 ℃并加入1 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)16 h。

1.3.3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

挑取1 環(huán)新鮮斜面菌種接入含50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，加氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)6 h，作為種子液。按5%接種量將種子液接入含3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L自控發(fā)酵罐中，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，初始通氣流量為2 L/min，隨著菌體OD600nm值增加調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣流量，以維持溶氧值在20%以上，用25%氨水調(diào)節(jié)pH值穩(wěn)定在7.0，37 ℃培養(yǎng)8 h加入誘導(dǎo)劑降溫至26 ℃進(jìn)行蛋白表達(dá)，至酶活力不再增加時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.4.1 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

改變IPTG濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L）、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)（2、4、6、8、10 h）、誘導(dǎo)溫度（22、26、30、34、37 ℃），誘導(dǎo)時(shí)間（4、8、12、16、20 h）在搖床上進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)并檢測酶活力及OD600nm。以IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間為變量，以PanD活力為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.3.4.2 碳源優(yōu)化

在確定誘導(dǎo)條件的情況下，以20 g/L的比例，分別添加葡萄糖及甘油作為碳源，在搖床上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并檢測酶活力、乙酸及OD600nm。

1.3.4.3 補(bǔ)料方式優(yōu)化

采用優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件和最佳碳源，在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料-分批發(fā)酵，待碳源耗盡后分別采用間歇流加、DO-stat、pH-stat方式流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測酶活力、乙酸及OD600nm。全部測定數(shù)據(jù)均重復(fù)3次取平均值。

1.3.5 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸

配制100 g/L L-天冬氨酸溶液2 L，NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，加入濕菌體80 g（發(fā)酵結(jié)束后8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體），過程中自動流加2 mol/L HCl溶液控制pH值為7.0，溫度40 ℃，在5 L自控發(fā)酵罐上轉(zhuǎn)化10 h。

1.3.6 分析檢測

生長量測定：將菌液適當(dāng)稀釋，在600 nm波長處測量其光密度，即OD600nm。

酶活力測定[20]：酶反應(yīng)體系：pH 7.0、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液2.0 mL、發(fā)酵液0.1 mL、L-天冬氨酸（200 g/L）0.4 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值使L-天冬氨酸溶解，反應(yīng)1 h，按體積比1∶1加入10%三氯乙酸溶液，4 ℃放置終止反應(yīng)，AccQ·Tag法[16]測酶活力，即使用Waters公司的AccQ·Fluor試劑盒柱前衍生HPLC檢測β-丙氨酸含量。酶活力定義：在pH 7.0、溫度37 ℃的條件下，每l h轉(zhuǎn)化生成1 μmol β-丙氨酸所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位U。

L-天冬氨酸測定：使用Waters公司的AccQ·Fluor試劑盒柱前衍生HPLC檢測L-天冬氨酸含量。

乙酸測定：按文獻(xiàn)[26]方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 panD基因的克隆與重組菌構(gòu)建

圖2 panD基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of panD gene PCR product

以B. tequilensis PanD37基因組DNA為模板，根據(jù)特基拉芽孢桿菌全基因組（LGRW01000001）中panD基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到400 bp左右條帶，無非特異性擴(kuò)增，與預(yù)期大小相符。使用DNA凝膠回收試劑盒純化目標(biāo)DNA片段。目的基因和pET32a（＋）經(jīng)雙酶切，連接后得到重組質(zhì)粒，然后全部轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）宿主菌，獲得重組菌E. coli BL21（DE3）pET32a（＋）-panD。隨機(jī)挑取平板上的單個(gè)菌落，LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素抗性）過夜富集培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒，做質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，瓊脂糖電泳檢測，panD基因序列大小約為400 bp，與預(yù)期基因相符。取該重組質(zhì)粒送樣測序，測序結(jié)果表明，重組大腸桿菌構(gòu)建成功，panD片段大小384 bp，提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得GenBank號：KY123117。

2.2 重組酶的表達(dá)與SDS-PAGE分析

圖3 重組菌E. coli BL21（DE3）pET32a（ ）-panD表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of protein expression in recombinant E. coli BL21(DE3) pET32a(+)-panD

取重組菌的胞內(nèi)蛋白粗提液（發(fā)酵液離心獲菌體，超聲破碎后，取上清液）進(jìn)行SDS-PAGE分析，由圖3可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組大腸桿菌有目的蛋白的表達(dá)，目的蛋白大小約為12 kDa，略小于預(yù)期13.9 kDa，說明表達(dá)蛋白已完成自剪切形成丙酮?；钚孕问胶挺?亞基，β-亞基分子質(zhì)量較?。ㄐ∮? kDa），電泳檢測不到。同時(shí)測得重組菌E. coli BL21（DE3）pET32a（＋）-panD的表達(dá)酶活力為78.3 U/mL，證明panD基因在E. coli BL21（DE3）成功異源表達(dá)。

