姜穎，孫宇峰，李秋芝，潘冬梅，韓喜財

（黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163319）

大麻中THCA合成酶基因的表達分析

姜穎，孫宇峰，李秋芝，潘冬梅，韓喜財

（黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163319）

針對大麻不同品種的不同組織，利用半定量RT－PCR和熒光定量PCR進行THCA合成酶基因的表達分析，結(jié)果顯示：不同品種CsTHCAmRNA表達量存在組織間的不同，CsTHCAmRNA在火麻一號的雄花中表達量最高；在五常40的雌花中表達量最高；在金刀15的葉片中表達量最高；且在根中的表達量相對較高，在莖和籽粒中的表達量較低。通過分析大麻中THCA合成酶基因的表達并結(jié)合薄層色譜法發(fā)現(xiàn)THC含量與CsTHCAmRNA表達量之間可能呈正相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)可為大麻安全推廣提供理論指導(dǎo)。

大麻；THCA合成酶基因（CsTHCA）；半定量PCR；熒光定量PCR；表達分析

大麻（Cannabis sativaL.）是大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（CannabisL.）一年生草本植物［1－2］，是我國傳統(tǒng)經(jīng)濟作物，具有重要的工業(yè)及藥用價值，在我國已有5000多年的栽培利用歷史［3－4］。大麻的產(chǎn)品利用涉及紡織、造紙、軍需、化工、建材、食品及制藥等多個方面［5－6］。然而，由于大麻中含有一種致幻成癮的活性成分——四氫大麻酚（THC），易被不法分子用來非法生產(chǎn)毒品，造成社會危害，因此許多國家把工業(yè)大麻也一并列為禁種作物［7－8］。受遺傳控制、生長環(huán)境和栽培條件影響，大麻THC含量在個體之間存在差異，主要體現(xiàn)在大麻植株莖、葉、花、苞片等部位中［9］。THC生物合成關(guān)鍵酶四氫大麻酸（THCA）合成酶為單體脫氫酶，可催化由戊基間苯二酚酸到四氫大麻酸A的氧化環(huán)化反應(yīng)［10］。Kojoma M.等［11］研究認為，高毒大麻（THC含量為1.19%～7.51%）和低毒大麻（THC含量為0%～0.12%）資源中均存在THCAS基因，基因序列多態(tài)性導(dǎo)致大麻植株中THCAS酶的活性高低，從而決定了THC含量。目前，有關(guān)THCA合成酶基因表達分析的報道較少。本研究針對大麻THCA合成酶基因CsTHCA在大麻正常生長發(fā)育過程中的表達情況，對不同品種、不同組織間CsTHCA的表達進行分析，結(jié)合薄層色譜法研究THC在不同組織間的積累情況，進而確定CsTHCA表達量與THC含量之間的關(guān)系，旨在為工業(yè)大麻和藥用大麻的檢測鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料選用3個大麻品種，分別為：火麻一號、五常40和金刀15?；鹇橐惶?、五常40由黑龍江省科學院大慶分院亞麻綜合利用研究所提供，金刀15引種于烏克蘭，3個品種在試驗區(qū)種植性狀都表現(xiàn)良好，以上植物材料均種植于黑龍江省科學院大慶分院試驗基地。在各個品種開花期，分別采取各個品種的根、莖、葉、雄花、雌花，結(jié)實期采取各個品種的籽粒，液氮速凍，保存于－80℃。

1.2 大麻不同品種、不同組織間CsTHCA的半定量PCR

提取正常生長條件下不同品種、不同組織的總 RNA（ProbeGene公司），DNase I（TaKaRa）消化處理后，利用UV－2550紫外分光光度計測定其濃度，然后進行均一化定量，利用第一鏈cDNA Synthesis Kit（ProbeGene公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，以此為模板進行PCR擴增，反轉(zhuǎn)錄后進行半定量RT－PCR分析。CsTHCA的半定量RT－PCR引物為：

CsTHCAsq F：5’－AGAGAAATTATGGCCTTGCGG－3’CsTHCAsq R：5’－CGCACTGTAGTCTTATTCTTCCC－3’半定量分析中選用的內(nèi)參基因用于數(shù)據(jù)分析時對不同處理樣品的cDNA模板量進行校準，所用引物為：

C.sativa Specific F：5’－GGGGGATTACATTGTTAATTATTCC－3’

C.sativa Specific R：5’－ATCCTCTCATTCCGTTAGTGG－3’

