蘇志星，何 杰，許文軍，鄭寬寬，羅佶龍，王緒杰

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

Cu2+、Zn2+對三疣梭子蟹幼蟹的急性毒性

蘇志星1，何 杰2，許文軍1，鄭寬寬1，羅佶龍2，王緒杰2

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

以三疣梭子蟹幼蟹（體質(zhì)量為：15.3±1.2 g）為實驗動物，采用靜水體外暴露法,開展了兩種常見重金屬離子（Cu2+、Zn2+）的急性毒性和加和等毒性強度聯(lián)合毒性實驗。結(jié)果表明：（1）Cu2+、Zn2+對三疣梭子蟹幼蟹的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為3.934 mg/L和3.901 mg/L；三疣梭子蟹幼蟹對Cu2+、Zn2+的96 h安全質(zhì)量濃度分別為0.039 34 mg/L和0.039 01 mg/L，表明兩種重金屬對梭子蟹幼蟹的毒性相近；（2）Cu2+、Zn2+離子在加和等毒性強度下對三疣梭子蟹幼蟹96 h聯(lián)合毒性與其濃度配比相關(guān)，低毒性強度的Cu2+對Zn2+具有拮抗作用，低毒性強度的Zn2+對Cu2+具有協(xié)同作用，當(dāng)Cu2+、Zn2+毒性強度相當(dāng)時表現(xiàn)為相互獨立作用。

Cu2+；Zn2+；急性毒性；聯(lián)合毒性；三疣梭子蟹；幼蟹

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus，以下簡稱梭子蟹）隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高，已成為我國最受歡迎的養(yǎng)殖品種之一。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的改進和提升，梭子蟹養(yǎng)殖面積不斷增加，2016年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量達到12.5萬t[1]。但是，在梭子蟹池塘養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的同時，養(yǎng)殖環(huán)境的日漸惡化已成為遏制梭子蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

近年來工業(yè)“三廢”和農(nóng)業(yè)污染物向海洋中肆意排放，使自然海區(qū)環(huán)境日漸惡化，對海洋生物的生存產(chǎn)生嚴重威脅[2]。廢水中所含重金屬已成為周邊養(yǎng)殖海域水環(huán)境惡化的最主要污染源之一，其中Cu2＋、Zn2＋為常見兩類；另外，由于Cu2＋可用于防治原生動物引起的多種魚病，Zn2＋可以滅殺或除去蝦蟹等水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的固著類纖毛蟲，致使Cu2＋、Zn2＋已作為常見藥物的主要成分而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐生產(chǎn)中，因此，有關(guān)Cu2＋、Zn2＋對水產(chǎn)動物的存活、生長及養(yǎng)成質(zhì)量的影響成為了養(yǎng)殖從業(yè)者極為關(guān)注的問題。

迄今為止，有關(guān) Cu2＋、Zn2＋對蝦蟹類甲殼動物的毒性作用國內(nèi)已有較多研究[3-6]，但 Cu2＋、Zn2＋對三疣梭子蟹急性毒性研究主要集中于大眼幼體、溞狀幼體和稚蟹期，尚未見其對梭子蟹幼蟹期的生態(tài)毒理報道。筆者于2017年7月在浙江海洋水產(chǎn)研究所西軒島實驗基地以三疣梭子蟹幼蟹作為實驗動物，開展Cu2＋、Zn2＋兩種常見重金屬離子對梭子蟹幼蟹的急性毒性效應(yīng)研究，以期為養(yǎng)殖環(huán)境評估和水產(chǎn)養(yǎng)殖安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗于2017年7月在浙江海洋水產(chǎn)研究所西軒漁業(yè)科技島進行。在養(yǎng)殖池塘去雄期間用誘釣的方法捕捉梭子蟹幼蟹500余只，暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池內(nèi)，水深0.5 m，暫養(yǎng)期間連續(xù)增氧，每天下午17：00投喂新鮮野雜魚。3 d后，選擇表體無損傷，十足健全、規(guī)格相近（平均體質(zhì)量為15.3±1.2 g）的健康個體參試。

