楊明非 張 晶 蘇 雯 王 鵬 張孫東 寇 萍 焦 驕 楊雨春 付玉杰*

(1.北日本制藥株式會社產(chǎn)品研發(fā)室，日本富山縣中新川郡上市町若杉55號 930-0314； 2.廣東省珠海市斗門區(qū)公立醫(yī)療衛(wèi)生機構管理中心，珠海 519125； 3.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040； 4.吉林省林業(yè)科學院，長春 130033)

皮諾斂酸/左旋肉堿降低HepG2細胞脂質(zhì)的最佳濃度配比研究

楊明非1張 晶3蘇 雯2王 鵬3張孫東3寇 萍3焦 驕3楊雨春4付玉杰3*

(1.北日本制藥株式會社產(chǎn)品研發(fā)室，日本富山縣中新川郡上市町若杉55號 930-0314；2.廣東省珠海市斗門區(qū)公立醫(yī)療衛(wèi)生機構管理中心，珠海 519125；3.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；4.吉林省林業(yè)科學院，長春 130033)

針對單一活性成分的減肥降脂效果較差，且容易出現(xiàn)耐藥性等問題，本文篩選并優(yōu)化了皮諾斂酸/左旋肉堿降低HepG2細胞脂質(zhì)的最佳濃度配比，為皮諾斂酸降脂產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)。通過油酸誘導HepG2細胞成脂建立體外非酒精性脂肪肝模型。采用油紅O染色法確定了皮諾斂酸/左旋肉堿降低HepG2細胞中脂滴的最佳濃度配比。實驗結果表明0.5 mmol·L-1油酸誘導HepG2細胞脂肪變性效果最佳，皮諾斂酸(PLA)最佳降脂濃度為6.25 μmol·L-1，左旋肉堿(LC)最佳降脂濃度為250 μmol·L-1，皮諾斂酸/左旋肉堿 (PLA /LC) 最佳降脂濃度配比為1∶40 (μmol·L-1/μmol·L-1)。皮諾斂酸/左旋肉堿復配物可以顯著降低HepG2細胞脂質(zhì)，具有用量少，協(xié)同作用效果突出的優(yōu)點，因此皮諾斂酸/左旋肉堿復配物在開發(fā)降脂減肥產(chǎn)品中具有良好的應用前景。

皮諾斂酸；左旋肉堿；復配；降脂；非酒精性脂肪肝

皮諾斂酸(Pinolenic acid)又稱洗血因子，是一種僅存在于紅松籽油中[1～2]的新型多不飽和脂肪酸，屬于△5型多不飽和脂肪酸，具有減肥、降血脂以及抑制癌細胞轉移等功能[3～4]。研究顯示，皮諾斂酸能夠刺激兩大饑餓抑制劑—縮膽囊素(CCK)和胰高血糖素樣膚-1(GLP-1)，其中CCK要主要作用是刺激胰酶的分泌與合成，也可作為飽感因素來調(diào)節(jié)食欲，GLP-1是回腸內(nèi)分泌的一種腦腸肽，一般作為2型糖尿病藥物作用的靶點[5]。此外，皮諾斂酸不僅可以抑制小鼠營養(yǎng)性肥胖[6]，還可以降低低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein)[7]，在美國也有以其為主要功能成分的減肥食品出售。因此皮諾斂酸可以作為一種健康的降脂減肥營養(yǎng)食品。

左旋肉堿(L-Carnitiue)，又稱L-肉堿，維生素BT[8]?；瘜W名為β-羥基γ-三甲銨丁酸，是一種自然界中廣泛存在的類維生素，首次由俄國科學家在肌肉浸汁中發(fā)現(xiàn)[9]。目前可從飲食中獲得，也可通過內(nèi)源性生物合成。長期以來，L-肉堿被公認為脂質(zhì)代謝中重要的組成部分，并且具有很好的抗氧化活性[10～12]。研究發(fā)現(xiàn)，左旋肉堿通過加速脂肪代謝速率，發(fā)揮了其對人體脂肪酸氧化的重要作用。除此之外，左旋肉堿還具有抗疲勞及減肥的作用。