反應(yīng)體系：

ddH2O 11.5μL－XμL

10×Taq Master Mix 12.5μL

Forward primer 0.5μL

Reverse primer 0.5μL

RT products XμL

Total volume 25μL

反應(yīng)條件：

預(yù)變性 94℃ 3 min

分別于第30、33、36、39個循環(huán)時取出5μL。

1.3 大麻不同品種、不同組織間CsTHC A的熒光定量PCR

提取正常生育條件下各品種（火麻一號和五常40）、不同組織材料的RNA（已去除基因組DNA），用微量分光光度計測定總RNA的量，結(jié)果見表1。

表1 不同材料不同組織RNA的濃度（ng／μL）Tab.1 RNA concentration of different tissues in different varieties（ng／μL）

反轉(zhuǎn)錄時 RNA的用量在200 ng／μL以上加 4μL，200～100 ng／μL加6μL，100 ng／μL以下加9μL。利用Rayscript cDNA Synthesis KIT（GENEray，GK8030）逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，并以此為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，熒光定量PCR儀：ABI7900，復(fù)孔重復(fù)3次。

反應(yīng)體系：SYBR Green，Mix（GENEray，GK8020）和引物混合物配置：

Mix 10μL

Primer F＋R 1μL

SYBR Green（16μL）96孔板：

Mix＋引物 8μL

cDNA 8μL

反應(yīng)條件：

預(yù)變性 95℃ 10 min

溶解曲線采集 60℃ 60 s

95℃ 30 s

60℃ 15 s

利用2－ΔΔCt法［12］計算得出CsTHCA相對表達量，再在Excel中作圖分析。使用 Primer Premier 5.0（Premier Biosoft Inc，加拿大）和 Primer3在線工具（http：／／frodo.wi.mit.edu／primer3／）設(shè)計熒光定量PCR中CsTHCA的引物為：

CsTHCA F：5’－TTCCCAACAATGTAGCAAATCC－3’

CsTHCA R：5’－GAAGGAGTGACAATAACGAGTG －3’

內(nèi)參基因18S的引物為：

18S F：5’－CGCTCCTACCGATTGAATGG －3’

18SR：5’－CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC－3’

1.4 薄層色譜法分析大麻不同品種、不同組織間THC積累情況

將正常生育條件下各品種的不同組織材料進行晾干，稱取一定量樣品裝于小玻璃瓶，120℃烘干0.5 h，取出后研碎，然后加入無水乙醇，4℃放置24 h，取出后用點樣器點樣于薄層板上，將點好的薄層板置于展開室中利用展開劑進行展開，然后晾干，用顯色劑浸泡顯色，取出后晾干觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麻不同品種、不同組織間CsTHCA的半定量PCR

2.1.1 總RNA的提取與檢測

用TRizol總RNA提取試劑盒提取的大麻不同組織的總RNA，可看見清晰的28s RNA和18s RNA，亮度、寬度適宜（見圖1）。

圖1 大麻不同組織中RNA提取Fig.1 RNA extraction in different tissues of hemp

2.1.2 大麻不同品種、不同組織間CsTHCA的半定量PCR

通過半定量RT－PCR分析CsTHCA在大麻籽粒、葉片、根、雌花、雄花中的特異性表達，電泳后觀察發(fā)現(xiàn)在第36個循環(huán)之后，mRNA水平較為穩(wěn)定。結(jié)果表明，CsTHCA在大麻不同品種的不同器官均有表達，但表達量表現(xiàn)不同，在籽粒中表達量最低。利用Bio－Rad凝膠成像掃描分析系統(tǒng)，分別計算目的條帶的峰度值（Volume，INT×mm2），以內(nèi)參引物為標準進行校正，以其均數(shù)代表該樣本的表達強度，反應(yīng)目的基因mRNA的表達水平［13］。火麻一號的不同組織CsTHCAmRNA表達量為雄花＞葉片＞根＞雌花＞籽粒；五常40的不同組織CsTHCAmRNA表達量為雌花＞根＞葉片＞雄花＞籽粒；金刀15的不同組織CsTHCAmRNA表達量為葉片＞根＞雌花＞雄花＞籽粒。

圖2 大麻不同組織CsTHCA半定量RT－PCR結(jié)果Fig.2 Gene－specific semi－quantitative RT－PCR in different tissues of hemp

