趙現(xiàn)哲丁立新劉曉丹周平坤姜曉燕 * 丁庫克*

( 1．中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所放射生態(tài)研究室，北京 　100088；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 　100850 )

早反應(yīng)基因5(immediate early response gene 5，IER5)是慢動力早期反應(yīng)基因家族成員之一，由Williams等[1]發(fā)現(xiàn)并命名，且在眾多動物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)，人的IER5基因位于1號染色體1q25.3處，cDNA全長2 369 bp。IER5基因作為慢動力早期反應(yīng)基因家族中的一員，是一種富含脯氨酸且具有多個核酸位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，人IER5基因可編碼308個氨基酸，其蛋白分子相對質(zhì)量約33.7 kD，為核內(nèi)蛋白，在進(jìn)化過程中具有高度保守性[1-2]。 2006年，周平坤等[3-5]為尋找輻射敏感基因，采用基因芯片技術(shù)篩選對輻射可誘導(dǎo)mRNA表達(dá)上調(diào)的基因，其中就有IER5。近年來的研究表明，IER5基因具有廣泛的生物學(xué)功能，其表達(dá)抑制可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，也可提高細(xì)胞的輻射抗性，它還可作為評估輻射劑量的標(biāo)志物，在腫瘤的增殖和凋亡中扮演著重要角色[6-9]。 2011年，李莉等[10]利用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了特異性抑制IER5基因的IER5-siRNA-HeLa細(xì)胞系，為研究IER5基因輻射誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制及揭示IER5生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。本文就近年來有關(guān)外界刺激下腫瘤細(xì)胞中IER5相關(guān)生物學(xué)功能的研究進(jìn)展研究作一概述。

1　外界刺激時(shí)IER5的應(yīng)激性反應(yīng)

HeLa細(xì)胞在熱壓力作用下，IER5與熱休克因子(heat shock factor 1，HSF1)可發(fā)生相互作用。Ishikawa等[11]研究發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞在熱壓力作用下，IER5的表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期G2期阻滯，從而對熱壓力造成的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，并對不能修復(fù)的細(xì)胞進(jìn)行識別，誘導(dǎo)其凋亡。其中誘導(dǎo)IER5表達(dá)的是HSF1，HSF1在正常狀態(tài)下是以磷酸化狀態(tài)存在，而IER5啟動子區(qū)域包含有HSF1結(jié)合位點(diǎn)，即HSF1是通過誘導(dǎo)IER5的表達(dá)來對外界刺激作出反應(yīng)。IER5與HSF1的去磷酸化有關(guān)，IER5通過與蛋白磷酸2A(protein phosphatese 2A，PP2A)及其副族調(diào)節(jié)蛋白共同作用來使HSF1去磷酸化[12]。去磷酸化的HSF1進(jìn)入細(xì)胞核后可以激活HSF1的靶基因即熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)家族基因，其中包括HSP70基因，而這些靶基因的表達(dá)對細(xì)胞自我修復(fù)，細(xì)胞周期和排已等功能起著關(guān)鍵作用。在HSP70基因中含有熱休克元件(heat shock element，HSE)序列，而HSE序列正好是HSF1基因的識別序列，它可有效誘導(dǎo)HSF1的轉(zhuǎn)錄[13]。即在熱壓力條件下HSF1可以刺激IER5的轉(zhuǎn)錄，而IER5與PP2A及其副族調(diào)節(jié)蛋白共同作用可以使磷酸化的HSF1去磷酸化，去磷酸化的HSF1進(jìn)入細(xì)胞核后又可以激活對細(xì)胞具有修復(fù)功能的HSP家族基因，而HSP家族基因中HSP70基因的HSE序列又可以誘導(dǎo)HSF1基因的轉(zhuǎn)錄，整個過程顯示IER5是HSF1的正反饋調(diào)節(jié)者，通過IER5的調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)HSP家族基因的表達(dá)，讓細(xì)胞從熱休克中有效恢復(fù)，對不能識別修復(fù)的即誘導(dǎo)其凋亡。而且在有無熱壓力的條件下均能刺激HSF1轉(zhuǎn)錄。這對HeLa細(xì)胞應(yīng)對外界刺激迅速作出反應(yīng)和損傷細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)修復(fù)具有重要意義[12-13]。

2　輻射條件下IER5的表達(dá)

