張黎，溫智恒，田亞賓，黃維金，王佑春

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

CD63在戊型肝炎病毒感染中的作用機(jī)制

張黎，溫智恒，田亞賓，黃維金，王佑春

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

本研究旨在尋找戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)衣殼蛋白ORF2的相互作用蛋白，探討其在HEV感染中的作用。采用酵母雙雜交方法從人肝細(xì)胞文庫中篩選與HEV ORF2相互作用的蛋白，結(jié)果顯示CD63與HEV ORF2相互作用。Pull-down實(shí)驗(yàn)提示原核表達(dá)的ORF2與CD63結(jié)合較弱，而免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示真核表達(dá)的ORF2能與CD63結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，HEV易感細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞膜表面的CD63表達(dá)水平普遍低于HEV非易感細(xì)胞。過表達(dá)CD63抑制PLC/PRF/5細(xì)胞的HEV感染，而小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾CD63表達(dá)則促進(jìn)HEV感染。結(jié)果提示，CD63能與HEV ORF2相互作用，可能抑制HEV感染肝細(xì)胞。

戊型肝炎病毒；ORF2；CD63

近年來，戊型肝炎在我國許多地區(qū)已超過甲型肝炎，成為發(fā)病率最高的急性病毒性肝炎。戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)主要經(jīng)糞-口途徑傳播，也可經(jīng)輸血傳播和母嬰垂直傳播。雖然大多數(shù)戊型肝炎為急性感染，并具有自愈性，但一些免疫力低下的特殊人群，如器官移植、艾滋病等患者[1]感染HEV后會(huì)發(fā)展為慢性肝炎、急性重癥肝炎(暴發(fā)性肝炎)，甚至死亡。妊娠晚期婦女感染HEV的病死率也高達(dá)20%[2-4]。

HEV為單鏈正向RNA病毒。雖然HEV一直被認(rèn)為是無包膜病毒，但近來一些研究認(rèn)為其產(chǎn)生過程中可能存在帶有包膜的形式。經(jīng)膽汁處理后的HEV在糞便內(nèi)呈無包膜狀態(tài)。HEV基因組全長7.2 kb，編碼3個(gè)開放讀碼框(open reading frame，ORF)。ORF1編碼病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制相關(guān)病毒，ORF2編碼長度為660個(gè)氨基酸(amino acid，aa)的病毒衣殼蛋白，ORF3編碼與病毒釋放有關(guān)的小分子磷蛋白。昆蟲細(xì)胞表達(dá)的ORF2(112～608位氨基酸)可在體外自主裝配成病毒樣顆粒(virus like particle，VLP)。針對ORF2的抗體可中和病毒感染，以重組ORF2(p239， 368～606位氨基酸)為基礎(chǔ)的HEV疫苗已上市[5]。這些證據(jù)表明ORF2是介導(dǎo)HEV感染宿主的關(guān)鍵蛋白。為探討HEV感染細(xì)胞的機(jī)制，本研究利用酵母雙雜交方法，以HEV ORF2作為誘餌蛋白，篩選人肝cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)CD63能與ORF2相互作用。

CD63為4次跨膜蛋白超家族成員之一，主要定位于細(xì)胞膜、晚期內(nèi)體及溶酶體。它能與整合素等多種細(xì)胞膜蛋白相互作用，參與多條細(xì)胞信號傳遞通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、黏附、分化等過程。它可能是活化血小板的標(biāo)記，并與腫瘤侵襲相關(guān)[6]。此外，CD63還參與調(diào)節(jié)人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV)的感染和釋放[7]、丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus，HCV)感染的早期過程[8]、人乳頭瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV16)進(jìn)入細(xì)胞的過程[9]及人單純皰疹病毒6型(human herpesvirus type 6，HHV-6)釋放的過程[10]。CD63被發(fā)現(xiàn)與HEV共定位于晚期內(nèi)體[11]，但是否參與并影響HEV感染細(xì)胞過程尚未有報(bào)道。

本研究通過多種方法檢測CD63與HEV衣殼蛋白ORF2的相互作用，分析HEV易感和非易感細(xì)胞表面CD63表達(dá)水平，并利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和過表達(dá)方法，調(diào)節(jié)PLC/PRF/5細(xì)胞中CD63表達(dá)，研究其在HEV感染細(xì)胞過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及毒株

