陳澄，王洪梅，李小童，陶怡，張旭敏

（1.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海 200131；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

超高效液相質(zhì)譜法測(cè)定人肝細(xì)胞中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素含量

陳澄1,2，王洪梅1，李小童1，陶怡1，張旭敏2

（1.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海 200131；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

為測(cè)定人肝細(xì)胞鳥氨酸循環(huán)中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸及尿素的含量，建立了該超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的分析方法。本方法采用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相，色譜分離后直接進(jìn)串聯(lián)質(zhì)譜，采用電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。由于人肝細(xì)胞中含有大量的被測(cè)物質(zhì)，故本方法采用水作為替代基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證，該方法有效、可靠，符合方法學(xué)的各項(xiàng)驗(yàn)證結(jié)果。

L-精氨酸；L-鳥氨酸；L-瓜氨酸；尿素；鳥氨酸循環(huán)；肝細(xì)胞

近年來，有較多關(guān)于檢測(cè)精氨酸及相關(guān)代謝途徑的物質(zhì)的報(bào)道[1]。在分析方法上，有通過加入衍生劑對(duì)精氨酸等目標(biāo)化合物進(jìn)行衍生后用反相色譜的方法進(jìn)行分析測(cè)定[2]，也有用親水作用色譜柱對(duì)其進(jìn)行保留分離分析[3]，但在這些成分測(cè)定中，尿素一直未被關(guān)注。在檢測(cè)基質(zhì)上，大部分報(bào)道都集中在人和動(dòng)物的血漿中，也有一些是測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞等其他生物樣本，關(guān)于肝細(xì)胞中這些組分的測(cè)定，從未見報(bào)道。本文旨在建立一個(gè)UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，同時(shí)測(cè)定人肝細(xì)胞中的L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素的含量，可以直觀地看到這些物質(zhì)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC（新加坡，Waters公司）；API4000三重四極桿質(zhì)譜儀（新加坡，Sciex公司），配有電噴霧離子源；天平（CP225D，德國(guó)，賽多利斯）；超純水儀；離心機(jī)；振蕩器；移液槍；聚丙烯96孔板，2.2mL/孔。

L-精氨酸（L-Arg）標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99.5%；L-鳥氨酸（L-Orn）標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99.0%；L-瓜氨酸（L-Cit）標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于98%；尿素（Urea）標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于98.5%；內(nèi)標(biāo)，L-精氨酸-13C6鹽酸鹽（L-Arg-13C6）標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99.0%；冷凍人肝細(xì)胞（十個(gè)供體，混合性別，BioreclamationIVT）；Williams’E培養(yǎng)液（Gibco,Invitrogen）；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨，均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素用甲醇溶解并配制成10mmol/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用50%甲醇水溶液將L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸分別配制成中間濃度工作液，濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000μmol/L；尿素用50%甲醇水溶液配制成40、80、160、320、640、1 280、2560、4 000μmol/L中間濃度工作液，然后將這4種標(biāo)準(zhǔn)品配制到水中成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的最終標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 為 0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100μmol/L，尿素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2、4、8、16、32、64、128、200μmol/L。

取100μL樣品加入400μL含有1μmol/L L-精氨酸-13C6內(nèi)標(biāo)的0.1mol/L檸檬酸甲醇水溶液（v∶v=80∶20），將樣品板充分混合均勻后，在4℃條件下4000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液100μL置于新的96孔板中，加入300μL乙腈，充分搖勻后，用于分析。

1.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱子（2.1mm×100mm，1.7μm)；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：4μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.6mL/min，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1.0min，保持95% B相；1.0～3.5min，B相由90%線性遞減至60%；3.5～4.0min，保持60% B相，4.0～4.5min，B相由60%遞增至95%，4.5～5.5min，保持95% B相。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式；電噴霧電壓為5.5kV；氣簾氣為20kPa；霧化氣為50kPa；輔助加熱氣為60kPa；離子源溫度為600℃；碰撞氣為10V；入口電壓為10V；碰撞室出口電壓為15V；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

本文結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室條件，比較了幾種不同組成成分的流動(dòng)相：（1）A相 0.3%甲酸水溶液，B相0.3%甲酸乙腈溶液；（2）A相0.1%甲酸水溶液，B相0.1%甲酸乙腈溶液；（3）A相 0.3%甲酸和10mmol/L醋酸銨水溶液，B相0.3%甲酸和10mmol/L醋酸銨水/乙腈（v∶v,5∶95）溶液；（4）A相10mmol/L醋酸銨水溶液，B相純乙腈。

結(jié)果表明，在（3）條件下，尿素?zé)o法獲得很好的峰形，3種氨基酸的峰形略有拖尾；在（4）條件下，3種氨基酸拖尾較為嚴(yán)重，尿素的基線響應(yīng)較高，都不太適合用于分析。條件（1）和（2）中，4種物質(zhì)均能獲得較好的峰形和響應(yīng)信號(hào)，且差異不大，考慮到條件（2）更節(jié)約試劑，也方便配制，故最終選擇條件（2）作為液相條件。