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種無過度飲酒，以肝細胞脂質(zhì)貯積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合征，包括脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝癌以及肥胖癥等[13～14]。目前NAFLD在我國的患病率約為15%～20%，在40歲以上男性中患病率高達30%，且近幾年有年輕化的趨勢[15]。研究者對于NAFLD發(fā)病機制的研究主要圍繞在脂代謝異常、胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化等方面[16～18]。

功能活性成分的復配應用廣泛，具有用量少，延緩抗性，增加功效，作用方式互補等優(yōu)點。雖然有研究表明皮諾斂酸和左旋肉堿能夠降低體重，但是對兩者具體的降脂效果報道較少。本實驗首次對皮諾斂酸和左旋肉堿二者進行復配，并考察其對HepG2非酒精性脂肪肝模型的降脂效果，以期獲得功效更好的降低脂質(zhì)的皮諾斂酸/左旋肉堿復配物，為紅松籽油的開發(fā)利用提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

油酸，MTT，DMSO，EDTA(美國Sigma公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，青霉素，鏈霉素雙抗(Beyotime生物技術研究所)，飽和油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司)，異丙醇(天津市瑞金特化學品有限公司)，人肝癌HepG2細胞株(中國科學院細胞庫)，皮諾斂酸(純度50%)由東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學國家重點實驗室付玉杰團隊提取，左旋肉堿(純度≥98%)購自四川維克奇生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1HepG2細胞培養(yǎng)

將HepG2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素，鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃，5% CO2孵育。當細胞密度達到80%以上時，用0.25%(含EDTA)胰酶消化，按1∶2比例傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2非酒精性脂肪肝模型的建立

接種HepG2于24孔板中，過夜，待細胞貼壁生長至70%后，分別加入含不同濃度含油酸的培養(yǎng)液(0，0.25，0.5，1.0mmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。結合細胞形態(tài)觀察并選擇對細胞毒性較小的濃度作為誘導細胞形成脂肪變性的最適濃度。

1.2.3細胞毒性檢測

當細胞密度達到80%時，將HepG2細胞接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后。分別用0(對照組)、0.5、0.7812、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1的皮諾斂酸或0(對照組)、20、40、62.5、125、250、500、1000、2000、4000μmol·L-1的左旋肉堿或0(對照組)、0.5∶20、1∶40、1.5∶80、2∶100、2.5∶200、5∶300、10∶400、12.5∶500(μmol·L-1/μmol·L-1)的皮諾斂酸/左旋肉堿復配物處理細胞。處理24h后每孔加入20μL MTT(5mg·mL-1)，避光，37℃孵育4h后，棄去培養(yǎng)液，然后加入100μL DMSO，震蕩混勻后選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，分析皮諾斂酸，左旋肉堿以及皮諾斂酸/左旋肉堿復配物對HepG2細胞的毒性。

1.2.4HepG2細胞油紅O染色

將HepG2細胞接種于24孔板中，貼壁培養(yǎng)過夜。分別將1.5625、3.125、6.25、12.5μmol·L-1的皮諾斂酸或62.5、125、250、500μmol·L-1的左旋肉堿或12.5∶500、6.25∶500、12.5∶250、6.25∶250(μmol·L-1/μmol·L-1)皮諾斂酸/左旋肉堿的高濃度復配組，或0.5∶20、1∶40、1.5∶80、2∶100(μmol·L-1/μmol·L-1)皮諾斂酸/左旋肉堿的低濃度復配組混于含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞12h后，小心移去培養(yǎng)液，加入含0.5mmol·L-1油酸的2%胎牛血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。24h后，用生理鹽水清洗3次，油紅O染色30min，再用60%的異丙醇固定2min，立即用生理鹽水清洗3次，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及脂滴分布情況，并拍照記錄實驗結果。

