汪國(guó)敏 ，李麗燕 ，吳小燕 ，林文博 ，馮雨林 ，董飛俠

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院，浙江 溫州 325000 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000

◆方藥研究◆

清化固腎排毒顆粒對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響

汪國(guó)敏1，2，李麗燕2，吳小燕1，2，林文博1，2，馮雨林1，2，董飛俠1，2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院，浙江 溫州 325000 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000

目的：觀察清化固腎排毒顆粒對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1） 和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)的影響，探討其抗腎纖維化的作用機(jī)制。方法：72只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、洛丁新組及清化固腎排毒顆粒組，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)方法（UUO）建立腎纖維化梗阻大鼠模型，術(shù)后各組分別予相應(yīng)藥物或生理鹽水灌胃，每天1次。第7、14、21天，各組大鼠禁食不禁水1天，處死，取腎組織做病理檢測(cè)，HE染色觀察其病理變化，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TGF-β1和α-SMA在腎間質(zhì)的陽(yáng)性染色表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，干預(yù)第7、14、21天，模型組、洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)顯著增加，腎組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)第7、14、21天，洛丁新組和清化固腎排毒顆粒組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)明顯減輕，腎組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：清化固腎排毒顆?？赡芡ㄟ^(guò)下調(diào)TGF-β1和α-SMA的表達(dá)來(lái)抑制上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積聚，實(shí)現(xiàn)改善腎間質(zhì)纖維化的作用。

輸尿管梗阻；腎纖維化；清化固腎排毒顆粒；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；大鼠

腎纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展導(dǎo)致腎功能衰竭的病理過(guò)程，腎纖維化包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，而腎小管間質(zhì)纖維化與慢性腎臟病的預(yù)后密切相關(guān)，延緩腎間質(zhì)纖維化的程度成為慢性腎臟病防治的關(guān)鍵。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型是目前對(duì)腎纖維化研究比較成熟的一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，單側(cè)輸尿管梗阻后尿路壓力逐漸增高，腎臟血流量減少，靜脈引流堵塞，出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維細(xì)胞增殖，形成疤痕，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化產(chǎn)生，最終使腎功能衰竭。清化固腎排毒方由黃芪、山藥、柴胡、白花蛇舌草、金錢草、大黃等中藥組成，針對(duì)慢性腎臟病脾腎虧虛為本、水濕痰濁瘀血為標(biāo)的病機(jī)，治以益氣活血化瘀，利濕化痰祛濁，治療慢性腎臟病有較好的療效[1～2]。本實(shí)驗(yàn)研究清化固腎排毒顆粒對(duì)UUO大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響，探討其抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠72只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2015-0009，于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，每籠6只，人工光照，陰暗各12 h，室溫20～24℃，空氣相對(duì)濕度(50±10)%，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

清化固腎排毒顆粒(批號(hào)：20141207，江陰天江藥業(yè)有限公司，藥物組成：黃芪、山藥、柴胡、白花蛇舌草、金錢草、大黃、白芥子)；洛丁新(批號(hào)：12294563，鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥有限公司)。

1.3 主要試劑和儀器

抗TGF-β1抗體(編號(hào)ab92486，英國(guó)Abcam公司)；抗α-SMA抗體(編號(hào)ab5694，英國(guó)Abcam公司)；一抗稀釋液(北京索萊寶生物科技公司)；HE試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；PBS、檸檬酸緩沖液、濃縮型DAB試劑盒、超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑(北京中杉金橋公司)。超低溫冰箱(DW-86L626)，中國(guó)海爾公司；切片機(jī)(RM2235)，德國(guó)Leica公司；組織脫水機(jī)(KD-TS3A)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡(BX51)，日本Olympus公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)(Biosen SC300)，上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠模型制備

72只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組，每組18只。模型組、洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠以10%的水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后取右側(cè)臥位固定，局部剃毛，從背部距左側(cè)脊肋角1.5 cm做一斜向切口，逐層切開皮膚、肌肉等組織，開腹，暴露左側(cè)腎臟，游離腎臟及左側(cè)輸尿管，分別于約腎盂處和輸尿管上段處雙重結(jié)扎且不剪斷，回納腎臟歸于原位后逐層縫合切口。假手術(shù)組開腹后只分離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎，其余步驟同上。