293FT、 HeLa、 A549、 CaCo-2、HepG2及PLC/PRF/5細(xì)胞均來自中國食品藥品檢定研究院細(xì)胞資源保藏研究中心。用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。用0.25%胰酶+乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)消化細(xì)胞，傳代，維持細(xì)胞指數(shù)生長。HEV來自PLC/PRF/5細(xì)胞攻毒40 d后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液(GenBank No：AJ272108)。

1.2 主要試劑

酵母雙雜交試劑盒(DUALhunter Starter Kit)和人肝 cDNA 文庫購自Dualsystems Biotech公司，pull-down檢測試劑盒購自Pierce公司，細(xì)胞裂解液、免疫共沉淀檢測相關(guān)試劑和抗體購自Clonetech公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗CD63抗體購自MACS和eBioscience公司，蛋白轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000及siRNA轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX購自Life公司，M199及DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司和吉諾公司，胎牛血清購自Hyclone公司，HEV抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。

1.3 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

雙雜交實(shí)驗(yàn)參照DUALhunter Starter Kit說明書操作。構(gòu)建pDHB1-ORF2全長(1～660位氨基酸)和pDHB1-ORF2誘餌(12～660位氨基酸)質(zhì)粒，驗(yàn)證功能性表達(dá)并排除自激活效應(yīng)。將誘餌質(zhì)粒與pPR3-N空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母NMY51感受態(tài)細(xì)胞，選擇篩選壓力，確定最優(yōu)篩選壓力為(SD/-Leu/-Trp/-His，1 mmol/L 3-AT)。將誘餌質(zhì)粒pDHB1-ORF2和人肝cDNA文庫共轉(zhuǎn)染酵母，在上述篩選壓力培養(yǎng)板上 30 ℃培養(yǎng) 3～4 d，挑選陽性克隆進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)鑒定和測序分析。通過誘餌質(zhì)粒與陽性質(zhì)粒的酵母共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及β-半乳糖苷酶分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選結(jié)果，排除假陽性。

1.4 Pull-down實(shí)驗(yàn)

His-ORF2(112～660位氨基酸)合成于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。Myc-CD63蛋白來自293FT轉(zhuǎn)染pCMV5-CD63質(zhì)粒后48 h收獲的細(xì)胞裂解液。按pull-down試劑盒說明書操作，簡要步驟如下：Tris 緩沖液(Tris buffered saline，TBS)與Cell Lysis Buffer按1∶1混勻，加入終濃度為10 mmol/L的咪唑，配制洗液，并用洗液平衡柱料(HisPur Cobalt Resin)。向柱料中加入誘餌蛋白(His-ORF2)150 g，對照組加入相應(yīng)量洗液，4 ℃搖床翻轉(zhuǎn)孵育1 h，離心留取流過液。用洗液洗滌柱料5次，加入捕獲蛋白(Myc-CD63)，4 ℃搖床翻轉(zhuǎn)孵育1 h，離心留取流過液。用洗液洗柱料5次，加入50 μL 2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)上樣緩沖液，同時(shí)向上述兩步流過液中加入SDS上樣緩沖液，分別煮沸變性，進(jìn)行免疫印跡分析。

1.5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

將293FT細(xì)胞單獨(dú)或同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-CD63和pCMV-His-ORF2。轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白。將細(xì)胞裂解液定量并稀釋至1 mg/mL，與1 μg抗His抗體混合, 4 ℃孵育過夜。向預(yù)清除后的Protein G柱料中加入過夜孵育的抗體蛋白混合液，4 ℃孵育2 h。用洗液洗滌柱料5次，加入30 μL 2×SDS上樣緩沖液，煮沸變性后進(jìn)行免疫印跡分析。

1.6 流式細(xì)胞染色

將單層培養(yǎng)細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次，加入消化液(含0.2% EDTA的PBS )，于37 ℃消化成單細(xì)胞懸液。以含有2% FBS的PBS作為封閉液，F(xiàn)ITC或PE標(biāo)記的抗CD63抗體(1∶100)為檢測抗體，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.7 PLC/PRF/5細(xì)胞病毒感染實(shí)驗(yàn)