1.2.5油紅O染色細胞內(nèi)脂滴含量測定

油紅O染色步驟同1.2.4，待終止染色后，加入100%異丙醇進行破膜，待細胞內(nèi)油紅O完全溶出后，震蕩10min，490nm下進行OD值檢測。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析

本實驗中所有測試重復3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差(SD)表示。顯著性差異通過單因素方差分析計算，顯著性水平(P<0.05)。借助Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，制圖。

2 結果與分析

2.1 油酸誘導HepG2細胞成脂的最佳濃度

通過油紅O染色肉眼觀察0.25，0.5，1mmol·L-1油酸處理細胞后胞內(nèi)脂滴分布情況。由于1mmol·L-1油酸處理細胞后，脂滴量過多，不利于后期藥物降脂濃度的篩選，而0.25mmol·L-1油酸處理細胞后脂滴積累量少，選用0.5mmol·L-1油酸誘導HepG2細胞建立非酒精性脂肪肝模型(圖1和圖版Ⅰ:1～4)。

圖1 油紅O染色定量分析Fig.1 Quantification of oil red O staining

2.2 皮諾斂酸對HepG2細胞模型中積累脂質(zhì)的影響

利用MTT法檢測皮諾斂酸對HepG2細胞生長的影響，結果顯示皮諾斂酸濃度在0.5～25 μmol·L-1時，對HepG2細胞存活率無顯著影響，而超過50 μmol·L-1時對細胞有一定的毒性(圖2A)，因此選擇皮諾斂酸的處理濃度為1.562 5、3.125、6.25、12.5 μmol·L-1，在此基礎上處理HepG2細胞，觀察細胞中脂滴的積累量。油紅O染色結果表明，皮諾斂酸處理組HepG2細胞中紅色脂滴顯著下降，說明皮諾斂酸能夠有效降低HepG2細胞內(nèi)積累的脂質(zhì)，且最佳降脂濃度為6.25 μmol·L-1(圖2B和圖版Ⅰ:5～10)。

圖2 不同濃度的皮諾斂酸對HepG2細胞的降脂作用A.皮諾斂酸對細胞存活狀況的影響；B.油紅O染色定量分析Fig.2 Effects of different concentrations of pinolenic acid on lipid decrease in HepG2 cells A. Cell viability treated with pinolenic acid; B. Quantification of oil red O staining

2.3 左旋肉堿對HepG2細胞模型中積累脂質(zhì)的影響

MTT法檢測結果表明，左旋肉堿濃度為20～2 000 μmol·L-1時，細胞存活率為80%以上，說明對HepG2細胞生長無顯著影響，而超過4 000 μmol·L-1時細胞的存活率低于80%，說明對細胞有一定的毒性(圖3A)。因此，選擇左旋肉堿處理濃度為62.5、125、250、500 μmol·L-1處理細胞，并觀察細胞中脂滴的積累量。結果顯示左旋肉堿處理組細胞中紅色脂滴顯著下降，左旋肉堿的最佳降脂濃度為250 μmol·L-1(圖3B和圖版Ⅰ:11～16)。

圖3 不同濃度的左旋肉堿對HepG2細胞的降脂作用A.細胞存活狀況；B.油紅O染色定量分析Fig.3 Effects of different concentrations of L-Carnitine on lipid decrease in HepG2 cells A. Cell viability treated with L-Carnitine; B. Quantification of oil red O staining

2.4 皮諾斂酸/左旋肉堿復配物對HepG2細胞模型中積累脂質(zhì)的影響

由MTT結果可知，與對照組相比，皮諾斂酸/左旋肉堿濃度配比為：0.5∶20、1∶40、1.5∶80、2∶100、2.5∶200、5∶300、10∶400、12.5∶500(μmol·L-1/μmol·L-1)，對細胞生長無抑制作用(圖4A)。在此濃度復配物基礎上處理細胞，觀察細胞中脂滴的積累量，油紅O染色細胞形態(tài)學表明，高濃度復配物組細胞內(nèi)脂滴量沒有減小，因此說明以上濃度不具有降脂作用(圖4:B和圖版Ⅰ:17～22)。然而低濃度復配物組與模型組比較可知，HepG2細胞內(nèi)脂滴量顯著減少，并且優(yōu)化出復配物最佳降脂濃度比例PLA/LC為1∶40(μmol·L-1/μmol·L-1)(圖4:C和圖版Ⅰ:23～28)。

