張 敏， 于成功,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科

普拉梭菌及其上清液對(duì)葡聚糖酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠Treg/Th17平衡的影響

張 敏1， 于成功1,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科

目的探討普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii，F(xiàn).prausnitzii)及其上清液對(duì)葡聚糖酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠Treg/Th17平衡的影響。方法將40只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、結(jié)腸炎對(duì)照組、F.prausnitzii活菌干預(yù)組、F.prausnitzii上清干預(yù)組，每組10只，正常組正常飲水，其余各組均飲用質(zhì)量濃度為25 g/L的葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型，同時(shí)分別用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、F.prausnitzii、F.prausnitzii上清灌胃。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾臟中的Treg、Th17比例，并計(jì)算各組Treg/Th17比值；ELISA法檢測(cè)外周血清中IL-10、IL-17水平；RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中Foxp3、ROR-γt mRNA的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)腸炎對(duì)照組相比，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組的Treg細(xì)胞比例上升，Th17細(xì)胞比例下降，Treg/Th17比值升高；且血清中IL-10水平升高，IL-17水平降低(P<0.05)。與結(jié)腸炎對(duì)照組相比，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組Foxp3 mRNA表達(dá)上升(P<0.05)，但F.prausnitzii活菌干預(yù)組Foxp3 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩干預(yù)組腸組織中ROR-γt mRNA表達(dá)較結(jié)腸炎對(duì)照組下降(P<0.05)。結(jié)論F.prausnitzii及其上清液可調(diào)控T細(xì)胞亞群，其機(jī)制可能為通過(guò)提高Foxp3 mRNA表達(dá)，抑制ROR-γt mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡。

普拉梭菌；結(jié)腸炎；Treg細(xì)胞；Th17細(xì)胞

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)為腸道慢性非特異性及復(fù)發(fā)性炎癥，包含潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。目前認(rèn)為，腸道菌群參與下引起腸黏膜免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致腸組織損傷、炎癥進(jìn)展為其研究熱點(diǎn)[1-2]。Treg細(xì)胞能夠減輕炎癥反應(yīng)，抑制自身免疫反應(yīng)，而Th17細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與自身免疫反應(yīng)。普拉梭菌(F.prausnitzii)作為腸道益生菌一種，對(duì)維護(hù)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)起重要作用，可分泌丁酸鹽及未知產(chǎn)物。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).prausnitzii具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立IBD模型，經(jīng)F.prausnitzii及其上清干預(yù)后，觀察脾臟中T淋巴細(xì)胞亞群的變化及Treg/Th17細(xì)胞的比例，探討F.prausnitzii對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的免疫調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物C57BL/6J小鼠(美國(guó)Jackson Laboratory)共40只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量21～23 g。飼養(yǎng)于南京鼓樓醫(yī)院無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2試劑DSS(MP Biomedicals)；F.prausnitziiATCC27766(美國(guó)模式菌種保藏中心)，血晶質(zhì)、纖維二糖、L-半胱氨酸(SIGMA)、腦心浸液(B&D)、酵母提取物(OXOID)、麥芽糖(AMRESCO)； FITC標(biāo)記抗鼠 CD4 抗體、APC標(biāo)記抗鼠 CD25 抗體、PE標(biāo)記抗鼠Foxp3抗體(eBioscience，Inc)，破膜固定套裝(eBioscience)，紅細(xì)胞裂解液(MILTENYI BIOTEC)，APC標(biāo)記抗鼠 CD3抗體、PE標(biāo)記抗鼠IL-17抗體(eBioscience，Inc.)，淋巴細(xì)胞刺激劑leukocyte activation cocktail with BD GolgiPlug(BD Biosciences)，固定/破膜試劑盒(BD Biosciences)；反轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒及TRIZOL裂解液(TAKARA)；小鼠IL-17、IL-10 ELISA試劑盒(eBioscience，Inc)。

1.3方法

1.3.1F.prausnitzii培養(yǎng)及上清液制備：把F.prausnitzii接種在37 ℃厭氧箱中LYHBHI培養(yǎng)基，培育48 h，OD值計(jì)菌數(shù)達(dá)1×109CFU/ml。同時(shí)將新鮮菌液5 000 r/min離心5 min，取F.prausnitzii上清液凍干成粉，100 ml上清約可得到 3 g 凍干粉，將凍干粉按1∶5的比例以 PBS 稀釋，4 ℃冰箱備用。

