魏之瑤，姚廷彥, 陳德鑫 綜述 嚴 俊 審校

多光子效應是指一個熒光分子同時吸收多個頻率相同的非線性光子，到達高能激發(fā)態(tài)后弛豫到基態(tài)，發(fā)射出波長較短的光子的現(xiàn)象[1]。利用成像目標的自體熒光和二次諧波，多光子成像技術(shù)可原位實時獲取細胞形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)等診斷信息。該技術(shù)穿透力強、分辨率高、光毒性小且無需對組織固定或染色[2]，是一種有巨大的臨床應用價值的光學活檢技術(shù)。而如何將多光子成像設(shè)備在保證穩(wěn)定性和成像質(zhì)量的前提下進行小型化以適應臨床應用已成為研究熱點。不論哪一種形式的多光子在體內(nèi)窺鏡均需要傳輸光纖、掃描器和聚焦物鏡這三種結(jié)構(gòu)。該文主要從這三個方面對多光子內(nèi)窺鏡的研發(fā)進展進行綜述，并對不同類型在體設(shè)備的應用現(xiàn)狀與展望進行闡述。

1 光纖

光纖柔軟而纖細，常被用于各類通訊及圖像傳輸系統(tǒng)。光纖可實現(xiàn)激發(fā)光的遠距離傳遞和多光子信號的搜集，借此可將笨重的激光器與內(nèi)窺鏡本身分開，使內(nèi)窺鏡的小型化和便攜化成為可能。

光子晶體光纖(photonic crystal fiber, PCF)由纖芯和內(nèi)含有序排列的氣柱的包層組成，已被證實可傳遞100 fs的脈沖并給予多光子顯微鏡或內(nèi)窺鏡超出成像所需的激發(fā)功率[3]。PCF分為有效折射率型光子晶體光纖和帶隙波導型光子晶體光纖(photonic bandgap fiber, PBF)。PBF利用包層內(nèi)氣柱的周期性結(jié)構(gòu)構(gòu)建出光子帶隙結(jié)構(gòu)，而纖芯的存在破壞了結(jié)構(gòu)的周期性，從而在光子晶體中引入一個窄頻缺陷態(tài)。頻率位于缺陷態(tài)的光子一旦離開缺陷位置就會導致光的迅速衰減，以此實現(xiàn)光的高效傳遞。不同于正色散的傳統(tǒng)光纖，PCF有反常色散的特性。故在傳遞特定波長的光時PCF可與正色散與之相對應的傳統(tǒng)光纖相耦合以實現(xiàn)零色散傳輸。Wu et al[4]運用此原理，在PCF末端安裝了長為300 μm、纖徑和數(shù)值孔徑(numerical aperture，NA)與PCF內(nèi)包層相同的多模光纖，實現(xiàn)了激發(fā)光的零色散傳遞。

PCF的結(jié)構(gòu)遠比普通光纖復雜，結(jié)構(gòu)可為雙包層、三包層甚至多包層。在眾多多光子內(nèi)窺鏡設(shè)計中，雙包層光子晶體光纖(double-clad photonic crystal fiber，DCPCF)最為常用。DCPCF本質(zhì)上包含了兩種光纖，可在傳遞激發(fā)光的同時搜集多光子信號。大直徑的纖芯適用于近紅外激發(fā)光的單模傳輸，但較小的NA限制了纖芯的多光子信號搜集能力。當纖芯與內(nèi)包層一起充當了芯徑大、NA大的多模熒光搜集光纖的纖芯時，高效的多光子信號收集得以實現(xiàn)。多光子信號在內(nèi)包層區(qū)域的全反射傳遞使之可被放大兩個數(shù)量級，大大增加了系統(tǒng)的信號探測效率。不過DCPCF需要配有預啁啾單元以補償色散，一般使用的是光柵對、透鏡或是二者的結(jié)合。

Rivera et al[5]將三個軸向偏置的DCPCF平行放置，報道了第一個有軸向平行成像能力的空間多路復用多光子內(nèi)窺鏡。DCPCF的長度為1 m，芯-芯間距為125 μm。雙光子圖像的橫向和軸向分辨率分別為0.8 μm和10 μm?？赏瑫r從軸向相隔≥4.8 μm的三個不同深度的平面獲得多光子圖像，為多光子三維成像提供了新思路。

