張葉軍， 王旭研， 王 贏， 李洪艷， 崔玉影， 鄒 偉

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081)

Flotillin-1在黑腹果蠅不同發(fā)育階段的表達

張葉軍*， 王旭研*， 王 贏， 李洪艷， 崔玉影， 鄒 偉

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081)

脂筏(Lipid raft)是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂以及特定蛋白的微結(jié)構(gòu)域，浮艦蛋白-1(Flotillin-1)是脂筏標記蛋白，與軸突再生、學習記憶和腫瘤形成等過程相關(guān).近年發(fā)現(xiàn)，從無脊椎動物到脊椎動物的很多種類都有Flotillin-1的表達，且在進化上高度保守.果蠅屬于完全變態(tài)昆蟲，是一種重要的模式生物，含有人類疾病相關(guān)基因中65%同源基因.因此，研究這些基因在果蠅不同發(fā)育階段的表達分布特征,對深入闡明人體病理機制具有重要意義.以黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)為研究對象，通過Western blot和免疫熒光方法檢測Flotillin-1在果蠅不同發(fā)育階段的表達.結(jié)果如下：Flotillin-1在果蠅不同發(fā)育階段的表達水平和分布不同：幼蟲期僅脂肪體中少量表達；蛹期消化道和脂肪體中有少量表達；成蟲期主要在腦、復(fù)眼、消化道、生殖腺中表達，肌肉中也有少量表達；該蛋白在成蟲中的表達量顯著高于幼蟲和蛹.

黑腹果蠅；Flotillin-1；表達分布

黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)作為模式動物被普遍應(yīng)用于遺傳現(xiàn)象、行為和發(fā)育分子機制的研究.科學家在2000年已完成對果蠅13 600個基因的測序.研究發(fā)現(xiàn)，果蠅與人類在基因組中有接近80%的同源基因，而且在果蠅的遺傳物質(zhì)里找到了大約65%的人類致癌基因[1].果蠅為完成人類基因和疾病變異功能注釋提供了一個強大平臺，為遺傳和基因組工程高效快速發(fā)展提供了最先進的工具和資源.通過研究果蠅中某些基因如何影響特定的細胞過程，為深入探討神經(jīng)、心血管、新陳代謝和腎系統(tǒng)等分子機制提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)[2].

脂筏(Lipid raft)是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂以及特定蛋白的微結(jié)構(gòu)域，浮艦蛋白-1(Flotillin-1)是脂筏標記蛋白，是高度保守的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白和雌激素應(yīng)答基因，存在于大多數(shù)動物中，尤其在哺乳動物中廣泛表達，而且在神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織以及紅細胞中特別豐富，其同源蛋白也存在于原核生物和植物中[3].Flotillin-1在神經(jīng)發(fā)育早期發(fā)揮重要作用[4-6]，神經(jīng)元發(fā)育對學習和記憶是非常重要的.哺乳動物中Flotillin-1與記憶相關(guān)過程有關(guān)，然而其在記憶形成和人類相關(guān)疾病中的作用還有待進一步研究.從細菌到人類中的Flotillin-1都是保守蛋白，F(xiàn)lotillin-1可能作為質(zhì)膜微區(qū)腳手架蛋白參與多種生命過程，如信號轉(zhuǎn)導、胞吞胞吐、蛋白質(zhì)運輸、細胞轉(zhuǎn)運和細胞分裂等，但其在上述過程中的分子機制和具體功能目前仍不十分清楚[7].

另外，F(xiàn)lotillin-1在質(zhì)膜受體信號轉(zhuǎn)導等多種細胞過程中發(fā)揮重要作用，也參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展階段.最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lotillin-1在人類乳腺癌、大腸癌、食管鱗狀細胞癌等上皮來源的癌癥中表達水平顯著上調(diào)，敲低Flotillin-1可顯著抑制癌細胞增殖和致瘤性，但其確切分子機制仍不清楚[8].

本文以黑腹果蠅為研究對象，利用Western blot和免疫熒光共聚焦方法檢測Flotillin-1在果蠅幼蟲、蛹和成蟲時期的表達變化，旨在闡明Flotillin-1蛋白在黑腹果蠅不同發(fā)育階段的表達分布模式，探討Flotillin-1在果蠅發(fā)育過程中的作用，為進一步研究其作用的分子機制提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

野生型黑腹果蠅品系，由遼寧師范大學遺傳學實驗室提供.果蠅培養(yǎng)基(杭州基礎(chǔ)生物科技有限公司)；Flotillin-1單克隆二抗抗兔抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；FITC標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB2301)、GAPDH單克隆二抗抗鼠抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAPI染色液、熒光防淬滅劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECLTM化學發(fā)光試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；ExpressPlusTM預(yù)制膠(南京金斯瑞生物科技有限公司)；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 果蠅培養(yǎng)

將果蠅于室溫下培養(yǎng)在玉米培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：酵母粉9.2 g/L，瓊脂8.2 g/L，蔗糖81.5 g/L，玉米粉108.5 g/L，苯甲酸鈉1.3 g/L.