1.3.2 動(dòng)物模型制備、分組、標(biāo)本處理：40只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、結(jié)腸炎對(duì)照組、F.prausnitzii活菌干預(yù)組，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組，每組10只，正常組正常飲水，其余各組均飲用質(zhì)量濃度為25 g/L的葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型,干預(yù)組小鼠分別用0.2 ml/10 gF.prausnitzii及等量的F.prausnitzii上清液每天灌胃1次，結(jié)腸炎對(duì)照組以等量的PBS每天灌胃1次，連續(xù)7 d。第8天用頸椎脫臼法處死小鼠，眼眶取血，無(wú)菌取脾及結(jié)腸。

1.3.3 流式檢測(cè)脾臟中Treg、Th17細(xì)胞比例：無(wú)菌取小鼠新鮮脾結(jié)，充分研磨后，加入紅細(xì)胞裂解液3 ml，靜置5 min,PBS洗滌2次。予PBS重懸后計(jì)數(shù)，取細(xì)胞1×106加表面抗體APC-CD25 0.8 μl，F(xiàn)ITC-CD4 1.0 μl，振蕩，避光20 min，1 ml PBS洗滌1次，蝸旋，速度在4～5次為宜，加入固定破膜劑800 μl,避光1～2 h，用破膜Buffer洗滌2次，加入PE-Foxp3 2.5 μl，4 ℃避光孵育45 min，1×Buffer洗滌1次，用PBS重懸至100 μl后上機(jī)檢測(cè)。

予PBS重懸后計(jì)數(shù)，取細(xì)胞1×106，加入淋巴細(xì)胞刺激劑2 μl/ml，放入37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，加1 ml PBS，300×g, 5 min離心，棄上清后加入表面抗體APC-CD3 1 μl、FITC-CD4 1 μl，4 ℃避光孵育40 min，1 ml PBS，300×g，5 min離心棄上清后輕度渦旋，使細(xì)胞完全重懸，加入250 μl固定/破膜劑，4 ℃避光孵育20 min后，加入1 ml破膜Buffer，250×g離心5 min，棄上清后再重復(fù)清洗1次，加入胞內(nèi)抗體PE-IL-17 1 μl、4 ℃避光孵育1 h，加入1 ml破膜Buffer，250×g離心5 min離心,棄上清，以150～300 μl PBS重懸后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)外周血清中IL-10、IL-17水平：按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中Foxp3、ROR-γt mRNA的表達(dá)：在各組中隨機(jī)抽取4只小鼠，提取結(jié)腸中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用其為模板行RT-PCR擴(kuò)增。Foxp3引物F：5′-TCCCAGAGTTCTTCCACAAG-3′；R： 5′-TAAGGGTGGCATAGGTGAAA-3′；ROR-rt引物F：5′-CACGGCCCTGGTTCTCAT-3′；R： 5′-GCAGATGTTCCACTCTCCTCTTCT-3′；內(nèi)參GAPDH引物F：5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′；R： 5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。結(jié)果用2-△△Ct計(jì)算Foxp3、ROR-γt mRNA的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠脾單核細(xì)胞中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17細(xì)胞比例與結(jié)腸炎對(duì)照組相比，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組的Treg細(xì)胞比例上升，Th17細(xì)胞比例下降，Treg/Th17比值升高(P<0.05)(見表1)。

2.2血清中IL-10、IL-17的含量F.prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組血清中IL-10水平較結(jié)腸炎對(duì)照組升高，IL-17水平較結(jié)腸炎對(duì)照組降低(P<0.05)(見圖1)。

表1 各組脾臟中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17比率Tab 1 Proportion of Treg cells and Th17 cells in spleen and the ratio of Treg/Th17 in each group (±s)

注：與結(jié)腸炎對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：與結(jié)腸炎對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3結(jié)腸組織中Foxp3、ROR-γtmRNA的表達(dá)與結(jié)腸炎對(duì)照組相比，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組的Foxp3 mRNA的表達(dá)上升(P<0.05)，但F.prausnitzii活菌干預(yù)組Foxp3 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩干預(yù)組腸組織中ROR-γt mRNA的表達(dá)較結(jié)腸炎對(duì)照組的表達(dá)下降(P<0.05)(見圖2)。