圖4 不同濃度的復配物對HepG2細胞的降脂作用 A.復配物物對細胞存活狀況的影響；B.高濃度復配物油紅O染色定量；C.低濃度復配物油紅O染色定量分析Fig.4 Effect of different concentrations of combination compounds on lipid decrease in HepG2 cells A. Cell viability treated with combination compounds; B. High concentration of compounds quantification of oil red O staining; C. Low concentration of compounds quantification of oil red O staining

3 結論

近年來，隨著生活水平的提高，肥胖癥及代謝紊亂性疾病不斷增加，NAFLD的發(fā)病率也不斷上升，它的防治已受到廣泛的關注，因此本實驗采用油酸誘導法建立非酒精性脂肪肝模型，篩選優(yōu)化出皮諾斂酸、左旋右堿的最佳降脂濃度以及皮諾斂酸/左旋右堿復配物的最佳濃度比例。

通過MTT實驗法篩選出皮諾斂酸對細胞無毒作用的濃度范圍是0.5～25 μmol·L-1，通過油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂滴的積累量，皮諾斂酸濃度為6.25 μmol·L-1時，細胞內(nèi)紅色脂滴量最少，降脂作用最明顯；左旋肉堿對細胞無毒作用的濃度范圍是20～2 000 μmol·L-1，通過油紅O染色法觀察到左旋肉堿濃度為250 μmol·L-1時，細胞內(nèi)脂滴量最少，降脂效果最佳。

圖版Ⅰ 油紅O染色(10×20)細胞形態(tài) 1～4油酸處理組：0、0.25、0.5、1 mmol·L-1油酸對HepG2細胞脂滴積累的影響，皮諾斂酸油紅O染色圖(10×20) 5～10皮諾斂酸處理組：5.對照組；6.模型組；7～10. 1.562 5、3.125、6.25、12.5 μmol·L-1的皮諾斂酸；左旋肉堿油紅O染色圖(10×20) 11～16左旋肉堿處理組：11.對照組；12；模型組；13～16. 62.5、125、250、500 mmol·L-1的左旋肉堿；皮諾斂酸/左旋肉堿低濃度復配物油紅染色(10×20) 17～22低濃度復配物處理組：17.對照組；18.模型組；19～22. 6.25∶500、6.25∶250、12.5∶500、12.5∶250的皮諾斂酸/左旋肉堿低濃度復配物；皮諾斂酸/左旋肉堿高濃度復配物油紅染色(10×20) 23～28高濃度復配物處理組：23.對照組；24.模型組；25～28. 0.5∶20、1∶40、1.5∶80、2∶100的皮諾斂酸/左旋肉堿低濃度復配物Plate Ⅰ Oil red O staining(10×20) 1～4 oleic acid treated group: 0, 0.25, 0.5, 1 mmol·L-1 of oleic acid on lipid accumulation in HepG2 cell; Pinolenic acid oil red O staining(10×20) 5～10 pinolenic acid treated group: 5. Control; 6. Model; 7-10. 1.562 5, 3.125, 6.25, 12.5 μmol·L-1 of pinolenic acid; L-Carnitine oil red O staining(10×20) 11～16 L-Carnitine treated group: 11. Control; 12. Model; 13-16. 62.5, 125, 250, 500 mmol·L-1 of L-Carnitine; High concentration of combination pinoleic acid/L-Carnitine oil red O staining(10×20) 17-22 high concentration of combination pinoleic acid/L-Carnitine treated group: 17. Control; 18. Model; 19-22. 6.25∶500, 6.25∶250, 12.5∶500, 12.5∶250 of combination pinoleic acid/L-Carnitine; Low concentration of combination pinoleic acid/L-Carnitine oil red O staining(10×20) 23-28 low concentration of combination pinoleic acid/L-Carnitine treated group: 23. Control; 24. Model; 25-28. 0.5∶20, 1∶40, 1.5∶80, 2∶100 of combination pinoleic acid/L-Carnitine