1.3 果蠅石蠟切片的制備

配制試劑.分別取果蠅幼蟲、蛹和成蟲投入Bouin液中固定數(shù)小時.將固定的材料直接移入70%酒精中沖洗，直至材料無黃色為止.脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，切片厚度為4 μm，貼片和烤片.將載玻片編號，室溫保存.

1.4 免疫熒光和共聚焦技術(shù)

在二甲苯和無水乙醇濃度梯度溶液中脫蠟、脫水，流水沖洗 5 min，3次，磷酸緩沖液PBS充分淋洗5 min,3次.1% BSA，37 ℃避光封閉30 min，4 ℃孵育Flotillin-1一抗48 h.PBS充分淋洗5 min，3次，室溫避光孵育二抗IgG-TRITC 1.5 h.PBS充分淋洗5 min，3次，室溫避光孵育Hoechst 33342 5 min.PBS充分淋洗5 min，3次，雙蒸水沖洗5 min，加防淬滅劑封片.激光掃描共聚焦顯微鏡鏡檢切片.

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

分別提取果蠅幼蟲、蛹和成蟲中總蛋白.10%(質(zhì)量分數(shù))SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h.根據(jù)不同抗體的最佳作用效價，用PBST稀釋一抗，將封閉好的PVDF膜置于稀釋后的一抗中，4 ℃孵育過夜.室溫PBST洗膜3次，每次10 min，與對應(yīng)辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶8 000)室溫孵育90 min；PBST洗膜3次.ECL顯色，進行X光膠片感光，沖洗膠片.掃描儀和凝膠成像系統(tǒng)記錄相應(yīng)條帶的透色光積分吸光度值.Gapdh條帶作為內(nèi)參.

1.6 統(tǒng)計學分析

所有實驗均為3次以上(n≥3)獨立重復(fù)實驗.實驗結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)分析采用組間t檢驗和方差分析，數(shù)據(jù)均以mean±SD表示，*P<0.05表示對比2組之間差異顯著性，**P<0.01表示極顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 Flotillin-1蛋白在果蠅不同發(fā)育階段的表達分布

分別選取果蠅幼蟲石蠟切片的第4、10張，蛹切片的第2、6、11張以及成蟲切片的第3、13、24張進行免疫熒光實驗，在共聚焦顯微鏡下觀察Flotillin-1蛋白的表達分布情況.結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)lotillin-1蛋白在果蠅的不同生長發(fā)育時期表達分布不同：幼蟲期僅脂肪體中少量表達(圖1A)；蛹期腸壁和脂肪體中有少量表達(圖1B)；成蟲期主要在腦、復(fù)眼、腸壁、生殖腺中表達，肌肉中也有少量表達(圖1C).

圖1 Flotillin-1蛋白在果蠅不同發(fā)育階段的表達分布 Fig.1 The distribution of Flotillin-1 in different developmental stages of the D. melanogasterLarva (A), pupa (B) and adult (C) were fixed and immuno-stained with antibodies against Flotillin-1 (green) and nuclei were counter-stained with DAPI (blue), respectively. Original magnification, 100×

2.2 Flotillin-1蛋白在果蠅不同發(fā)育階段的表達水平

運用蛋白免疫印跡方法，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)lotillin-1蛋白在黑腹果蠅不同發(fā)育時期的表達量不同，主要在果蠅成蟲中表達，幼蟲和蛹中少量表達，而且Flotillin-1蛋白在成蟲中的表達量比幼蟲和蛹中顯著增加.

圖2 Flotillin-1蛋白在果蠅不同發(fā)育階段的表達水平Fig. 2 The expression level of Flotillin-1 protein at different developmental stages in D. melanogaster A.The band intensities for Flotillin-1 protein were normalized against that of the GAPDH protein. B. Values were expressed as arbitrary units of relative value. Significant differences of different developmental stages (n=3, *P<0.05, **P<0.01) were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA)

3 討 論

Flotillin-1蛋白是一種重要的脂筏標記蛋白，而脂筏是質(zhì)膜上的一個動態(tài)微結(jié)構(gòu)域，并且Flotillin-1在進化上高度保守.目前，已發(fā)現(xiàn)從無脊椎動物到脊椎動物的多個種類普遍有Flotillin-1的表達，而且在進化上高度保守，不同物種之間Flotillin-1的相似度超過60%[9-11].利用DNA Star軟件對果蠅Flotillin-1的氨基酸序列與其他物種該蛋白的氨基酸序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)果蠅Flotillin-1蛋白的氨基酸序列與其他物種的同源性非常高；同時利用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)此蛋白在物種進化過程中具有協(xié)同性，因此，進一步驗證Flotillin-1蛋白具有高度保守性(結(jié)果尚未發(fā)表).