注：與結(jié)腸炎對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

F.prausnitzii屬于厚壁菌門，作為腸道益生菌的一種，對(duì)維護(hù)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)起重要作用，可分泌丁酸鹽及未知產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).prausnitzii具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[3]。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠，F(xiàn).prausnitzii及上清通過(guò)增加脾臟中Treg細(xì)胞比例發(fā)揮治療作用，具體機(jī)理不清。也有研究[5]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠，F(xiàn).prausnitzii上清可通過(guò)抑制脾和腸道Th17細(xì)胞的生成，減少促炎因子IL-17A的釋放，從而減輕腸道炎癥,說(shuō)明益生菌在IBD治療方面具有舉足輕重的地位。Treg細(xì)胞可降低炎性反應(yīng)，抑制炎性進(jìn)展，在維持免疫穩(wěn)態(tài)及抗炎等過(guò)程中扮演重要角色。研究[6]證明，Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能下降與IBD的發(fā)展相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[7]顯示，通過(guò)體內(nèi)輸注Treg細(xì)胞，重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠的結(jié)腸炎癥狀可以減輕。臨床研究[8]表明，與正常人相比，IBD患者外周血Treg細(xì)胞比例顯著下降。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群以分泌IL-17為特征的CD4+T 細(xì)胞亞群，該細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子對(duì)IBD的發(fā)病有重要作用，大量研究[9-11]已證實(shí)，Th17細(xì)胞亞群可引起嚴(yán)重免疫反應(yīng)性疾病。因此，通過(guò)提高Treg細(xì)胞比例，降低Th17細(xì)胞比例，調(diào)控兩者之間的平衡，用以治療IBD為目前關(guān)注的熱點(diǎn)。由于Th17細(xì)胞在淋巴結(jié)中含量較低(1%～2%)，提取難度大，且缺乏特異性表面標(biāo)記，其特異性標(biāo)記為細(xì)胞內(nèi)分泌的IL-17細(xì)胞因子，難以通過(guò)流式方法獲得腸道相關(guān)淋巴組織中的Th17細(xì)胞，一定程度上限制了其研究的可行性。故本實(shí)驗(yàn)只做了脾的流式，某種程度也能說(shuō)明問(wèn)題。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與結(jié)腸炎對(duì)照組相比，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組的Treg細(xì)胞比例上升，Th17細(xì)胞比例下降，Treg/Th17比值升高。提示F.prausnitzii及其上清可調(diào)控T細(xì)胞亞群 Treg/Th17的平衡來(lái)控制結(jié)腸炎炎癥。Treg細(xì)胞以分泌TGF-β和IL-10在IBD中發(fā)揮抗炎作用。IL-10主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗炎作用。研究[12]證明，IL-10缺失可導(dǎo)致與CD相似的結(jié)腸炎，且CD的復(fù)發(fā)與低含量IL-10相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻?，IL-10基因敲除的小鼠可制備出與人類相似的結(jié)腸炎模型，而對(duì)于TNBS模型的結(jié)腸炎大鼠，給予IL-10治療后，可緩解結(jié)腸炎的癥狀[13]。由此可知，抗炎因子IL-10對(duì)IBD防治有重要影響。Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-6和IL-22有明顯的致炎作用，能促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生[14]。其中IL-17A的致炎性最為顯著，通過(guò)增加細(xì)胞的通透性及促進(jìn)其他炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生方式，發(fā)揮致炎作用[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組血清中IL-10水平較結(jié)腸炎對(duì)照組升高，IL-17水平較結(jié)腸炎對(duì)照組降低。提示F.prausnitzii活菌及其上清通過(guò)上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)，下調(diào)炎癥因子IL-17的表達(dá)，抑制其他炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕全身炎癥反應(yīng)。

Foxp3是Foxhead家族成員，表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞上，是Treg細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子。Foxp3不僅數(shù)量上更多地表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞，同時(shí)對(duì)其生物學(xué)特性有重要作用，尤其表現(xiàn)在對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能方面[16-17]，而機(jī)體Treg細(xì)胞發(fā)育異?？芍麦w內(nèi)免疫功能紊亂，進(jìn)而與IBD的發(fā)生相關(guān)。研究[16-18]表明，F(xiàn)oxp3基因突變可導(dǎo)致Treg細(xì)胞的數(shù)量明顯減少或功能明顯降低，引起人和小鼠發(fā)生較重的自身免疫性疾病。為進(jìn)一步說(shuō)明F.prausnitzii及其上清對(duì)Treg細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與結(jié)腸炎對(duì)照組相比，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組的Foxp3 mRNA的表達(dá)上升，但F.prausnitzii活菌干預(yù)組Foxp3 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有上升趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，F(xiàn).prausnitzii上清的抗炎作用是通過(guò)促進(jìn)Foxp3 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而增加CD4+CD25+Treg細(xì)胞，發(fā)揮抑制免疫效應(yīng)，F(xiàn).prausnitzii上清的效果優(yōu)于活菌組，具體作用機(jī)制不明。Th17細(xì)胞分化依賴于信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3，并需要關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子維A酸相關(guān)核孤兒受體ROR-γt的表達(dá)[19]。因此本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中ROR-γt mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)一步說(shuō)明F.prausnitzii及其上清對(duì)Th17細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和其上清干預(yù)組腸組織中ROR-γt mRNA的表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)下降。提示F.prausnitzii及其上清可通過(guò)下調(diào)結(jié)腸黏膜組織Th17細(xì)胞的表達(dá)，減少炎癥因子的釋放，從而減輕結(jié)腸炎癥。