2.2 大麻不同品種、不同組織間CsTHCA的熒光定量PCR

以篩選后的內(nèi)參基因作為衡量標準，通過熒光定量PCR對火麻一號和五常40的莖、葉片、根、雌花、雄花的表達進行分析，能夠在一定程度上反映CsTHCA基因在不同器官中的表達差異。在選擇的2個品種不同組織中CsTHCA均有表達，但表達量不同，在火麻一號的雄花中表達量最高，而在五常40的雌花中表達量最高。CsTHCA在2個品種的莖中表達量最低，但在根中的表達量相對較高。

圖3 大麻CsTHCA qRT－PCR結(jié)果Fig.3 Gene－specific quantitative real－time PCR

2.3 薄層色譜法分析大麻不同品種、不同組織間THC積累情況

本試驗利用薄層色譜法分析不同組織、不同材料間THC積累情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THC在葉片、雌花、雄花、根中含量較高，在籽粒和莖中含量較低，具體含量的多少還需采用液相色譜進一步分析。

圖4 大麻不同組織THC積累情況Fig.4 The accumulation of THC in different tissues of hemp

3 結(jié)論與討論

THC的含量特征是區(qū)分毒品型大麻與工業(yè)大麻品種的唯一標準，THCA合成酶的分離對于大麻的相關(guān)研究具有重要意義［8］。本研究作者已克隆THCA合成酶基因CsTHCA，該基因開放閱讀框全長1638 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼545個氨基酸［14］。大麻植株中THCA合成酶活性有高低之分，進而決定了THC的含量差異［11］。THC的含量在幼苗生長期較低，快速生長期最高，現(xiàn)蕾期達到頂峰，在莖稈及種子成熟期其含量下降［15］。THCA合成酶基因參與THCA的生物合成過程，進而產(chǎn)生大麻植物中的主要精神活性成分THC，所以可利用熒光定量PCR進行THCA合成酶基因的相對定量［16］。半定量RT－PCR技術(shù)的核心即PCR，是一種簡單、快速、特異的RNA定量測定方法，在管家基因電泳帶不變的情況下，來判斷目的基因表達量的增減問題［17］。實時熒光定量PCR是一種高效的生物技術(shù)之一，是在 mRNA水平上對基因表達進行的定量分析，為避免樣品之間和樣品內(nèi)部的差異，必須引入拷貝數(shù)高、穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因?qū)δ繕嘶虻谋磉_量進行校正［18］。因此，本研究通過半定量RT－PCR和熒光定量PCR分析THCA合成酶在大麻不同品種、不同組織間的表達量，并結(jié)合薄層分析法以了解THC在不同組織間的積累情況，進一步確定THC含量與CsTHCAmRNA表達量之間的關(guān)系。本研究利用兩種方法進行表達量分析，結(jié)果顯示，不同品種CsTHCAmRNA表達量存在組織間的不同，CsTHCAmRNA在火麻一號的雄花中表達量最高；在五常40的雌花中表達量最高；在金刀15的葉片中表達量最高。本試驗利用薄層分析法發(fā)現(xiàn)，THC含量在葉片、雌花、雄花、根中含量較高，在籽粒和莖中含量較低，這些發(fā)現(xiàn)與CsTHCAmRNA表達量基本一致。THC含量在大麻開花授粉期的雄花、雌花和植株葉片中含量較高，且THC含量與CsTHCAmRNA表達量之間可能呈正相關(guān)。有研究［19－20］表明，THC在大麻各個部位中的含量也不相同，一般按照苞片、花、葉、細莖和粗莖的順序遞減，THC在雌株的花和葉中含量最高，種子中含量極少，這與本研究結(jié)果相似。另外，UNODC［20］還發(fā)現(xiàn)，根中THC含量極少，這與研究結(jié)果不一致，本研究發(fā)現(xiàn)THC含量在根中相對較高，而且與根中CsTHCAmRNA表達量一致，故還需進一步驗證根中THC含量及CsTHCAmRNA在根中的表達機理。

［1］王殿奎，關(guān)鳳芝.黑龍江省大麻生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策［J］.中國麻業(yè)科學，2005，27（2）：98－101.

［2］吳廣文.黑龍江省大麻發(fā)展問題和建議［J］.中國麻業(yè)科學，2007，29（6）：356－357.

［3］熊和平.麻類作物育種學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2008：297.