將PLC/PRF/5細(xì)胞鋪于24孔板中(密度50%)，次日進(jìn)行CD63過表達(dá)或siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后12 h換液，棄轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒或siRNA。轉(zhuǎn)染后48 h(密度80%～90%)加入HEV毒種(RNA濃度106拷貝/mL)，并換含2% FBS的DMEM/M199維持培養(yǎng)基。攻毒24 h后，用無血清DMEM/M199培養(yǎng)基洗5次，加入新鮮維持培養(yǎng)基。以后每3 d換一次液，于攻毒后19 d收取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測上清液中ORF2含量。

1.8 HEV抗原(ORF2)檢測

按HEV抗原檢測試劑盒說明書操作，步驟如下：在預(yù)包被96孔板中，加入100 μL/孔待測樣品和陰、陽性對照，于37 ℃孵育1 h；用含吐溫20的PBS(PBS with Tween 20，PBST)洗板5次，加入100 μL/孔酶標(biāo)試劑，于37 ℃孵育30 min；再次洗板5次后，加入顯色液A和B(各50 μL/孔)，混勻后于37 ℃孵育15 min；加入終止液(50 μL/孔)，混勻后用酶標(biāo)儀讀數(shù)(OD450)。計(jì)算S/CO值，即待測樣品OD值/陰性對照OD平均值。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)提示CD63與HEV ORF2相互作用

利用分裂泛素化酵母雙雜交系統(tǒng)，以HEV ORF2為誘餌，對人肝cDNA文庫進(jìn)行篩選，尋找相互作用蛋白。以O(shè)RF2去掉N端111個(gè)氨基酸之后的部分(112～660位氨基酸)構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。排除自激活作用后，對人肝cDNA文庫進(jìn)行3次雙雜交篩選，酵母共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(圖1A)及β-半乳糖苷酶分析實(shí)驗(yàn)(圖1B)顯示CD63能與ORF2相互作用。

圖1酵母共轉(zhuǎn)染和β-半乳糖苷酶分析

Fig.1Co-transfectionofbaitandpreytoyeastandβ-galactosidaseactivityanalysis

2.2 Pull-down實(shí)驗(yàn)提示CD63與原核表達(dá)的ORF2有弱相互作用

將去掉N端的ORF2構(gòu)建至原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得His-ORF2(112～660位氨基酸)。以該蛋白為誘餌蛋白，真核細(xì)胞293FT中過表達(dá)的Myc-CD63為捕獲蛋白，蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示Myc-CD63及His-ORF2正確表達(dá)，CD63蛋白量很高時(shí)ORF2能結(jié)合CD63，但反應(yīng)較弱。對照組為陰性，無非特異反應(yīng)(圖2)。

S: sample group, His-ORF2 as bait, Myc-CD63 as prey. C: control group, no bait protein, Myc-CD63 as prey. 1: cell lysate of 293T cells with overexpressed CD63. 2, 3: pull-down results. 4, 5: the fluids through column after bait protein incubated with beads. 6, 7: the fluids through column after prey protein incubated with beads.

圖2Pull-down實(shí)驗(yàn)提示HEVORF2與CD63有弱相互作用

Fig.2Pull-downexperimentindicatedtheweakinteractionofHEVORF2withCD63

2.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示真核表達(dá)的CD63與ORF2相互作用

圖3免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示HEVORF2與CD63相互作用

Fig.3Co-immunoprecipitationofHEVORF2andCD63

Control indicates the isotype control, which is from the same source as anti-CD63 antibody.

圖4各細(xì)胞系膜表面CD63表達(dá)水平

Fig.4TheexpressionsofCD63indifferentcelllines

在真核293FT中同時(shí)過表達(dá)Myc-CD63和His-ORF2(112～660位氨基酸)后，進(jìn)行免疫共沉淀檢測。結(jié)果顯示，結(jié)合有His抗體的柱料可沉淀His-ORF2蛋白，同時(shí)共沉淀Myc-CD63(圖3)。結(jié)果提示，在真核共表達(dá)系統(tǒng)中HEV ORF2能與Myc-CD63相互作用。