綜上所述，F(xiàn).prausnitzii及其上清可調(diào)控T細(xì)胞亞群，通過(guò)提高腸道中Foxp3 mRNA的表達(dá)，抑制ROR-γt mRNA的表達(dá)，促進(jìn)脾臟Treg細(xì)胞的生成，減少Th17細(xì)胞，調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡，從而減輕腸道炎癥及全身炎癥反應(yīng)。本研究為臨床F.prausnitzii及其上清治療IBD提供了一種新的思路。但F.prausnitzii上清中包含哪些具體物質(zhì)？這些物質(zhì)對(duì)免疫調(diào)節(jié)所起的具體作用機(jī)制及其對(duì)Foxp3、ROR-γt基因的平衡調(diào)控蛋白水平上的研究是未來(lái)需要進(jìn)一步研究的方向。

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EffectofFaecalibacteriumprausnitziianditssupernatantonthebalanceofTreg/Th17indextransulfatesodium-inducedcolitismice

ZHANG Min1, YU Chenggong1,2

1.Department of Gastroenterology, Drum Tower School of Clinical Medicine, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210008; 2.Department of Gastroenterology, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, China

ObjectiveTo investigate the effect of Faecalibacterium prausnitzii (F.prausnitzii) and its supernatant on the balance of Treg/Th17 in mice induced by dextran sulfate sodium.MethodsA total of 40 C57BL/6J mice were randomly divided into four groups: normal group, colitis model group,F.prausnitziitreatment group andF.prausnitziisupernatant treatment group, respectively. The normal group drunk water normally, colitis were induced by drinking 25 g/L DSS solution in the other groups, which were injected the PBS, theF.prausnitziiand theF.prausnitziisupernatant through the stomach, respectively. Percentages of Treg cells and Th17 cells in spleen were analyzed by flow cytometry, and the ratio of Treg/Th17 was calculated. Serum levels of IL-10 and IL-17 were measured by ELISA and the levels of Foxp3 and ROR-γt mRNA in colonic tissue were detected by RT-PCR.ResultsPercentage of Treg cells inF.prausnitziitreatment group andF.prausnitziisupernatant treatment group in spleen was higher than that in colitis model group, and the percentage of Th17 cells in the two treatment groups in spleen was lower than that in colitis model group. The ratio of Ttreg/Th17 in the two treatment groups was higher than that in the colitis model group. Serum level of IL-10 inF.prausnitziitreatment group and theF.prausnitziisupernatant treatment group was higher than that in colitis model group, and serum level of IL-17 in the two treatment groups was lower than that in colitis model group. Compared with the colitis model group, the expression of Foxp3 mRNA inF.prausnitziisupernatant treatment group in colonic tissues was increased, but the expression of Foxp3 mRNA had no difference inF.prausnitziitreatment group. The expression of ROR-γt mRNA in the two treatment groups in colonic tissues were lower than that in colitis model group.Conclusion

TheF.prausnitziiand its supernatant could regulate the T lymphocyte subsets by increasing the expression of Foxp3 mRNA and inhibiting the expression of ROR-γt mRNA, which might regulate the balance of Treg/Th17.

Faecalibacterium prausnitzii; Colitis; Treg cell; Th17 cell

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.12.018

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81470819)

張敏，碩士研究生，研究方向：炎癥性腸病。E-mail:3054720471@qq.com

于成功,博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：炎癥性腸病、消化道腫瘤等。E-mail: chenggong_yu@nju.edu.cn

R574

A

1006-5709(2017)12-1396-05

2017-02-26

馬 軍)