肖波，郎媛媛

（1. 天津醫(yī)科大學研究生院，天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系，天津 300070；2. 天津市第二兒童醫(yī)院檢驗科，天津 300400）

檢驗論著

胡蘿卜素誘導人骨肉瘤細胞U2OS自噬和凋亡的作用及機制

肖波1，郎媛媛2*

（1. 天津醫(yī)科大學研究生院，天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系，天津 300070；2. 天津市第二兒童醫(yī)院檢驗科，天津 300400）

目的研究毒胡蘿卜素（TG）誘導人骨肉瘤細胞U2OS自噬與凋亡的作用，并探討兩者發(fā)生以及相互關(guān)聯(lián)的分子機制。方法用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP-LC3表達質(zhì)粒，通過熒光顯微鏡觀察U2OS細胞熒光斑的形成，從而明確TG誘導細胞自噬的作用；用TG或同時聯(lián)合3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理U2OS細胞后，檢測自噬蛋白LC3的表達，各組細胞凋亡情況以及細胞形態(tài)改變。結(jié)果TG可誘導U2OS細胞發(fā)生自噬，可見GFP-LC3融合蛋白聚集，形成綠色熒光斑點，3-MA可明顯抑制TG誘導的自噬作用的發(fā)生；TG誘導U2OS細胞介導自噬的過程中LC3-II表達增高，同時TG可誘導U2OS細胞發(fā)生凋亡，在TG給藥前用3-MA處理后會增強這種凋亡作用。結(jié)論TG能抑制U2OS細胞的生長，并誘導其發(fā)生凋亡和自噬。TG誘導的自噬作為保護性機制，可發(fā)揮拮抗凋亡的作用。

毒胡蘿卜素；U2OS；自噬；凋亡

自噬在細胞生長、發(fā)育和疾病發(fā)生過程中起著重要作用。其在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中亦有著重要作用，它不僅是腫瘤細胞的一種生存機制，同時在機體清除腫瘤細胞的過程中也發(fā)揮了重要的作用[1]。毒胡蘿卜素（TG）是一種不可逆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶抑制劑，在多種細胞中能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的細胞自噬[2]。本文通過TG作用于人骨肉瘤細胞系U2OS研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對人骨肉瘤細胞的自噬及凋亡作用，并初步探討兩者發(fā)生的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 本研究所用人骨肉瘤細胞系購于ATCC，DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自Gibco公司，TG購自Alexs公司，3-MA購自Sigma公司，c-Caspase3抗體、LC3抗體、鼠抗人β-actin抗體購自Abcam，HRP標記的羊抗鼠、兔二抗購自Invitrogen公司，ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，熒光顯微鏡：尼康TS800。

1.2 細胞培養(yǎng) 本研究所用人骨肉瘤細胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基，外加100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素，置于37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine 2000在12孔板中進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，調(diào)整細胞培養(yǎng)板中細胞密度為50%-60%融合度，用Optimum培養(yǎng)基50 μL分別稀釋質(zhì)粒0.4 μg，Lipofectamine 2000 1.2 μL，輕輕混勻，室溫放置5 min，將質(zhì)粒稀釋液滴加入Lipofectamine 2000稀釋液中，避光靜置15 min，然后將混合物加入已經(jīng)換為新鮮400 μL無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染4 h后加入500 μL完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)天觀察熒光。

1.4 TG對U2OS細胞形態(tài)學影響的觀察 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養(yǎng)24 h后，分別加入TG（10 μg/mL）或3-MA+TG（TG終濃度為10 μg/mL，加藥前1 h加入終濃度5 mmol/L 3-MA）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.5 TG對U2OS細胞凋亡率影響的觀察 采用流式細胞 術(shù)，分組、干預(yù)及細胞培養(yǎng)同步驟1.4。用0.25%胰酶消化各組U2OS細胞，400g離心5 min后收集細胞，以冰PBS緩沖液漂洗3次，400g離心5 min后收集5×105個細胞，然后再用0.5 mL binding緩沖液制作成細胞懸液，分別加入Annexin V-FITC 5 μL和PI（50 μg/mL）10 μL，輕輕混勻后室溫、避光靜置15 min，1 h之內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，每組實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot TG對U2OS細胞c-Caspase3、LC3蛋白表達影響的觀察采用免疫印跡試驗（Western Blot法）。分組、干預(yù)及細胞培養(yǎng)同步驟1.4。收集各組U2OS細胞，加入2×上樣緩沖液，充分裂解細胞，95oC加熱10 min，10,000 rpm離心5 min，取上清進行SDS-PAGE凝膠電泳，100 V電轉(zhuǎn)至纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBST洗3遍，分別加入兔抗人LC3抗體（1:2,000），鼠抗人c-Caspase抗體（1:1,000），4oC孵育過夜，洗膜。加入HRP標記山羊抗兔二抗（1:5,000）、山羊抗鼠二抗（1:5,000）室溫孵育1 h，PBST洗3遍，加入ECL發(fā)光試劑，顯影，定影，灰度掃描，定量分析。

圖1 毒胡蘿卜素處理U2OS細胞顯微鏡下形態(tài)圖

圖3 Western blot法檢測LC3-I、II和c-Caspase3的表達

1.7 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism V軟件進行分析統(tǒng)計。計量資料采用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 毒胡蘿卜素對U2OS細胞增殖的影響 U2OS細胞經(jīng)TG，3-MA+TG處理24 h后，光學顯微鏡觀察不同處理組細胞形態(tài)，TG組細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)學變化不明顯，3-MA+TG組細胞出現(xiàn)明顯的皺縮，變小，染色質(zhì)凝集，并從培養(yǎng)皿脫落等現(xiàn)象（圖1）。