2.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件

表1 不同誘導(dǎo)條件下重組菌株搖瓶產(chǎn)酶的酶活力及菌體濃度變化Table 1 Enzymatic activity of PanD and cell growth in shake fl asks of recombinant E. coli under different induction conditions

在重組菌構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，優(yōu)化誘導(dǎo)條件提高PanD的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)及誘導(dǎo)溫度對酶的合成有顯著影響。由表1可知，IPTG對菌體的生長有抑制作用，但外源蛋白的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加而不斷升高，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)酶活力達(dá)到最高值169.7 U/mL；若繼續(xù)提高濃度，對細(xì)胞生長產(chǎn)生毒性，蛋白表達(dá)水平會受到影響。分別在不同培養(yǎng)時(shí)間加入0.5 mmol/L的IPTG，同時(shí)降溫至30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)過早誘導(dǎo)加重菌體代謝負(fù)擔(dān)，不利于菌體生長，最終由于菌體生長量不足導(dǎo)致表達(dá)酶活力不高；誘導(dǎo)太晚，則菌體代謝開始降低，不利于外源蛋白的表達(dá)，在6～8 h誘導(dǎo)，此時(shí)菌體生長處于對數(shù)生長中期，代謝旺盛，外源蛋白也易于誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度對外源蛋白表達(dá)也非常重要，溫度過低，菌體生長緩慢，外源蛋白合成速率降低，表達(dá)酶活力不高；溫度過高，菌體生長速率過快，重組蛋白因錯誤折疊形成包涵體，最終酶活力也不高。培養(yǎng)至8 h時(shí)，加入0.5 mmol/L的IPTG在不同溫度下誘導(dǎo)酶的表達(dá)，結(jié)果顯示溫度在22～37 ℃變化時(shí)酶活力先上升后下降，并在溫度為26 ℃時(shí)達(dá)到最高189.9 U/mL，可見適度的低溫對外源蛋白的可溶性表達(dá)是有利的。試驗(yàn)最后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)間也是影響酶表達(dá)的重要因素，誘導(dǎo)時(shí)間越長酶活力越高，16 h酶活力達(dá)到最高后繼續(xù)延長誘導(dǎo)時(shí)間酶活力反而下降。

2.3.2 誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，極差R值大小順序?yàn)椋篟A＞RC＞RB＞RD，說明IPTG濃度對PanD活力影響最大，其次是誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間。k值分析結(jié)果顯示，4 個(gè)因素的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)8 h、誘導(dǎo)溫度26 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間18 h。依據(jù)此組合進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，最終酶活力為191.3 U/mL，高于正交試驗(yàn)中所有的組合，說明該組合確實(shí)為最佳誘導(dǎo)條件。

表2 誘導(dǎo)條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results of PanD activity for the optimization of induction conditions

2.4 碳源優(yōu)化

表3 碳源對重組菌產(chǎn)PanD的影響Table 3 Effects of carbon sources on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

基因工程菌發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的組成既要有利于工程菌生長，又要保證外源蛋白有效表達(dá)。分別以20 g/L的葡萄糖、甘油作為碳源，在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)酶。由表3可知，相較于甘油，葡萄糖發(fā)酵過程中生成的乙酸遠(yuǎn)高于甘油培養(yǎng)基，抑制了外源蛋白的表達(dá)，但菌體生長量卻顯著提升，更有利于高密度發(fā)酵，如能控制乙酸的生成，緩解對蛋白表達(dá)的抑制作用，葡萄糖仍是比較合適的高密度發(fā)酵碳源?？刂瓶偺?0 g/L，分別設(shè)葡萄糖初始質(zhì)量濃度為5、10、15 g/L，余糖均等分為15 份，自培養(yǎng)1 h開始補(bǔ)入，每小時(shí)補(bǔ)入1 次，在15 h補(bǔ)完，設(shè)對照組（總糖一次性加入），在搖床上振蕩培養(yǎng)，結(jié)果（表4）顯示降低初始糖質(zhì)量濃度基本不影響菌體生長，但酶活力隨初始糖質(zhì)量濃度降低而顯著增加，當(dāng)初始糖質(zhì)量低至5 g/L時(shí)，酶活力為235.1 U/mL，是對照組的1.7 倍，且乙酸質(zhì)量濃度被控制在較低水平，保證菌體生長量的同時(shí)克服了葡萄糖作碳源酶活力不高的缺點(diǎn)。

表4 初始糖質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)PanD的影響Table 4 Effects of initial glucose concentration on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