1.5 給藥

假手術(shù)組、模型組予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組灌胃相應(yīng)濃度的藥物溶液。清化固腎排毒顆粒組按相當(dāng)于60 kg體質(zhì)量成人每天劑量的10倍給藥(成人每天劑量9 g)，給藥劑量為1.5 g/(kg·d)；洛丁新組予洛丁新，給藥劑量為1.6 mg/(kg·d)。

1.6 取材

各組大鼠分別于給藥后第7、14、21天，隨機(jī)取出6只，禁食不禁水1天，處死，留取梗阻側(cè)腎臟，除去包膜，放出積水，迅速分切腎組織，將其中一份于4%多聚甲醛溶液中固定，其余組織生理鹽水沖洗后迅速置于液氮中凍存，轉(zhuǎn)置-80℃冰箱中保存。

1.7 病理觀察

各組大鼠腎組織石蠟包埋切片后，腎臟組織常規(guī)染色觀察，取經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h的腎臟組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm石蠟切片，按常規(guī)方法行HE染色。HE染色評(píng)定：光學(xué)顯微鏡觀察(×400倍)，依據(jù)每個(gè)視野腎小管病變(腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等)累及的小管數(shù)目評(píng)定腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。0分：腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)病變；1分：腎小管病變數(shù)目＜3個(gè)；2分：腎小管病變數(shù)目3～5個(gè)；3分：腎小管病變數(shù)目＞5個(gè)或腎小管結(jié)構(gòu)消失。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野不相重疊的皮質(zhì)處腎小管，每只大鼠選5張組織切片，最后取平均值。

1.8 免疫組化

3 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中高壓煮沸修復(fù)抗原，加3%H2O2孵育20 min(室溫)；滴加山羊血清封閉液(室溫封閉 30 min)，滴加一抗，抗 TGF-β1(1∶200)、α-SMA(1∶200)，4℃過(guò)夜。加使用聚合HRP標(biāo)記的二抗(37℃、20 min)，DAB顯色、蒸餾水洗滌、蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。在400倍光鏡下觀察，其中棕黃色部分為陽(yáng)性染色。避開邊緣及組織，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)非重疊視野，使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，分析每張照片中陽(yáng)性染色面積占視野總面積的比值，取平均值作為該切片的陽(yáng)性面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)進(jìn)行比較，兩兩之間多重比較，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟組織病理結(jié)果比較

見(jiàn)圖1、表1。①HE染色組織形態(tài)觀察：假手術(shù)組腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管排列緊密，間質(zhì)中未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞彌漫性空泡變性，管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞萎縮、壞死，腎間質(zhì)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生和腎間質(zhì)纖維化，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，情況進(jìn)一步加重，在第21天時(shí)上述變化最為顯著。洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎小管損傷程度較模型組明顯減輕，可見(jiàn)部分結(jié)構(gòu)完整的腎小管，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。②腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較：與假手術(shù)組比較，干預(yù)第7、14、21天，模型組、洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)顯著增加(P＜0.05)，且隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，損傷指數(shù)逐漸增加。與模型組比較，干預(yù)第7、14、21天，洛丁新組和清化固腎排毒顆粒組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)明顯減輕(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠不同時(shí)段腎纖維化情況 (HE染色，×400)

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較(±s，n=6) 分

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較(±s，n=6) 分

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組洛丁新組清化固腎排毒顆粒組7 d 0.12±0.33 2.14±0.53①1.50±0.51①②1.68±0.47①②14 d 0.26±0.44 2.54±0.54①1.76±0.52①②1.90±0.36①②21d 0.34±0.52 2.80±0.40①2.46±0.65①②2.28±0.57①②

2.2 各組大鼠各時(shí)段腎組織TGF-β1表達(dá)比較

見(jiàn)圖2、表2。假手術(shù)組大鼠腎組織可見(jiàn)TGF-β1在腎間質(zhì)呈少量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，模型組中TGF-β1在腎間質(zhì)呈大量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，洛丁新組和清化固腎排毒顆粒組中TGF-β1在腎間質(zhì)呈中等量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，干預(yù)第7、14、21天，模型組、洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，且呈持續(xù)升高趨勢(shì)，在21天時(shí)TGF-β1表達(dá)最為顯著。與模型組比較，干預(yù)第7、14、21天，洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。干預(yù)第7、14、21天，洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠不同時(shí)段腎組織TGF-β1表達(dá) (免疫組化染色，×400)