1.1.2 實驗藥物

實驗藥物CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O購自于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。實驗前用蒸餾水配置成一定質(zhì)量濃度的母液備用，實驗時用海水稀釋到所需濃度。

1.1.3 實驗理化條件

實驗所用海水經(jīng)24 h暗沉淀處理，二次脫脂棉過濾，水溫26.2～29.5℃，鹽度26～27，pH 7.8～8.2，水質(zhì)符合我國《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（GB11607-89）[7]。

1.1.4 實驗容器

實驗所用容器為聚乙烯水族箱，規(guī)格（39×21×20.5 cm），實驗前用對應(yīng)的濃度藥物浸泡12 h以上。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cu2＋、Zn2＋單一金屬離子對梭子蟹幼蟹的急性毒性

經(jīng)預(yù)實驗確定梭子蟹幼蟹實驗藥物濃度范圍（96 h后的全致死濃度下限和全活濃度上限）后，設(shè)置5個 Cu2＋和 Zn2＋質(zhì)量濃度梯度組，分別為 1.25 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L 和 2.07 mg/L、3.11 mg/L、4.67 mg/L、7.00 mg/L、11.20 mg/L，組內(nèi)設(shè)3個重復(fù)，另設(shè)對照組。向?qū)嶒炄萜鲀?nèi)分別加入不同質(zhì)量濃度Cu2＋、Zn2＋溶液，溶液所用體積為10 L。采用不投餌、靜水連續(xù)充氣的方法，保持水質(zhì)和Cu2＋、Zn2＋的穩(wěn)定，開展單一藥物對幼蟹的急性毒性實驗。每一質(zhì)量濃度梯度各放梭子蟹幼蟹10只，每隔2 h檢查一次實驗蟹的情況，及時撈出死亡個體以免影響水質(zhì)，每隔24 h將所有溶液更換一次并記錄當(dāng)日死亡率。

1.2.2 Cu2＋、Zn2＋對梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性

以單一重金屬離子96 h的半致死質(zhì)量濃度LC50作為致死閾濃度，計為一個毒性強度單位，通過加和等毒性強度方式設(shè)置兩種重金屬聯(lián)合毒性濃度梯度，Cu2＋、Zn2＋兩種重金屬的加和方式為 A（0＋1.0）、B（0.2＋0.8）、C（0.4＋0.6）、D（0.6＋0.4）、E(0.8＋0.2)和 F（1.0＋0）6 個組合，其中 A 和 F 組為對照組，藥液所用體積為10 L，每組內(nèi)設(shè)3個重復(fù)，采用不投餌、靜水連續(xù)充氣的方法，連續(xù)觀察受試個體的活動情況，及時取出死亡個體，同上述方法一樣，每24 h換液一次并計算死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)實驗藥物對梭子蟹的急性毒性結(jié)果，建立死亡率-質(zhì)量濃度對數(shù)直線回歸方程，借助SPSS19.0得到各相應(yīng)時段的回歸方程和半致死濃度值LC50以及死亡率和質(zhì)量濃度之間的相關(guān)性（P＜0.05為顯著水平），利用96 h的半致死濃度通過以下公式計算安全濃度（SC）：SC=0.01×96 h LC50。