2.5 補(bǔ)料方式優(yōu)化

表5 補(bǔ)料方式對重組菌產(chǎn)PanD的影響Table 5 Effects of feeding modes on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

為進(jìn)一步降低發(fā)酵過程中葡萄糖對外源蛋白表達(dá)的抑制作用，提高菌體生長量和酶活力，在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，葡萄糖初始質(zhì)量濃度設(shè)為5 g/L，當(dāng)葡萄糖耗盡后分別采用間歇流加、DO-stat、pH-stat 3 種方式流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，結(jié)果如表5所示，由于連續(xù)補(bǔ)充營養(yǎng)和發(fā)酵罐上環(huán)境條件的精準(zhǔn)控制，3種方式的發(fā)酵結(jié)果均較搖瓶發(fā)酵有明顯提高，OD600nm和酶活力成倍數(shù)增加，乙酸生成量亦得到顯著控制，發(fā)酵結(jié)束時(shí)均低于1 g/L，其中尤以pH-stat方式補(bǔ)料發(fā)酵效果最好，酶活力提高至1 050.2 U/mL。

2.6 優(yōu)化條件下重組菌高密度發(fā)酵

采用優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)在5 L自控發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。37 ℃培養(yǎng)8 h后降溫至26 ℃，加入0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，間隔2 h取樣測定OD600nm、酶活力及乙酸含量，結(jié)果如圖4所示，重組菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基后約2 h進(jìn)入對數(shù)生長期，迅速生長導(dǎo)致氧氣消耗加劇，應(yīng)及時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速及通氣量保證溶氧供給，在8 h降溫并添加誘導(dǎo)劑后，菌體經(jīng)短暫調(diào)適后繼續(xù)保持增長，同時(shí)PanD在誘導(dǎo)劑作用下開啟表達(dá)開關(guān)，并以較高的效率穩(wěn)步合成，在22 h時(shí)，OD600nm與酶活力均達(dá)到最高，分別為106.3和1 109.8 U/mL，較搖瓶發(fā)酵酶活力達(dá)到峰值的時(shí)間有所提前，繼續(xù)培養(yǎng)二者出現(xiàn)不同程度的衰減，應(yīng)及時(shí)終止發(fā)酵。發(fā)酵過程中采用pH-stat流加補(bǔ)料有效控制葡萄糖質(zhì)量濃度始終在5 g/L（數(shù)據(jù)未顯示）以下，減少了乙酸的生成，22 h時(shí)乙酸質(zhì)量濃度僅為0.39 g/L，最大程度地保證了外源蛋白的高效表達(dá)。

圖4 最優(yōu)條件下重組菌發(fā)酵生產(chǎn)PanD的過程曲線Fig. 4 Time courses of recombinant E. coli fermentation under the optimum conditions

2.7 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸

圖5 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸Fig. 5 Time course of β-alanine production with whole-cell broth

2 L轉(zhuǎn)化體系中加入200 g L-天冬氨酸，NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，升溫至40 ℃加入80 g濕菌體，轉(zhuǎn)化過程中L-天冬氨酸脫羧基釋放CO2導(dǎo)致pH值上升，流加2 mol/L鹽酸控制pH 7.0，反應(yīng)10 h，結(jié)果如圖5所示，β-丙氨酸5 h前線性增加，尤其反應(yīng)開始的1 h內(nèi)比合成速率達(dá)到19.5 g/（L·h），7 h后酶活力逐漸衰減，合成速率下降，最終產(chǎn)量為66.4 g/L，物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化率為99.2%。