2.4 細(xì)胞膜表面CD63表達(dá)水平

進(jìn)一步檢測HEV易感細(xì)胞系(A549、HepG2和PLC/PRF/5)及非易感細(xì)胞系(293FT、HeLa和CaCo-2)中內(nèi)源性CD63的表達(dá)水平[12]。用兩株熒光標(biāo)記的CD63抗體，通過細(xì)胞膜表面的免疫熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)對CD63表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，CD63在各細(xì)胞系中均有表達(dá)，但HEV易感細(xì)胞系中CD63表達(dá)量普遍低于非易感細(xì)胞系。兩株抗體雖然陽性強(qiáng)度有差異，但總體趨勢一致(圖4)。

2.5 CD63表達(dá)水平變化對HEV感染PLC/PRF/5細(xì)胞的影響

利用外源過表達(dá)和siRNA技術(shù)，對PLC/PRF/5細(xì)胞中CD63的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，并進(jìn)行病毒感染分析。共設(shè)計(jì)3條針對CD63的siRNA，利用膜表面抗原染色和流式細(xì)胞術(shù)對其效率進(jìn)行確認(rèn)。如圖5所示，3條siRNA均能較明顯抑制CD63表達(dá)，其中siCD63-2作用最明顯。為取得更加客觀的研究結(jié)果，選取低劑量的3條siRNA混合作用組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞先進(jìn)行過表達(dá)或siRNA處理，使CD63過表達(dá)或被抑制，然后接種病毒，檢測上清液中的病毒抗原。結(jié)果顯示，抑制CD63表達(dá)有利于PLC/PRF/5細(xì)胞分泌HEV，而增加CD63表達(dá)則抑制細(xì)胞分泌HEV(圖6)。然而，如果先將HEV感染PLC/PRF/5細(xì)胞，再將該細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA干擾CD63表達(dá)，其作用并不明顯(圖7)。以上結(jié)果均提示，CD63可能參與HEV感染過程，發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。

圖5PLC/PRF/5細(xì)胞中CD63siRNA抑制效率檢測

Fig.5InhibitionofCD63expressioninPLC/PRF/5cellsbysiRNA

3 討論

自20世紀(jì)80年代HEV被發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們經(jīng)過不懈努力，逐漸明確了其動(dòng)物宿主、傳播途徑及世界各地流行情況，針對HEV的診斷試劑和疫苗也已陸續(xù)上市[2]。然而，HEV天然構(gòu)象、感染機(jī)制和致病原理仍是困擾科學(xué)界的難題。本研究通過篩選與HEV衣殼蛋白ORF2相互作用的宿主蛋白，分析其在HEV感染中的作用，初步探索了HEV與宿主相互作用的機(jī)制。

酵母雙雜交技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用的篩選蛋白相互作用的方法。傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)檢測的生物分子必須同時(shí)定位于親水性的核基質(zhì)中并具有功能結(jié)構(gòu)，限制了對定位于其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白的相互作用研究。本研究采用近年來經(jīng)優(yōu)化的分裂泛素化雙雜交系統(tǒng)，將誘餌蛋白鉚于膜上，可篩選獲得大量膜相關(guān)蛋白，有助于發(fā)現(xiàn)與病毒相互作用的宿主膜蛋白[13]。篩選前，首先檢測誘餌蛋白的表達(dá)及自激活性，結(jié)果提示ORF2蛋白全長具有自激活作用，不適用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。分析其蛋白結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)ORF2蛋白N端的111個(gè)氨基酸為信號肽區(qū)域，能與質(zhì)膜融合，可能發(fā)生自激活，而去掉N端的ORF2蛋白(如VLP)仍能形成完整的病毒衣殼，因此選用去除信號肽的ORF2蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。

*P<0.05,**P<0.01.

圖6HEV感染能力與CD63表達(dá)水平的關(guān)系

Fig.6TherelationofHEVinfectivitywithCD63expression

n.s., no significant difference.