2.2 樣品沉淀劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是肝細(xì)胞鳥氨酸循環(huán)中4種組分的含量，如何徹底終止該循環(huán)，準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞中這4種組分的含量成為其又一難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白沉淀提取法，分別考察了純乙腈、純甲醇、含10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）的甲醇溶液、含1%甲酸的甲醇溶液和含有0.1mol/L檸檬酸的甲醇水溶液（v∶v=80∶20）等不同溶劑的沉淀效果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有用0.1mol/L檸檬酸甲醇水溶液作為沉淀劑時(shí)，能測(cè)到肝細(xì)胞中4種組分的含量，且加標(biāo)質(zhì)控樣品均符合要求。而使用其他4種沉淀劑，都無法測(cè)到樣品中L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸的含量，推測(cè)使用這些沉淀劑不能很好的提取到細(xì)胞內(nèi)的這幾種物質(zhì)或是無法使細(xì)胞內(nèi)的鳥氨酸循環(huán)徹底終止。

2.3 方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度

該方法中，L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸的線性范圍為0.50～100μmol/L，尿素的線性范圍為2.00～200μmol/L。標(biāo)曲采用線性回歸，L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素的校正曲線決定系數(shù)（R2）分別為0.994 76、0.995 15、0.995 74、0.992 94。校正曲線圖如圖1～4所示。

圖1 L-精氨酸校正曲線

圖2 L-鳥氨酸校正曲線

圖3 L-瓜氨酸校正曲線

圖4 尿素校正曲線

該分析方法中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的定量下限分別達(dá)到0.5μmol/L、0.5μmol/L、0.5μmol/L和2μmol/L，具有足夠的響應(yīng)和良好的信噪比。尿素的本底基線雖然較高，但其定量下限的信噪比也可達(dá)到5以上，滿足分析要求。四種物質(zhì)的定量下限色譜圖如圖5～8所示。

圖5 L-精氨酸定量下限色譜圖

圖6 L-鳥氨酸定量下限色譜圖

圖7 L-瓜氨酸定量下限色譜圖

圖8 尿素定量下限色譜圖

本方法用水作為替代基質(zhì)來定量分析人肝細(xì)胞中化合物，故分別做了兩組質(zhì)控樣品考察其準(zhǔn)確度和精密度，見表1和表2。第一組質(zhì)控樣品為設(shè)置低中高3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的濃度為1.5、20、80μmol/L，尿素的濃度為6、40、160μmol/L）配制在水中，每個(gè)濃度6個(gè)平行，通過與理論值的偏差來計(jì)算其準(zhǔn)確度，通過6個(gè)平行樣品的變異系數(shù)來評(píng)估精密度。第二組質(zhì)控樣品為在復(fù)蘇后的人肝細(xì)胞（細(xì)胞濃度為1×106cells/mL）中加入低中高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（濃度同第一組），每個(gè)濃度6個(gè)平行樣品，用于評(píng)估其準(zhǔn)確度和精密度。

表1 第一組質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

表2 第二組質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

結(jié)果表明在兩組質(zhì)控樣品中，所有樣品的準(zhǔn)確度在85.27%～113.94%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.17%～4.28%，均在允許范圍內(nèi)，符合分析要求，證明該方法可成功應(yīng)用于人肝細(xì)胞中的含量檢測(cè)。

3 結(jié)論

本分析方法簡(jiǎn)便，穩(wěn)定、可重現(xiàn)，符合方法學(xué)的各項(xiàng)驗(yàn)證。該方法首次測(cè)定了人體肝細(xì)胞中的L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素的含量，為人體內(nèi)尿素循環(huán)的相關(guān)后續(xù)科學(xué)研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]JMartens-Lobenhoffer,SMBode-Boger.Mass spectrometric quantification of L-arginine and its pathway related substances in biofluids:the road to maturity[J].Journal of Chromatography B,2014,964:89.

[2]Iole Maria Di Gangi,Lino Chiandetti,Antonina Gucciardi,et al.Simultaneous quantitative determination of NG,NG-dimethyl-l-arginine or asymmetric dimethylarginine and related pathway's metabolites in biological fluids by ultrahigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass spectrometry [J].Analytica Chimica Acta,2011,677(2):140-148.

[3]CMBrown,JOBecker,PMWise,et al.Simultaneous determination of 6 L-arginine metabolites in human and mouse plasma by using hydrophilic-interaction chromatogramphy and electrospray tandem mass spectrometry[J].Clinical Chemistry,2011,57(5):701.

Determination of L-Arginine,L-Ornithine,L-Citrulline and Urea in Human Liver Cells by Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry

Chen Cheng1,2，Wang Hong-mei1,Li Xiao-tong1,Tao Yi1,Zhang Xu-min2
(1.Non-GLP BAS,WuXi Apptec,Shanghai 200131;2.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433)

In order to determine the content of L- arginine,L- ornithine,L- citrulline and urea in ornithine cycle of human liver cells,an UPLC-MS/MS method was developed for the determination of ornithine arginine in human liver cells.This method uses ACQUITY UPLC BEH Amide column with 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1%formic acid acetonitrile as mobile phase chromatography direct tandem mass spectrometry with electrospray ion source and positive ion multiple reaction monitoring mode detection.As human liver cells contain a large number of tested substances,this method uses water as an alternative substrate for detection.The method is proved to be effective and reliable,and conforms to the validation results of the methodology.

L- Arginine;L- Ornithine;L- Citrulline;Urea;Ornithine cycle;Hepatocytes

O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-0055-04

陳澄（1985—），女，上海人，本科，研究方向：新藥研發(fā)。