質(zhì)膜脂筏區(qū)域優(yōu)先募集膜蛋白和脂質(zhì)促進其相互作用，從而調(diào)節(jié)跨膜信號轉(zhuǎn)導和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12].Flotillin-1作為質(zhì)膜微區(qū)腳手架蛋白，在多種信號轉(zhuǎn)導通路和生理過程中發(fā)揮重要作用.Flotillin-1廣泛表達在所有脊椎動物中，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織和紅細胞中特別豐富[13-14].最近研究發(fā)現(xiàn)在同種生物的不同部位，F(xiàn)lotillin-1的表達量相差很多，其在腦中高表達并顯著高于其他組織，在心臟、肺、脊髓、胎盤和睪丸等組織有表達，在胰腺和肝臟中低表達[9].然而，F(xiàn)lotillin-1在昆蟲個體發(fā)育的細胞和亞細胞分布模式的變化尚不清楚.

為研究Flotillin-1在果蠅發(fā)育體系中的組織結(jié)構(gòu)定位，利用免疫熒光共聚焦方法檢測Flotillin-1蛋白在其不同發(fā)育階段的表達分布變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lotillin-1蛋白在果蠅的不同生長發(fā)育時期表達分布不同：幼蟲期僅脂肪體中少量表達；蛹期腸壁和脂肪體中有少量表達；成蟲期主要在腦、復(fù)眼、腸壁、生殖腺中表達，肌肉中也有少量表達.果蠅Flotillin-1的表達主要受限于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，這與哺乳動物中Flotillin-1的mRNA和蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪組織和肌肉中廣泛表達，尤其在腦組織中大量表達的結(jié)果一致[15].von Philipsborn等研究發(fā)現(xiàn)，在模式生物斑馬魚(Zebra fish)胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)lotillin-1強烈表達，尤其在軸突處，這個位置是視神經(jīng)交叉等軸突束發(fā)生的地方，與Flotillin-1在果蠅成蟲復(fù)眼中高度表達相一致[16].由于昆蟲的脂肪體類似于哺乳動物的脂肪和肝臟，因此在果蠅幼蟲、蛹和成蟲脂肪體中均觀察到Flotillin-1表達.

Flotillin-1是進化上高度保守的記憶相關(guān)蛋白質(zhì)[17].最近報道，F(xiàn)lotillin-1在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮不同功能，其對軸突再生、海馬神經(jīng)元分化和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白內(nèi)化非常重要[4].海洋無脊椎動物海兔的鰓和管形口器退縮反射是研究學習和記憶突觸可塑性的理想應(yīng)用模型系統(tǒng)之一.Monje等通過鰓和管形口器退縮反射行為敏感化訓練海兔后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lotillin-1在其腹部神經(jīng)節(jié)處的表達水平上調(diào)；利用水迷宮訓練小鼠后，發(fā)現(xiàn)Flotillin-1在其海馬組織中的表達水平顯著提高，表明Flotillin-1與哺乳動物系統(tǒng)中記憶相關(guān)過程有關(guān)[17].推測Flotillin-1在果蠅中可能也發(fā)揮相似的功能.

進一步實驗應(yīng)使用基因敲除動物模型來確定Flotillin-1在果蠅神經(jīng)、消化、生殖系統(tǒng)等中的確切功能，并研究其作用的分子機制，這些結(jié)果將為研究Flotillin-1在人類學習記憶形成和相關(guān)疾病中的作用提供依據(jù).

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TheexpressionofFlotillin-1indifferentdevelopmentalstagesofDrosophilamelanogaster

ZHANGYejun,WANGXuyan,WANGYing,LIHongyan,CUIYuying,ZOUWei

(School of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

Lipid rafts microdomains of the plasma membrane that are rich in cholesterol, sphingomyelin as well as specific proteins on the plasma membrane. Flotillin-1 is a marker protein of lipid rafts, it is related to axonal growth, learning-memory and tumor formation. It has been found that Flotillin-1 expresses in various types of invertebrates and vertebrates and it is highly conserved in evolution.D.melanogasteris a complete metamorphosis insect, as a kind of important model organism, it contains at least 65% homologous genes of the human disease related genes. Therefore, studying the expression and distribution of these genes in different developmental stages ofDrosophilais of great significance to further clarify the mechanism of human pathology. In this paper, the expression levels and distributions of Flotillin-1 in different developmental stages ofD.melanogasterwere detected utilizing Western blot and immunofluorescence. The results were as follows:The expression levels and distributions of Flotillin-1 varied in different developmental stages ofD.melanogaster:the vivo distribution of Flotillin-1 was very little only in the fat bodies in larval stage, a little in the alimentary canal and fat bodies in pupa stage, mainly in the brain, ommateum, alimentary canal, genital gland and a little in the muscles in adult stage. While, the expression levels of Flotillin-1 in adults were significantly higher than those of the larvae and pupae.

Drosophilamelanogaster;Flotillin-1;expression and distribution

Q71

A

2017-06-09

遼寧省自然科學基金資助項目(2015020568);遼寧教育廳科學研究一般項目(L201783647)

張葉軍(1979- )，女，河北懷安人，遼寧師范大學講師，博士;

王旭研(1993- )，女(滿族)，內(nèi)蒙古扎蘭屯人，遼寧師范大學碩士研究生.

*共同第一作者

1000-1735(2017)04-0513-06

10.11679/lsxblk2017040513