3 結(jié) 論

β-丙氨酸作為一種重要的醫(yī)藥和化工中間體，市場潛力巨大，針對目前化工合成法的缺點(diǎn)，微生物酶法生產(chǎn)β-丙氨酸顯示了良好的應(yīng)用前景和替代方案，受限于現(xiàn)有研究菌株低活性的PanD，難以滿足低成本制造，尚難具備工業(yè)價(jià)值[27-28]。目前關(guān)于PanD的研究多集中于E. coli和C. glutamicum來源，且PanDC.g是截至目前PanD工程表達(dá)酶活力最高的菌株，鮮有關(guān)于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）PanD的研究成果，僅出現(xiàn)B. tequilensis與B. subtilis產(chǎn)PanD的零星報(bào)道[24-25]，所產(chǎn)PanD均具有較好的熱穩(wěn)定性和酶學(xué)特性，但未見高活性B. subtilis PanD（PanDB.s）及應(yīng)用方面的的研究成果。本研究以前期分離到的一株具有較高PanD生產(chǎn)能力的B. tequilensis基因組為模板克隆到panD，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a（＋）-panD，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3），成功實(shí)現(xiàn)PanD在大腸桿菌中的異源表達(dá)。為提高重組菌的發(fā)酵水平，首先對該菌的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了誘導(dǎo)劑的加量、最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)及誘導(dǎo)溫度，酶活力得到有效提升。選擇重組菌發(fā)酵常用的兩種碳源葡萄糖和甘油進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖有利于長菌，甘油有利于產(chǎn)酶，同時(shí)檢測發(fā)酵液中乙酸含量發(fā)現(xiàn)葡萄糖更易于積累乙酸抑制酶的表達(dá)，和其他重組菌發(fā)酵的報(bào)道是一致的[29-30]。通過降低葡萄糖初始質(zhì)量濃度有效降低了乙酸生成量，在保證菌體生長量的同時(shí)獲得較高的表達(dá)水平，基于高密度發(fā)酵和生產(chǎn)成本考慮選擇葡萄糖作為發(fā)酵碳源。為進(jìn)一步提高酶活力，采用3 種補(bǔ)料方式在發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)pH-stat方式補(bǔ)料在滿足菌體營養(yǎng)的同時(shí)，有效避免了乙酸的生成，減輕對酶表達(dá)的抑制。采用優(yōu)化條件在發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，由于采用了優(yōu)化的誘導(dǎo)條件和有利于重組菌生長的葡萄糖作為碳源并進(jìn)行pH-stat方式補(bǔ)料，控制葡萄糖質(zhì)量濃度剛好滿足菌體生長和產(chǎn)酶需要，降低了乙酸生成量，發(fā)酵22 h，OD600nm已達(dá)到106.3，成功實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，菌體量遠(yuǎn)高于以往研究[16-23]，得益于菌體高密度生長酶活力亦達(dá)到1 109.8 U/mL，是目前報(bào)道的最高水平。采用全細(xì)胞催化100 g/L底物L(fēng)-天冬氨酸僅需10 h，物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化率達(dá)99.2%，在酶法生產(chǎn)β-丙氨酸方面具有很大的可行性和應(yīng)用前景。

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Heterologous Expression of the Bacillus tequilensis L-Aspartate α-Decarboxylase in Escherichia coli and Its High Cell Density Fermentation

FAN Xueping1, FENG Zhibin1,*, FANG Meifang1, ZHANG Juan2, CHEN Guozhong1, LI Lina1
(1. School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China;2. School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, China)

L-Aspartate α-decarboxylase is an important industrial enzyme which can stereo-selectively transform L-aspartate acid into β-alanine. In the present study, we cloned and expressed the L-aspartate α-decarboxylase gene (panD) from Bacillus tequilensis to construct an L-aspartate α-decarboxylase-producing Escherichia coli strain and optimized the culture conditions for high cell density fermentation. Using the genome of B. tequilensis PanD37 as template, the panD gene was amplified, and the recombinant plasmid pET32a(+)-panD was constructed and transformed into E. coli BL21(DE3) for expression. For high cell density growth and eff i cient L-aspartate α-decarboxylase expression, the optimum fermentation conditions in shake fl asks were determined as follows: a pH-stat fed-batch culture was performed using glucose as the carbon source at an initial concentration of 5 g/L; after 8 h of culture at 37 ℃, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a fi nal concentration of 0.5 mmol/L as an inducer and the temperature was reduced to 26 ℃. Maximum L-aspartate α-decarboxylase activity of 1 109.8 U/mL and OD600nmvalue of 106.3 were obtained when the fermentation was carried out in a 5 L fermentor. Whole-cell catalysis of 100 g/L L-aspartate gave a molar conversion rate of 99.2% after 10 h of reaction. This work can provides a promising basis for further application of L-aspartate α-decarboxylase in industrial β-alanine production.

Bacillus tequilensis; Escherichia coli; L-aspartate α-decarboxylase; heterelogous expression; β-alanine

10.7506/spkx1002-6630-201802023

Q935

A

1002-6630（2018）02-0144-07

范雪萍, 馮志彬, 房美芳, 等. 特基拉芽孢桿菌L-天冬氨酸α-脫羧酶的異源表達(dá)及高密度發(fā)酵[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2):144-150.

10.7506/spkx1002-6630-201802023. http://www.spkx.net.cn

FAN Xueping, FENG Zhibin, FANG Meifang, et al. Heterologous expression of the Bacillus tequilensis L-aspartate α-decarboxylase in Escherichia coli and its high cell density fermentation[J]. Food Science, 2018, 39(2): 144-150. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802023. http://www.spkx.net.cn

2017-02-24

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（魯財(cái)指2014-38）

范雪萍（1995—），女，學(xué)士，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：xuepingFan95@163.com

*通信作者簡介：馮志彬（1977—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵與酶催化。E-mail：zhibinfeng@126.com