為了達到更好的降脂作用，采用復配法進行實驗研究。通過油紅O染色法觀察到，將兩種單一藥物的最佳降脂濃度進行復配時，細胞內(nèi)脂滴積累量沒有減少，表明降脂作用不明顯。之后分別將兩種藥物的濃度降低后進行復配，觀察到細胞內(nèi)紅色脂滴量減少，表明降脂作用明顯。實驗結果表明，當皮諾斂酸/左旋肉堿配比為1∶40 μmol·L-1/μmol·L-1的降脂效果最好。綜上所述，低濃度混合的皮諾斂酸/左旋肉堿復配物降脂效果優(yōu)于單一成分的降脂效果，且明顯好于兩種藥物最佳濃度混合時的效果。這說明活性成分復配不僅能夠降低用量，而且減少成分的耐受性，同時能夠激活多靶點，協(xié)同作用效果突出，作用效果穩(wěn)定。本文研究結果將為紅松籽油降脂減肥復方保健品或者藥品開發(fā)提供了重要的科學數(shù)據(jù)。

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“13th Five-Year” The National Key Research Projects(2016YFD0600805)

introduction：YANG Ming-Fei(1989—),male,master of clinical Engaged in cancer medicine research.

date:2017-03-15

TheOptimizedProportionofCombinationPinoleicAcid/L-CarnitineDecreaseLipidinHepG2

YANG Ming-Fei1ZHANG Jing3SU Wen2WANG Peng3ZHANG Sun-Dong3KOU Ping3JIAO Jiao3YANG Yu-Chun4FU Yu-Jie3*

(1.Research and Development Department of Kitanihon Pharmaceutical CO.,No.55,Kamiichi,Nakaniikawa District,Toyama,Japan930-0314；2.Management Center of Public Medical and Health Institutions in Doumen District,Zhuhai City,Guangdong Province,Zhuhai519125；3.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin150040；4.Forestry Academy of Jilin Province,Changchun130033)

As the single active ingredient is poor and prone to drug resistance on effects of lose weight and lipid-lowering, so the study focuses on screening and optimizing the optimal concentration ratio of pinoleic acid/L-carnitine to reduce the lipid of HepG2cell, which provides the basic data for the development of pinoleic acid lipid-lowering products. Oleic acid induced HepG2cell adipogenesis, which was used to simulate the model of nonalcoholic fatty liver in vitro. The optimal concentration in combination of pinoleic acid/L-Carnitine decrease lipid was determinated by oil red O staining. The results show that the optimum concentration of oleic acid-induced HepG2cell steatosis is0.5mmol·L-1.The optimal lipolysis concentration of pinoleic acid is6.25μmol·L-1. The optimal lipid metabolism concentration of L-Carnitine is250μmol·L-1. The best lipid-lowering ratio of pinoleic acid/L-carnitine(PLA/LC) is1∶40(μmol·L-1/μmol·L-1). The characteristics of pinoleic acid and L-Carnitine complexes decreased the doses and improved synergistic effect, Therefore, Combination of pinoleic acid/L-Carnitine has a potential prospectin in the development of lipid-lowering diet products.

pinoleic acid;L-Carnitine;complexes;lipid-lowering;nonalcoholic fatty liver disease

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0600805)

楊明非(1989—) ，男，臨床醫(yī)學碩士，主要從事腫瘤藥物研究。

* 通信作者：E-mail:yujie_fu@163.com

2017-03-15

* Corresponding author：E-mail:yujie_fu@163.com

Q547

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.018