2 實驗結(jié)果

2.1 Cu2+-Zn2+對梭子蟹幼蟹的單一毒性效應(yīng)

實驗開始后，梭子蟹幼蟹在兩種重金屬毒性脅迫下表現(xiàn)出相似的行為特征，但在同種重金屬不同實驗藥物質(zhì)量濃度下的中毒現(xiàn)象存在明顯差異，具體表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度組藥物對實驗蟹的毒性作用不明顯，與對照組基本相同，受試個體在入液后沒有表現(xiàn)明顯的不適反應(yīng)，靜置于容器底部，而高質(zhì)量濃度組藥物對實驗蟹的毒性作用明顯，實驗蟹入液后反應(yīng)劇烈，焦躁不安，上下游動，活動頻率增加，個體不適性明顯增強，經(jīng)過一段時間的適應(yīng)才趨于安靜。隨著時間的延長，各藥物濃度組受試個體在容器內(nèi)的活動能力也明顯減弱，死亡個體數(shù)量明顯增加。由表1可知，死亡率與藥物質(zhì)量濃度和受試時間之間成正相關(guān)，即隨著藥物濃度的升高，死亡率顯著升高，但從梭子蟹幼蟹急性致毒死亡情形隨時間變化來看，在實驗質(zhì)量濃度設(shè)置范圍內(nèi)，各藥物致梭子蟹幼蟹急性死亡的躍變特征表現(xiàn)為：Cu2+對梭子蟹幼蟹的死亡躍變臨界質(zhì)量濃度在5～10 mg/L之間，Zn2+的死亡躍變臨界質(zhì)量濃度為7～11.2 mg/L之間。

表1 Cu2+、Zn2+對梭子蟹幼蟹的急性毒性效應(yīng)Tab.1 The acute toxicity of Cu2+,Zn2+to juveniles of P.trituberculatus

根據(jù)表1中的實驗結(jié)果計算獲得Cu2+、Zn2+對梭子蟹急性毒性的死亡率-質(zhì)量濃度對數(shù)回歸方程（表2）。結(jié)果表明，在相同的實驗條件下，不同實驗藥物質(zhì)量濃度組的致死效應(yīng)存在明顯差異（F值均大于相應(yīng)的 F0.05），建立的回歸方程也顯示出較好的正相關(guān)性（R2均大于 0.9）。Cu2+、Zn2+對梭子蟹 24 h、48 h、72 h、96 h的半致死質(zhì)量濃度 LC50值分別為 12.299 mg/L、7.192 mg/L、4.826 mg/L、3.934 mg/L和 7.280 mg/L、5.607 mg/L、4.397 mg/L、3.901 mg/L，LC50值隨著實驗時間的延長而減小。另外，各實驗時間段內(nèi)的Cu2+的LC50值均略大于Zn2+，這表明Zn2+對梭子蟹的毒性比Cu2+稍強。由96 h半致死質(zhì)量濃度LC50值計算可得Cu2+、Zn2+離子的安全質(zhì)量濃度分別為0.039 34 mg/L和0.039 01 mg/L。

2.2 Cu2+-Zn2+對梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性效應(yīng)

Cu2+-Zn2+對梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性作用見表3?？芍珻u2+-Zn2+在加和等毒性強度下對梭子蟹幼蟹96 h聯(lián)合毒性所表現(xiàn)的毒性特征，與兩種離子之間的匹配比例緊密相關(guān)。由表3可知，在同一毒性強度配比內(nèi)，隨著時間的增加，死亡率逐漸上升；而不同毒性強度配比間在相同受試時間內(nèi)的死亡率也存在明顯差異，具體表現(xiàn)為：Cu2+-Zn2+兩種離子之間存在協(xié)同、拮抗或相互獨立作用，即較低毒性強度的Cu2+對Zn2+具有拮抗作用，低毒性強度的Zn2+對Cu2+具有協(xié)同作用，當(dāng)Cu2+、Zn2+毒性強度相當(dāng)時表現(xiàn)為相互獨立作用。

表2 Cu2+、Zn2+對梭子蟹幼蟹單一毒性效應(yīng)特征分析Tab.2 Analysis on acute toxicity of Cu2+,Zn2+to juveniles of P.trituberculatus

表3 Cu2+-Zn2+聯(lián)合毒性對梭子蟹幼蟹的毒性效應(yīng)Tab.3 The joint toxicity of Cu2+and Zn2+to juveniles of P.trituberculatus