2 掃描器

光纖可以將激發(fā)光從遠處傳輸?shù)皆O(shè)定好的焦點，然而二維乃至三維成像的實現(xiàn)需依靠掃描器。內(nèi)窺鏡的小型化要求掃描器在小尺寸的前提下盡可能實現(xiàn)高速掃描。

2.1光纖掃描器光纖掃描器一般位于光纖末端。其中一種設(shè)計是利用壓電或電磁執(zhí)行器直接驅(qū)動光纖末端進行機械共振，但離軸像差會限制圖像分辨率。Helmchen et al[6]設(shè)計的掃描器利用壓電馬達偏轉(zhuǎn)光纖末端，以實現(xiàn)李薩如(lissajous)模式的二維掃描。該馬達被兩種共振頻率的電壓信號所控制，且需要引入斜撐以實現(xiàn)李薩如掃描所需必須的空間各向異性。一些團隊引入與光纖和透鏡相連接的共振懸臂以進行改良，但引入新元件會增加探頭體積且需要裝配功率更大的馬達。懸臂光纖掃描器最常用的驅(qū)動是管狀壓電執(zhí)行器 ，掃描模式多為螺旋或光柵。Myaing et al[7]設(shè)計了一個可實時成像的雙光子激光掃描光纖內(nèi)窺鏡。掃描器包括共振懸臂和管狀壓電執(zhí)行器。壓電管的被分成了四個象限，形成了兩對驅(qū)動電極(±x和±y)。通過轉(zhuǎn)換三角或正弦波形可調(diào)制驅(qū)動電壓，以此實現(xiàn)螺旋掃描模式。不同于李薩如模式的光纖掃描器，螺旋掃描器不需要為了打破空間對稱性而在光纖上添加額外元件。該探頭掃描直徑約為120～220 μm。更佳的空間掃描模式和均勻的像素駐留時間使光柵掃描優(yōu)于旋轉(zhuǎn)掃描模式和李薩如掃描模式。Rivera et al[8]在多光子成像設(shè)計中使用了小型化的諧振/非諧振懸臂光纖光柵掃描器，二維成像的視野為110 μm×110 μm，速度為4.1 fps(512×512像素)。這個掃描器的尺寸非常小(寬度/厚度≤1 mm，總長度≈2.6 cm)，可實現(xiàn)≥650 μm的光纖末端撓度。

2.2微機電系統(tǒng)掃描器微機電系統(tǒng)(microelectromechanical systems, MEMS)掃描器尺寸小，速度快，功耗低且微光束處理能力強，是小型多光子內(nèi)窺鏡的首選掃描器之一。但其生產(chǎn)工藝復雜，造價高昂，難以量產(chǎn)。雖然MEMS掃描器的自身尺寸很小，但需要的執(zhí)行器尺寸較大。壓電馬達或電磁馬達只能提供前向旋轉(zhuǎn)掃描模式或李薩如掃描模式。而對于胃腸道等臨床應用目標，側(cè)向圓周掃描模式顯然更為實用。Liu et al[9]設(shè)計了一個旋轉(zhuǎn)的多光子顯微鏡探頭，所采用的MEMS掃描鏡可以提供側(cè)向的雙軸掃描。DCPCF傳輸來的激發(fā)光通過梯度折射率(gradient index，GRIN)透鏡后被直角微棱鏡反射。MEMS馬達直徑為2.2 mm，支持360°全景旋轉(zhuǎn)掃描。該旋轉(zhuǎn)馬達的馬達控制器被外裝，以實現(xiàn)探頭的小型化。在帶動著微棱鏡的情況下，馬達的旋轉(zhuǎn)速度可以達到300 r/min，足以實現(xiàn)腔道內(nèi)成像。

3 物鏡

除了光纖和掃描器，多光子內(nèi)窺鏡還需要利用物鏡來將激發(fā)光聚焦在目標平面上。傳統(tǒng)顯微鏡物鏡可提供高分辨率成像，但過大的體積使之不適用于力求小型化的多光子在體內(nèi)窺鏡。內(nèi)窺鏡需要的是可保證一定成像能力的微型物鏡。GRIN透鏡易加工且耦合效率高，亞毫米級別的尺寸和低廉的造價使之成為多光子內(nèi)窺鏡最常用的物鏡之一。