輻射條件下，腫瘤細(xì)胞中IER5表達(dá)量升高，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。丁庫克等[15]通 過對HeLa細(xì)胞和AHH1細(xì)胞進(jìn)行60Co γ射線照射后發(fā)現(xiàn)IER5表達(dá)量升高，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)AHH1細(xì)胞比HeLa細(xì)胞更敏感，更容易誘導(dǎo)IER5基因表達(dá)。之后丁庫克等[15]又進(jìn)一步將人的4種腫瘤細(xì)胞(肝癌HepG2、乳腺癌MCF-3、肺癌A549、腦瘤BT125)接種到裸鼠皮下，待腫瘤塊生長至約1.00 cm×1.00 cm時(shí)，采用γ射線照射裸鼠，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)4種腫瘤細(xì)胞中IER5的mRNA均出現(xiàn)明顯升高，而且也發(fā)現(xiàn)肝癌、乳腺癌細(xì)胞比腦瘤、肺癌細(xì)胞對輻射更敏感[15]，這也為肝癌、乳腺癌的臨床放療方案優(yōu)化提供了理論依據(jù)。基于上面的研究，丁庫克等提出IER5基因有可能成為宮頸癌與肝癌新的輻射損傷生物標(biāo)志物，對宮頸癌與肝癌放療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。劉洋等[16]通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)宮頸癌腫瘤組織中IER5的表達(dá)量和腫瘤大小有關(guān)，并且提出了IER5蛋白可以作為一種潛在的宮頸癌放療增敏劑，也可以作為一種預(yù)測宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的生物標(biāo)記物。

GC結(jié)合因子(GC binging factor，GCF)是順式調(diào)控元件，對IER5的表達(dá)起負(fù)性調(diào)控作用。史海敏等[17-18]通過基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建了GCF-shRNA-HeLa單克隆細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)受輻照的HeLa細(xì)胞中IER5蛋白表達(dá)量隨著輻照劑量的增加而增加，同時(shí)在照射后隨著輻照時(shí)間的延長其表達(dá)量出現(xiàn)先上升后下降。之所以出現(xiàn)這種趨勢，可能是隨著照射劑量增加，順式調(diào)控元件GCF對IER5的抑制作用不斷減弱，IER5的表達(dá)增多可進(jìn)一步啟動細(xì)胞內(nèi)的自我修復(fù)和識別機(jī)制，損傷較重的細(xì)胞不斷被誘導(dǎo)凋亡，從而IER5表達(dá)量減少，出現(xiàn)下降趨勢。這種劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系對我們在腫瘤放療劑量的選擇以及輻射后施加一些放療藥物的時(shí)間選擇方面均有一定的指導(dǎo)作用，為IER5基因在臨床中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，也有助于我們尋找對輻射敏感的生物標(biāo)記物。在IER5的調(diào)控下，損傷較輕的細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)，而腫瘤細(xì)胞分裂較旺盛，對輻射敏感性強(qiáng)，因此在輻射誘導(dǎo)下自我修復(fù)能力較弱，出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象。同時(shí)研究[18]也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌放療后IER5的表達(dá)量與照射劑量有關(guān)，而與放療后臨床效果無關(guān)。Asano等[19]通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IER5可以被各種分裂素如血清等刺激誘導(dǎo)表達(dá)，我們也發(fā)現(xiàn)IER5在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，這些說明了各種不同的刺激和致癌基因信號都可以誘導(dǎo)IER5的表達(dá)。YANG等[8]通過轉(zhuǎn)染IER5質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)IER5過表達(dá)時(shí)可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，且在放療和順鉑誘導(dǎo)下IER5表達(dá)量升高，細(xì)胞生存率下降。這說明IER5對腫瘤細(xì)胞的生長增殖具有重要意義，有望成為腫瘤靶向治療潛在的新靶點(diǎn)。

3　IER5基因與p53

p53基因?qū)儆谝职┗蚣易?，與熱休克因子HSF1一樣，都可以調(diào)節(jié)壓力反應(yīng)，幫助受壓迫的細(xì)胞修復(fù)。正常情況下，p53可以激活抑癌基因的表達(dá)，同時(shí)它的一些靶基因[20-22](如p21、cyclin、Gadd45、AEN等基因)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡、新陳代謝和體內(nèi)平衡等作用，在壓力條件下這些靶基因可以通過清除一些不可修復(fù)的細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡。但p53又是人體內(nèi)突變頻率最高的基因，在p53基因發(fā)生突變的情況下，因不能有效誘導(dǎo)抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而可能導(dǎo)致腫瘤形成，在壓力條件下，p53的生存反應(yīng)可能會通過新陳代謝發(fā)生改變?nèi)鐮I養(yǎng)剝奪，讓一些本該發(fā)生凋亡的細(xì)胞存活下來[19]。