3 討論

3.1 Cu2+、Zn2+對梭子蟹幼蟹的毒性效應(yīng)

Cu2+、Zn2+是甲殼動物生存所必需的微量元素，低濃度的Cu2+、Zn2+有益于生長發(fā)育，但高濃度的Cu2+、Zn2+會對甲殼動物機體產(chǎn)生毒害作用。梭子蟹幼蟹在高質(zhì)量濃度的Cu2+、Zn2+溶液中表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，主要表現(xiàn)為焦躁不安，上下游動，試圖逃逸進行避毒，而在掙扎無果后，其選擇靜臥不動，以減少代謝水平和能量消耗，這與大多數(shù)水生動物應(yīng)對毒物脅迫的行為對策相似。另外，同其它水生動物一樣，蝦蟹類甲殼動物機體中也含有重要的生物解毒組分-熱穩(wěn)定蛋白（HSP），對重金屬的毒性作用都有一定的抵御能力。金屬硫蛋白（MT）是HSP的主要成分[9]，含有大量的半胱氨酸殘基，其對金屬離子具有高度親和力[10]。當(dāng)生物機體中含有過量重金屬時，可以誘導(dǎo)MT與其結(jié)合，產(chǎn)生絡(luò)合物，有效緩解重金屬對機體的毒害作用。但是，蝦蟹類機體內(nèi)的MT的含量有限，誘導(dǎo)其表達也是有一定限度的，隨著金屬離子的濃度不斷升高以及機體在溶液中暴露時間不斷延長，MT絡(luò)合物的形成將成下降趨勢，導(dǎo)致的結(jié)果是重金屬離子不斷在生物機體中富集，其生理生化功能將受到嚴重損害，具體表現(xiàn)為中毒現(xiàn)象加深以致死亡率上升。本研究發(fā)現(xiàn)：低濃度Cu2+、Zn2+實驗組在機體暴露24 h內(nèi)的死亡率極低，隨著重金屬濃度的不斷上升以及實驗時間的不斷延長，而且Cu2+、Zn2+兩種金屬離子不同質(zhì)量濃度梯度組的致死效應(yīng)存在顯著差異（F均大于F0.01），建立的各時間段死亡率-質(zhì)量濃度之間的回歸方程具有高度擬合性（可決定系數(shù)R2均大于等于0.9197），且兩者之間的相關(guān)性極高（r均為顯著水平），這表明梭子蟹幼蟹死亡率與重金屬質(zhì)量濃度之間緊密相關(guān)，這與重金屬對水生動物的作用特征相吻合。銅鋅與其他一些重金屬不同，低濃度銅鋅是生物體必需的；結(jié)合幼蟹和成蟹金屬硫蛋白含量情況、對銅鋅的需求情況分析毒性區(qū)別分析。

3.2 關(guān)于梭子蟹幼蟹對Cu2+、Zn2+安全濃度的評價

Cu2+、Zn2+可用于殺滅原生動物、纖毛蟲以及控制藍藻的爆發(fā)等，已作為常見漁藥的主要成分而廣泛應(yīng)用于蝦蟹類養(yǎng)殖生產(chǎn)中。由表4所列不同蝦蟹類對Cu2+、Zn2+的96 h質(zhì)量安全濃度中可見，不同種類蝦蟹對Cu2+、Zn2+的耐受性不同，其中中華絨螯蟹Eriocheir sinensis與克氏原螯蝦Procambarus clarkii的耐受強度遠高于鋸緣青蟹Scylla serrata和羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii，而且同一種類不同發(fā)育階段或規(guī)格對同種重金屬離子的安全濃度也不同，本研究中梭子蟹幼蟹對Cu2+、Zn2+離子的質(zhì)量安全濃度分別為0.039 34 mg/L和0.039 01 mg/L，遠高于大眼幼體階段的質(zhì)量安全濃度（分別為：0.002 91 mg/L和0.010 4 mg/L），表現(xiàn)出生物體規(guī)格越大，對有毒物質(zhì)耐受性越強的特征。另外，梭子蟹幼蟹對Cu2+的質(zhì)量安全濃度高于我國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607-89）所規(guī)定的濃度（0.01 mg/L），這表明梭子蟹幼蟹對Cu2+耐受性較高，因此筆者建議在商品蟹的檢測中應(yīng)特別注意Cu2+的含量。