表2 各組大鼠各時(shí)段腎組織TGF-β1表達(dá)比較(±s，n=6)%

表2 各組大鼠各時(shí)段腎組織TGF-β1表達(dá)比較(±s，n=6)%

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組洛丁新組清化固腎排毒顆粒組7 d 0.02±0.01 0.23±0.03①0.10±0.05①②0.14±0.01①②14 d 0.03±0.01 0.35±0.05①0.18±0.05①②0.20±0.05①②21 d 0.03±0.01 0.59±0.06①0.30±0.03①②0.29±0.01①②

2.3 各組大鼠各時(shí)段腎組織α-SMA表達(dá)比較

見(jiàn)圖3、表3。假手術(shù)組大鼠腎組織中可見(jiàn)α-SMA在腎間質(zhì)呈微量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，模型組中α-SMA在腎間質(zhì)呈大量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，洛丁新組和清化固腎排毒顆粒組中α-SMA在腎間質(zhì)呈中等量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，干預(yù)第7、14、21天，模型組、洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎組織α-SMA表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，且呈持續(xù)升高趨勢(shì)，在21天時(shí)α-SMA表達(dá)最為顯著。與模型組比較，干預(yù)第7、14、21天，洛丁新組、清化固腎排毒顆粒組大鼠腎組織α-SMA表達(dá)均明顯降低(P＜

0.05)。干預(yù)第7、14、21天，洛丁新組、清化固腎 排毒顆粒組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖3 各組大鼠不同時(shí)段腎組織α-SMA表達(dá) (免疫組化染色，×400)

表3 各組大鼠各時(shí)段腎組織α-SMA表達(dá)比較(±s，n=6)%

表3 各組大鼠各時(shí)段腎組織α-SMA表達(dá)比較(±s，n=6)%

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組洛丁新組清化固腎排毒顆粒組7 d 0.04±0.03 0.26±0.04①0.16±0.02①②0.17±0.02①②14 d 0.04±0.02 0.42±0.07①0.30±0.02①②0.31±0.02①②21 d 0.07±0.02 0.59±0.03①0.44±0.03①②0.42±0.03①②

3 討論

腎纖維化是慢性腎臟病發(fā)展至終末期的共同通路，其中細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)和相關(guān)信號(hào)通路參與其中。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)作為公認(rèn)的致纖維化細(xì)胞因子在腎纖維化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[3～4]。EMT是腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。大量研究證明，腎小管間質(zhì)纖維化程度是判斷腎臟病患者預(yù)后最重要的指標(biāo)，其主要病理表現(xiàn)為腎小管和腎間質(zhì)被大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度積聚，出現(xiàn)大量的肌成纖維細(xì)胞[5]。研究表明，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的主要標(biāo)記蛋白[6]，是肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志[7]。因此，TGF-β1和α-SMA的表達(dá)對(duì)于EMT和ECM的進(jìn)展及預(yù)后具有重要意義。

中醫(yī)沒(méi)有關(guān)于腎纖維化的專業(yè)術(shù)語(yǔ)，但是其所表現(xiàn)出的臨床癥候，可見(jiàn)于中醫(yī)的水腫、腰痛、癃閉、虛勞、關(guān)格等病癥中[8]，屬于中醫(yī)腎絡(luò)病的范疇。腎絡(luò)病的病機(jī)特點(diǎn)主要是“易滯易瘀、易入難出、易積成形”[9]，治療上以益氣活血化瘀、利濕化痰祛濁為主。清化固腎排毒方是溫州市中醫(yī)院的自擬方，方中黃芪健脾利尿消腫，山藥益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾固腎，柴胡、白花蛇舌草清熱，大黃活血化瘀解毒，白芥子清皮里膜外之痰，全方共奏益氣健脾、清熱活血之功。前期的實(shí)驗(yàn)研究也表明清化固腎排毒方有抗腎纖維化、延緩腎功能的作用[10]。