2.2 毒胡蘿卜素對細胞自噬的影響 GFP-LC3轉(zhuǎn)染U2OS細胞后表達綠色熒光蛋白GFP，細胞無自噬時，GFP-LC3彌漫分布在細胞中。自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型LC3（即LC3-II），后者聚集在自噬泡的表面，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為綠色熒光點（圖2）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，毒胡蘿卜素組與對照組相比，自噬水平顯著增強（P＜0.001），3-MA+毒胡蘿卜素組的自噬作用與對照組相比無明顯增強（P＞0.05）。

2.3 毒胡蘿卜素對LC3-II的表達的影響 毒胡蘿卜素組與3-MA+毒胡蘿卜素組LC3-II蛋白表達量較對照組均上調(diào)，但3-MA+毒胡蘿卜素組LC3-II蛋白表達量仍低于毒胡蘿卜素組。3-MA組較對照組無明顯改變。同時對c-Caspase 3表達量分析可以得出對照組和3-MA組C-Caspase 3表達量極低，3-MA+TG組的c-Caspase 3表達量最高（圖3）。

2.4 毒胡蘿卜素對細胞凋亡的影響 對照組、毒胡蘿卜素組及3-MA+毒胡蘿卜素組的凋亡率分別為（1.76±0.03）%、（11.00±0.03）%、（19.98±0.04）% （圖4），3-MA+毒胡蘿卜素組的凋亡與其他各組相比明顯增強（P＜0.05）。與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖2 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U2OS細胞熒光圖及斑點及計數(shù)

圖4 流式細胞術(shù)檢測毒胡蘿卜素對U2OS細胞凋亡的影響

骨肉瘤（osteosarcoma）是惡性程度較高的骨的原發(fā)性腫瘤，該瘤惡性程度甚高，預(yù)后極差。目前化療仍是骨肉瘤的主要治療手段之一[3]。但化療的同時抑制骨髓造血，降低病人免疫力等副作用，一定程度上限制了化療藥物的使用[4]。因此，利用中西醫(yī)結(jié)合療法治療骨肉瘤，減少化療副作用的研究近來越來越受到關(guān)注。毒胡蘿卜素是存在于許多植物中的天然化合物，有文獻報道，毒胡蘿卜素能夠誘導骨肉瘤細胞凋亡，且具有較小的副作用[5]。自噬在調(diào)控癌癥細胞生存中扮演一把雙刃劍的角色，它不僅是癌癥細胞的一種生存機制，同時在機體清除癌癥細胞的過程中也發(fā)揮了重要的作用。本文的TG作用于U2OS細胞就是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的細胞自噬。

在本實驗中，通過GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及Western blot檢測LC3表達發(fā)現(xiàn)，TG能夠促進骨肉瘤U2OS細胞自噬，而自噬抑制劑3-MA能夠抑制細胞內(nèi)的自噬水平。而凋亡熒光染色及流式細胞儀檢測等結(jié)果又進一步證明，3-MA抑制自噬后能夠明顯增強毒胡蘿卜素對U2OS細胞的凋亡誘導效應(yīng)。因此，二者的聯(lián)合能夠既能降低治療副作用，還能提高TG對腫瘤細胞的凋亡作用，為毒胡蘿卜素的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

總之，毒胡蘿卜素作為一種植物提取物，能夠抑制骨肉瘤U2OS細胞的增殖。本文通過3-MA抑制自噬后明顯增強了毒胡蘿卜素對該細胞系的凋亡誘導效應(yīng)，二者的聯(lián)合應(yīng)用為骨肉瘤的聯(lián)合化療提供了新的思路，同時也提高了毒胡蘿卜素的潛在應(yīng)用價值。

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Effects and mechanisms of carotene on autophagy and apoptosis in human osteosarcoma cell line U2OS

Bo XIAO1, Yuanyuan LANG2*
1. Graduate School of Tianjin Medical University, Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, Tianjin 300070; 2. Department of Clinical Laboratory, Tianjin Second Children's Hospital, Tianjin 300400, China

ObjectiveTo study the effects and potential molecular mechanisms of thapsigargin (TG)-induced autophagy and apoptosis on human bone sarcoma cell line U2OS.MethodsU2OS cells were transfected with GFP-LC3 expression plasmid, fluorescence plaque was oberseved by fluorescence microscopy to understand the role of TG induced autophagy. U2OS cells were treated with control, TG or TG plus 3-methyladenine (3-MA), the autophagy marker protein LC3, cell apoptosis and the morphological changes were detected or observed in each group.ResultsGFP-LC3 fusion protein was accumulated to form green fluorescence spots, western-blot results revealed that expression of LC3-II was increased in the process of autophagy in U2OS cells. Flow cytometry and morphological results exhibited that apoptosis of U2OS cells could be induced by TG and would be enhanced along with 3-MA pretreatment.ConclusionTG could suppress the growth of human bone sarcoma cell line U2OS, and induce the autophagy and apoptosis. In the course of TG-induced death of U2OS cells, autophagy might play a protective role in anti-apoptosis.

Thapsigargin; Autophagy; Apoptosis; LC3