3.1GRIN透鏡GRIN透鏡的介質(zhì)是非均質(zhì)的，可通過調(diào)整玻璃摻雜劑的濃度實現(xiàn)特定的折射率分布[10]：

[n(r)]2=[n(0)]2[1-(ar)2]

n(0)是中心處的折射率，a為折射率梯度分布常量，r是到中心軸的距離。不同于利用曲面來折射光線的傳統(tǒng)透鏡，GRIN透鏡的光束傳播路徑是曲線的。與其他微透鏡相比，GRIN透鏡可以提供更好的成像質(zhì)量，且糾正像差后成像質(zhì)量仍有較大的提升空間[4]，但在體應用時運動偽影仍是需待解決的問題。

Barretto et al[11]利用了高NA(數(shù)值孔徑，前文已加上中英文名稱)平-凸物鏡報道了一種GRIN透鏡的像差糾正成像設(shè)計，可使信號收集能力提至普通GRIN透鏡的兩倍。該平-凸物鏡由小型商用球形透鏡切割而成，平-凸物鏡在光軸上引入的球面像差可被折射率分布與之相匹配的GRIN透鏡消除。這種物鏡系統(tǒng)的分辨率(橫向1.0±0.2 μm，軸向4.4±0.2 μm)可以與商用水浸物鏡相媲美。與上述設(shè)計相比，Murray et al[12]設(shè)計的方案體積更小且易于組裝。該方案由GRIN透鏡、蓋玻片和物鏡矯正環(huán)組成。蓋玻片可補償GRIN透鏡的像差，物鏡的矯正環(huán)則用于再平衡蓋玻片可能造成的過補償。該系統(tǒng)的橫向分辨率(1 μm)和軸向分辨率(15 μm)分別是普通復合GRIN透鏡的2倍和3倍，視場(150 μm)的提高超過了3倍。

3.2復合透鏡復合透鏡的系統(tǒng)設(shè)計則包括了用于平行化光線的準直鏡和用于聚焦的物鏡。將光束平行化可防止入射光被分散，也予以透鏡間距一定的可調(diào)性，可根據(jù)掃描系統(tǒng)和標本位置進行優(yōu)化。

Zhao et al[13]設(shè)計的物鏡系統(tǒng)由3個直徑均為2 mm的消色差透鏡組成。準直透鏡焦距為6 mm，物鏡由一對水平面相貼、焦距均為3 mm的GRIN透鏡構(gòu)成。光纖尖端和準直透鏡之間的距離固定為6 mm，準直透鏡與GRIN透鏡對之間的距離可調(diào)。與單獨使用GRIN透鏡相比，該方案可以使熒光信號級提高6～20倍。在另一個原理相同的透鏡設(shè)計中[14]，GRIN透鏡被用作準直透鏡，物鏡則是一個非曲面透鏡。探頭的外直徑為1 cm，長度為14 cm，分辨率為2 μm，視場可達200 μm。

Liu et al[15]設(shè)計的探頭除了準直透鏡和聚焦透鏡，還添加了用于擴束的中繼透鏡。該準直透鏡的焦距為18 mm，準直后的平行光束直徑約為1.8 mm。中繼透鏡包括一個焦距為30 mm的掃描透鏡和焦距為50 mm的管狀透鏡。這兩個透鏡排列形成的擴束器放大倍數(shù)為1.67。封裝后的整個透鏡系統(tǒng)直徑為16 mm。

4 現(xiàn)狀與展望

目前已有多個團隊在進行多光子臨床應用的研究。有些已進行了動物在體實驗，有些已利用患者離體標本構(gòu)建了診斷模型。多光子的臨床應用形式主要集中在硬式針狀微內(nèi)窺鏡、軟式內(nèi)窺鏡、硬式探頭和腹腔鏡式內(nèi)窺鏡上。其中，硬式針狀微內(nèi)窺鏡已在皮膚學癌癥診斷領(lǐng)域中實現(xiàn)了商業(yè)化，并在臨床被例行應用[16]。硬式針狀微內(nèi)窺鏡以微創(chuàng)方式對近體表組織進行成像，只留下針孔大小的傷口。Dimitrow et al[17]對83個黑色素瘤患者的皮膚病變組織分別進行了在體和離體的雙光子成像，并根據(jù)黑色素瘤的組織學特點建立了用于區(qū)分良性痣和黑色素瘤的診斷模型。該模型在體診斷的敏感性為75%，特異性為80%。