［4］Bouloc P，Allegret S，Arnaud L，et al.Hemp：industrial production and uses［M］.CABI，2013.

［5］姜穎.EMS對工業(yè)大麻種子萌發(fā)的影響［J］.中國麻業(yè)科學，2016，38（6）：258－262.

［6］姜穎，韓承偉，李秋芝，等.工業(yè)大麻籽的開發(fā)利用［J］.黑龍江科學，2014，5（2）：6－7.

［7］陳建華，臧鞏固，趙立寧，等.大麻化學成分研究進展與開發(fā)我國大麻資源的探討［J］.中國麻業(yè)科學，2003，25（6）：266－271.

［8］陳璇，楊明，郭鴻彥，等.大麻植物中大麻素成分研究進展［J］.植物學報，2011，46（2）：197－205.

［9］Sirikantaramas S，Taura F，Tanaka Y，et al.Tetrahydrocannabinolic acid synthase，the enzyme controlling marijuana psychoactivity，is secreted into the storage cavity of the glandular trichomes［J］.Plant and Cell Physiology，2005，46（9）：1578－1582.

［10］關(guān)鳳芝.大麻遺傳育種與栽培技術(shù)［M］.哈爾濱：黑龍江人民出版社，2011：25－52.

［11］Kojoma M，Seki H，Yoshida S，et al.DNA polymorphisms in the tetrahydrocannabinolic acid（THCA）synthase gene in“drug－type”and“fiber－type”Cannabis sativaL.［J］.Forensic Science International，2006，159（2－3）：132－140.

［12］Pfaffl，M.W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic.Acids.Res.，2001，29（900）：2002－2007.

［13］阮艷，蹇銳，程小星，等.Bmi－1調(diào)節(jié)干性相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的初步分析［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2009，31（9）：768－771.

［14］姜穎，潘冬梅，李秋芝，等.大麻THCA合成酶基因的克隆及生物信息學分析［J］.山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2017，37（5）：326－329.

［15］陳其本，余立惠，楊明，等.大麻栽培利用及發(fā)展對策［M］.成都：電子科技大學出版社，1993：1－34.

［16］Cascini F，Passerotti S，Martello S.A real－time PCR assay for the relative quantification of the tetrahydrocannabinolic acid（THCA）synthase gene in herbal Cannabis samples［J］.Forensic Science International，2011，10（1－3）：134－138.

［17］姜穎.一個玉米RING蛋白基因克隆和功能分析［D］.哈爾濱：黑龍江大學農(nóng)作物研究院，2010：27.

［18］張?zhí)m，檀鵬輝，滕珂，等.草地早熟禾熒光定量 PCR分析中內(nèi)參基因的篩選［J］.草業(yè)學報，2017，26（3）：75－81.

［19］Flores－Sanchez IJ.Polyketide Synthases inCannabis sativaL.，Chapter III.Polyketide synthase activities and biosynthesis of cannabinoids and flavonoids inCannabis sativaL.plants［M］.Amsterdam：Print Partners Ipskamp BV，2008：58－61.

［20］United Nations Office on Drugs and Crime（UNODC）.Recommended methods for the identification and analysis of Cannabis and Cannabis Products［M］.New York：United Nations Publication，2009：14－16.

Expression Pattern Assay of THCA Synthase Gene in Hem p（Cannabis sativa．L）

JIANG Ying，SUN Yufeng，LI Qiuzhi，PAN Dongmei，HAN Xicai
（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

The expression of THCA synthase genewas analyzed by semi－quantitative RT－PCR and quantitative real－time PCR in different tissues of different hemp varieties.The results showed that differences existed in the expression ofCsTHCAbetween tissues of different varieties.The expression level ofCsTHCAwas the highest in the male flower of Huoma No.1，the female flower of Wuchang 40，and the leaves of Jindao 15.We also found that the expression level in root was relatively high，and the expression level in stem and grain was comparatively low.There was a positive correlation between THC content and the expression ofCsTHCAwith the method of thin－layer chromatography.Result of the study could provide the theoretical guidance for the safety promotion of hemp.

Cannabis sativa L.；THCA synthase gene；semi－quantitative reverse transcription；quantitative real－time PCR；expression pattern assay

S563.3

A

1671－3532（2017）06－0278－06

2017－05－15

黑龍江省青年科學基金（QC2016037）

姜穎（1986－），女，助理研究員，研究方向為作物遺傳育種。E－mail：bazhujiangying＠126.com