Asano等[19]通過芯片技術(shù)對IER5啟動子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在其啟動子區(qū)域附近有兩個p53結(jié)合位點(diǎn)，將其命名為 RE1和RE2，分別位于IER5基因下游46 kb (RE1)和11 kb (RE2)的位置。他們通過實(shí)驗(yàn)觀察到RE2是超強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)[23]，p53通過與RE2或者RE1結(jié)合有助于運(yùn)行軌跡上高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，而高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成時(shí)，RE2定位在IER5啟動子附近，對IER5啟動子基因起作用，因此認(rèn)為p53是通過RE2作用于IER5，誘導(dǎo)IER5基因表達(dá)。該研究表明許多腫瘤細(xì)胞需要通過超強(qiáng)子去驅(qū)動關(guān)鍵致癌基因才能形成腫瘤[24]。因此把超強(qiáng)子和IER5基因的表達(dá)聯(lián)系起來，可以看出IER5基因很可能是腫瘤形成的一個重要基因，該研究也發(fā)現(xiàn)IER5在腫瘤細(xì)胞錨定增殖及非依賴性生長中也有重要的作用[19]。HSF1在腫瘤細(xì)胞的形成和增殖中也發(fā)揮著重要的作用，癌細(xì)胞中IER5被生長因子刺激后過表達(dá)，激活HSF1，HSF1又激活和腫瘤形成相關(guān)的基因(包括HSP家族基因)[11-13]。在此過程中HSF1會受到p53和IER5的調(diào)控。而IER5基因是p53的靶基因，而當(dāng)p53功能缺失或突變?nèi)缫吧蚿53形成時(shí)可能導(dǎo)致腫瘤的形成[19]，因此可以說他們都具有促進(jìn)腫瘤形成的潛質(zhì)。

4　IER5參與細(xì)胞周期調(diào)控

生物信息學(xué)分析顯示在IER5啟動子區(qū)域有3個順式調(diào)控元件，其中包括GC結(jié)合因子(GC binging factor，GCF)和核因子I(nuclear factor I，NFI)，GCF對IER5的表達(dá)起負(fù)性調(diào)控作用，NFI對IER5起正性調(diào)控作用。丁庫克等[6，25]證實(shí)HeLa細(xì)胞中GCF和IER5啟動子結(jié)合可抑制IER5的表達(dá)，而在輻射條件下這種抑制作用逐漸消失，IER5的表達(dá)量隨著輻射劑量的增加而增加，同時(shí)也觀察到部分受照射的HeLa細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象和G2期阻滯。而一部分處于G2期的細(xì)胞在接受輻照后發(fā)生細(xì)胞周期解偶聯(lián)現(xiàn)象即處于G2期的細(xì)胞既不發(fā)生G2期阻滯也不進(jìn)入有絲分裂M期，而是返回S期繼續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制形成巨核，直到死亡。細(xì)胞周期解偶聯(lián)現(xiàn)象也是輻射誘導(dǎo)凋亡的重要方式[26-27]。其原因可能是因?yàn)閜21功能缺失或者p53表達(dá)異常所致，目前尚無確切定論[22，26-27]。

關(guān)于IER5在輻射損傷誘導(dǎo)G2期阻滯的機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的研究。Beatrix等[28]報(bào)道Cdc25B是細(xì)胞從G2期過渡到M期的重要的周期調(diào)控蛋白，當(dāng)Cdc25B表達(dá)量減少時(shí)發(fā)生G2期阻滯。Nakamura等[29]通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)Cdc25B啟動子有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控元件，其中包括SP1、SP3和NF-YB，而NF-YB與Cdc25B啟動子結(jié)合可促進(jìn)Cdc25B轉(zhuǎn)錄。研究[29-31]表明，在輻射等刺激條件下在腫瘤細(xì)胞中IER5競爭性的結(jié)合Cdc25B啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，抑制Cdc25B啟動子與NFYB的結(jié)合，從而達(dá)到抑制Cdc25B的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞周期與有絲分裂的進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期。

5　展　望

IER5基因作為一種細(xì)胞對外界刺激做出反應(yīng)的早期反應(yīng)基因，在保證機(jī)體正常的生命活動中意義重大，因此具有重要的研究價(jià)值。近年來國內(nèi)外對于IER5在腫瘤細(xì)胞放療方面有許多研究，對IER5生物學(xué)功能的認(rèn)識也在不斷深入。在放射治療中IER5的表達(dá)量與照射劑量和腫瘤大小相關(guān)，因此它可以作為放射敏感性的標(biāo)記物，對放療方案的制定和優(yōu)化具有臨床意義。目前對于在突變的p53基因與IER5作用情況下促進(jìn)腫瘤的形成與IER5過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長方面存在怎樣的關(guān)系我們還不得而知，因此還需要進(jìn)一步研究，如能明確這種關(guān)系，將對臨床腫瘤的防治具有重要意義。

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