表4 我國主養(yǎng)蝦蟹類對Cu2+、Zn2+的96 h質(zhì)量安全濃度Tab.4 The safety concentrations of Cu2+and Zn2+of foremost cultivation shrimp and crabs in China

3.3 Cu2+、Zn2+對梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性效應(yīng)機理的初步探討

本研究在設(shè)定的質(zhì)量濃度配比與時間范圍內(nèi)，Cu2+、Zn2+對梭子蟹幼蟹的聯(lián)合作用效果會隨著毒性強度的配比不同而改變，具體表現(xiàn)為低毒性強度的Cu2+對Zn2+具有拮抗作用，而低毒性強度的Zn2+對Cu2+具有協(xié)同作用。這可能是Cu2+、Zn2+共同作用改變了單一重金屬離子對機體的毒性作用機制，使細胞膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致重金屬離子進入細胞的難易程度發(fā)生改變[16]。同時，作為水生生物機體重要解毒組分金屬硫蛋白與不同重金屬離子的鰲合性存在差異，一般毒性較強的重金屬會先和金屬硫蛋白結(jié)合[17]。所以，當(dāng)Cu2+、Zn2+同時存在時，機體中的金屬硫蛋白鰲合物的合成速率受到影響；當(dāng)金屬硫蛋白鰲合物達到飽和，重金屬離子對機體的毒害作用將顯著增強，即當(dāng)Cu2+毒性強度為0.2時，金屬硫蛋白鰲合物未能飽和度，致使需要部分Zn2+參與形成螯合物而消除了毒性，表現(xiàn)為低濃度的Cu2+對Zn2+的拮抗作用；而當(dāng)Cu2+與MT結(jié)合達到飽和會和Zn2+一起表現(xiàn)毒性，并且較之前的毒性更強，表現(xiàn)為低毒性強度的Zn2+對Cu2+的協(xié)同作用；而當(dāng)Cu2+、Zn2+毒性強度相近時，表現(xiàn)為相互獨立作用。但是，由于實驗中的各種因素，如生物、環(huán)境以及毒性強度配比設(shè)計等都會對聯(lián)合毒性的結(jié)果產(chǎn)生影響，所以，有關(guān)Cu2+、Zn2+對梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性作用機理還需進一步開展研究。

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Acute Toxicity of Cu2+,Zn2+to Juveniles of Portunus trituberculatus

SU Zhi-xing1,HE Jie2,XU Wen-jun1,et al
(1.School of Fisheries of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine and Fishery Research Intitute of Zhejiang Ocean University,Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

Portunus trituberculatus juveniles with body weight of 15.3±1.2 g have been chosen as the subjectsof our experiment which were exposed to heavy metalions(Cu2+,Zn2+)to investigate the influences of acute toxicity and joint toxicity by using stagnophile test method.The results showed that the median lethal concentrations(LC50)of Cu2+,Zn2+for 96 h to juveniles of P.trituberculatus was 3.934 mg/L and 3.901 mg/L respectively,and the safety concentrations(SC)of Cu2+,Zn2+for 96 h was 0.039 34 mg/L and 0.039 01 mg/L,respectively.The results of the joint toxicity experiment showed that the joint toxicity at 96 h by the pairs of Cu2+-Zn2+was found complicated in relation to the concentration,low intensity Cu2+and high intensity Zn2+were antagonism,low intensity Zn2+and high intensity Cu2+were synergism and same intensity of Cu2+and Zn2+showed absolute effect.

Cu2+;Zn2+;actute toxicity;joint toxicity;Portunus trituberculatus;juveniles

S912

A

2096-4730(2017)04-0302-06

2017-03-30

浙江省科技廳計劃項目（2016F50042；2015F30003）；舟山市科技項目（2017C43032）；浙江海洋大學(xué)博士啟動基金（22135010815）

蘇志星(1991-)，男，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向：蟹類健康養(yǎng)殖.E-mail：zxsu1991@hotmail.com

許文軍(1971-)，男，教授，研究方向：海水健康養(yǎng)殖.E-mail：wjxu1971@hotmail.com.