軟式內(nèi)窺鏡是多光子成像技術(shù)與傳統(tǒng)消化道內(nèi)窺鏡的結(jié)合，可對消化道黏膜面進行成像?？梢刹∽兛芍苯釉趦?nèi)鏡下得到原位實時的組織學確診，有望用于原位癌的診斷和腫瘤分期。目前尚無多光子軟式內(nèi)窺鏡實現(xiàn)動物或患者在體應用的報道，但已有團隊利用多光子顯微鏡對患者的結(jié)直腸黏液腺癌離體新鮮標本的黏膜面進行了成像[18]，證明了多光子內(nèi)窺鏡代替?zhèn)鹘y(tǒng)病理活檢用于診斷消化道疾病的可行性。

硬式探頭形式的多光子內(nèi)窺鏡可用于器官組織表面的原位實時成像且已在動物實驗中得到了驗證。Huland et al[19]利用長度為8 cm的復合GRIN透鏡系統(tǒng)和可快速移動的機械臂制造了一個可對深處組織進行多光子在體成像的便攜硬式內(nèi)鏡系統(tǒng)，并用其對活鼠的肝、腎和結(jié)腸內(nèi)面(黏膜面)進行了成像。硬式探頭還可在術(shù)中對手術(shù)切緣進行成像。Yan et al[20]對新鮮的低位直腸癌手術(shù)切緣進行了全層多光子成像，并與HE染色的病理結(jié)果進行了分析對比，展現(xiàn)了多光子成像用于術(shù)中原位實時判斷手術(shù)切緣殘留與否的前景。

腹腔鏡式內(nèi)窺鏡是多光子顯微鏡和傳統(tǒng)腹腔鏡的結(jié)合，可用于胃腸道漿膜面和腹膜等腹腔內(nèi)組織器官的成像，可實時判斷腫瘤有無侵犯漿膜面及腹膜，對腫瘤精確的術(shù)前分期、預后判斷和術(shù)式選擇有著重要意義。已有團隊利用患者突破及未突破漿膜層的胃癌離體新鮮標本的漿膜面進行了多光子成像且構(gòu)建出了診斷模型[21]。他們利用多光子成像對腫瘤進行了T分期，識別T4期胃癌的敏感性、特異性和準確性分別可達90%、96.67%和93.33%，遠遠高于基于超聲內(nèi)鏡的術(shù)前T分期。也有團隊利用腹腔鏡式多光子內(nèi)窺鏡對小鼠的癌變卵巢和纖維化腎臟進行了在體成像[22-23]。

除上文提及的成果外，目前亦有團隊對患者的膀胱癌、前列腺癌的離體新鮮標本進行了多光子成像[24-24]。實驗動物的口腔、乳腺也實現(xiàn)了在體成像[26-27]，但直接對患者進行的在體成像極少。目前為止，絕大多數(shù)的臨床前研究集中在雙光子上。Horton et al[28]對小鼠大腦進行了三光子在體原位成像，成像深度可達1 mm，展現(xiàn)了三光子成像的誘人前景。上述團隊的研究均已證明了多光子內(nèi)窺鏡是一種高效安全的原位實時光學活檢技術(shù)，有望在不遠的將來全面走上臨床，在早癌診斷、術(shù)中切緣檢驗和腫瘤分期等方面發(fā)揮巨大作用。現(xiàn)該領(lǐng)域急待臨床及臨床前研究的繼續(xù)推進以最終實現(xiàn)全方面的應用。各類成熟的微型化內(nèi)窺鏡進一步的調(diào)試研發(fā)勢必會加速這一進程。

5 總結(jié)

多光子成像技術(shù)是最具潛能的光學活檢技術(shù)之一。上述元件的設(shè)計與應用使多光子內(nèi)窺鏡系統(tǒng)體積更小、成像質(zhì)量更高且穩(wěn)定性更好，為多光子成像的臨床應用予以了重要保證。隨著微型元器件設(shè)計和制造工藝的不斷發(fā)展，未來更為成熟的小型多光子內(nèi)窺鏡必定會出現(xiàn)。動物實驗及利用患者離體標本構(gòu)建診斷模型的進程也在不斷被推進。綜上，多光子內(nèi)窺鏡有望在不遠的將來全面走上臨床，在早癌診斷、術(shù)中切緣檢驗和腫瘤分期等方面發(fā)揮巨大作用。