本研究HE染色結(jié)果顯示，模型組在第7天出現(xiàn)腎小管間質(zhì)損傷，腎小球病變不明顯，腎小管上皮細(xì)胞萎縮、壞死，腎間質(zhì)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生，且隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸加重，在第21天時(shí)上述變化最為顯著；經(jīng)過(guò)藥物治療后，清化固腎排毒顆粒組和洛丁新組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)減輕(P＜0.05)，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎纖維化程度減輕；免疫組化顯示，模型組大鼠腎組織在第7天TGF-β1、α-SMA陽(yáng)性表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，且呈持續(xù)升高趨勢(shì)，在第21天時(shí)TGF-β1、α-SMA表達(dá)最為顯著，表明模型組大鼠出現(xiàn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積聚；經(jīng)過(guò)清化固腎排毒顆粒治療后，TGF-β1、α-SMA陽(yáng)性表達(dá)降低(P＜0.05)。此前的文獻(xiàn)也表明清化固腎排毒方是通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)從而抗腎間質(zhì)纖維化作用，與本研究結(jié)果一致[10～12]。

綜上，清化固腎排毒顆粒具有抗腎纖維的作用，其機(jī)制可能是下調(diào)UUO大鼠腎組織 TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚，達(dá)到抗腎纖維化的作用，但由于腎纖維化機(jī)制的復(fù)雜性，清化固腎排毒顆粒抗腎纖維化相關(guān)信號(hào)通路之間相互聯(lián)系及共同發(fā)生作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Qinghua Gushen Paidu Granules Has Effect on TGF-β1 and α-SMA Expression of Nephridial Tissue of Rat with Unilateral Ureteral Obstruction

WANG Guomin，LI Liyan，WU Xiaoyan，LIN Wenbo，F(xiàn)ENG Yulin，DONG Feixia

Objective：To observe the effect of Qinghua Gushen Paidu granules on expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)and α-smooth muscle actin(α-SMA)of nephridial tissue of rats with unilateral ureteral obstruction，and investigate its mechanism of anti-renal fibrosis.Methods：Divided 72 SD rats of SPF grade into sham group，model group，Lotensin group，and Qinghua Gushen Paidu granules group randomly.In addition to the sham group，all groups were given unilateral ureteral occlusion(UUO)to establish rat models of renal fibrosis obstruction and respectively

medication or saline by gavage after surgery，once a day.On the 7th，14th，and 21stday of treatment，rats in each group fasted for one day without water-fasting and were sacrificed.Then kidney tissue of the rats were collected for pathology test.Observed pathological changes by using HE staining， and detected positive staining expression of TGF- β1 and α-SMA in renal interstitium by immunohistochemical staining.Results：Compared with the sham group，on the 7th， 14th， and 21stday of intervention，the damage indexes of renal tubular interstitium in other groups were evidently improved，and the expression of TGF-β1 and α-SMA of kidney tissue was also obviously increased，differences being significant(P＜ 0.05).Compared with the model group， on the 7th， 14th， and 21stday of intervention， the damage indexes of renal tubular interstitium and theexpression of TGF- β1 and α-SMA of renal tissue in the Lotensin group and Qinghua Gushen Paidu granules group were evidently decreased，differences being significant(P＜ 0.05).Conclusion：Qinghua Gushen Paidu granules may prevent the mesenchymal transition in epithelial cells and excessive accumulation of matrix out of epithelial cells by reducing the expression of TGF- β1 and α-SMA so as to improve renal fibrosis.

Ureteral obstruction；Renal fibrosis；Qinghua Gushen Paidu granules；Transforming growth factor-β1(TGF-β1)；α-smooth muscle actin(α-SMA)；Animal experiment；Rats

R693

A

0256-7415（2018）01-0001-06

10.13457/j.cnki.jncm.2018.01.001

2017-06-13

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY14H270001）；浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目（2013ZB121）

汪國(guó)敏（1989-），男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治腎臟疾病的研究。

董飛俠，E-mail：cgrsfhtd@163.com。

馮天保，鄭鋒玲）