圖7siCD63對已感染HEV的PLC/PRF/5細(xì)胞的作用

Fig.7TheeffectofsiCD63onHEV-infectedPLC/PRF/5cells

近年來，已知的HEV ORF2結(jié)合蛋白包括硫酸肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)、Grp78/Bip、α管蛋白(α-tublin)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP 90)、CYP2A6、CYP4502C8等，這些蛋白參與HEV與細(xì)胞的結(jié)合、細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等生理過程[14-18]。本研究利用酵母雙雜交、pull-down及免疫共沉淀等方法，首次發(fā)現(xiàn)4次跨膜蛋白超家族成員CD63也能與HEV ORF2相互作用。Pull-down實(shí)驗(yàn)顯示信號較弱，而酵母雙雜交和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)均顯示信號較強(qiáng)，原因可能為原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白缺乏糖基化等翻譯后修飾而造成結(jié)合活性較弱。但CD63與ORF2的結(jié)合是否與其修飾相關(guān)，還需更多實(shí)驗(yàn)來證明。

4次跨膜蛋白超家族由具有4個(gè)結(jié)構(gòu)和序列高度保守的跨膜區(qū)多個(gè)蛋白組成。該家族成員胞外區(qū)的半胱氨酸殘基能被棕櫚?；?，進(jìn)而形成4次跨膜蛋白高度聚集的膜表面微結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域常包含受體、整合素和膽固醇等成分，發(fā)揮著介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。CD63除聚集于細(xì)胞膜表面外，還大量聚集于晚期內(nèi)體〔又名多泡體(multivesicular body，MVB)〕和溶酶體，是MVB的標(biāo)記分子之一[6]。近年來，很多文獻(xiàn)報(bào)道CD63參與某些病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程，如HCV、HPV和HIV等，并同時(shí)調(diào)節(jié)某些病毒的細(xì)胞間傳遞及病毒釋放過程，如HIV[7-8]。Okamoto課題組也發(fā)現(xiàn)HEV ORF2和ORF3可與MVB標(biāo)記的CD63共定位[11,19]，在一定程度上支持本研究發(fā)現(xiàn)的ORF2與CD63的相互作用，但他們未對CD63在HEV感染中的作用進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，改變細(xì)胞內(nèi)CD63表達(dá)水平后再感染HEV，能改變細(xì)胞分泌HEV的水平；但如果先將HEV感染細(xì)胞，然后抑制CD63表達(dá)，則對細(xì)胞分泌HEV的能力無影響。因此，CD63的作用更有可能是調(diào)節(jié)HEV進(jìn)入或復(fù)制環(huán)節(jié)，而非影響HEV分泌出胞環(huán)節(jié)。此外，由于細(xì)胞膜表面CD63表達(dá)水平與HEV的感染性呈負(fù)相關(guān)，而CD63大量存在于晚期內(nèi)體和溶酶體這些介導(dǎo)蛋白降解的細(xì)胞器，推測CD63可能與HEV內(nèi)吞后的降解過程相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CD63為HEV ORF2新的相互作用蛋白，初步探討了其在HEV感染中的作用，為HEV感染和致病機(jī)制的研究提供了新的線索和方向。

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s. HUANG Weijin, E-mail: huangweijin@nifdc.org.cn; WANG Youchun, E-mail: wangyc@nifdc.org.cn

RoleofCD63inhepatitisEvirusinfection

ZHANG Li, WEN Zhiheng, TIAN Yabin, HUANG Weijin, WANG Youchun

NationalInstitutesofFoodandDrugControl,Beijing102629,China

The present paper aimed to find out the interacting protein of hepatitis E virus (HEV) capsid protein ORF2 and explore its role in HEV infection. CD63 was identified as a potential HEV ORF2-interacting protein by screening a human liver cDNA library for yeast two-hybrid method. Co-immunoprecipitation and pull-down assays were used to verify the interaction. The expression of cell surface CD63 was detected by flow cytometry in HEV susceptible, non-susceptible and overexpressed cells (PLC/PRF/5) respectively. HEV infectivity was measured through virus infection assay. The results indicated that expression level of CD63 on the cell membrane of HEV susceptible cell lines was lower than that of HEV non-susceptible cell lines. Overexpression of CD63 inhibited the HEV infection of PLC/PRF/5 cells, while siRNA interference of CD63 promoted the HEV infection. The results indicated that CD63 could interact with HEV ORF2, and may inhibit HEV infection in hepatocytes.

Hepatitis E virus; ORF2; CD63

國家自然科學(xué)基金(81371830)

黃維金，王佑春

2017-05-05)