白曉潔 吳博威

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001)

抗鈉鈣交換體特異位點(diǎn)抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響①

白曉潔 吳博威

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001)

目的觀察抗鈉鈣交換體(Sodium calcium exchanger，NCX)特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對(duì)正常成年大鼠心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響。方法利用Langendorff灌流方法，分離得到單個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞；負(fù)載熒光染料Fura-2/AM和2%牛血清白蛋白后，利用離子影像分析系統(tǒng)記錄激發(fā)光為340 nm和380 nm時(shí)心室肌細(xì)胞成對(duì)系列圖像，計(jì)算鈣瞬變峰值(F340/F380)、細(xì)胞鈣恢復(fù)90%時(shí)程(TR90)以及鈣敏感性(F340/F380與細(xì)胞縮短數(shù)值的比值)。結(jié)果抗NCX特異位點(diǎn)抗體可以增加正常成年大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞F340/F380，縮短TR90，對(duì)鈣敏感性無(wú)顯著影響；尼卡地平和KB-R7943分別預(yù)處理心室肌細(xì)胞可以抵消大部分抗體對(duì)F340/F380和TR90的增加或縮短效應(yīng)，聯(lián)合使用二者預(yù)處理心室肌細(xì)胞后，該抗體對(duì)鈣瞬變不再有顯著影響。結(jié)論抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體可以增加心室肌細(xì)胞鈣瞬變峰值，同時(shí)縮短細(xì)胞鈣恢復(fù)時(shí)程，這種效應(yīng)主要與其激動(dòng)L-型Ca2+通道和NCX的作用有關(guān)。

Na+-Ca2+交換體；抗體；鈣瞬變；心室肌細(xì)胞；L-型Ca2+通道

胞漿內(nèi)Ca2+是介導(dǎo)心室肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵因子，Ca2+濃度的變化也是觸發(fā)心室肌細(xì)胞收縮和舒張的離子基礎(chǔ)，在心肌變力性的研究中，介導(dǎo)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。鈉鈣交換體(Sodium calcium exchanger，NCX)是心室肌細(xì)胞膜上介導(dǎo)膜內(nèi)外Na+和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的雙向離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。在前期的研究中，我們依據(jù)NCX分子結(jié)構(gòu)中重要的功能片段α-1重復(fù)序列124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145合成人工肽段，對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，獲取高濃度抗體，并對(duì)該抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該抗NCX特異位點(diǎn)抗體具有增強(qiáng)大鼠心室肌細(xì)胞NCX電流的作用，同時(shí)對(duì)L-型Ca2+電流和Na+-K+泵電流也有一定的激動(dòng)效應(yīng)。在離體灌流正常大鼠心臟實(shí)驗(yàn)中該抗體表現(xiàn)出同時(shí)增強(qiáng)心臟收縮和舒張功能的作用[1,2]。為了深入研究該抗體提高心肌變力性的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，我們進(jìn)一步觀察了其對(duì)單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 實(shí)驗(yàn)選用Wistar大鼠，雌雄不限，體重250～300 g(由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。主要試劑包括：KB-R7943(Sigma)，尼卡地平(Nicardipine，Sigma)，純化的抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體[1]，F(xiàn)ura-2/AM(Sigma)，牛血清白蛋白(BSA，Sigma)，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

臺(tái)氏液成分(mmol/L)：NaCl 140、KCl 5.4、NaH2PO30.33、HEPES 5.0、葡萄糖10.0、MgCl21.0、CaCl21.8，用NaOH調(diào)pH值至7.4。

主要儀器設(shè)備：離子影像分析系統(tǒng)(Ion Imaging system，Tillphotonics Inc，德國(guó))；BPS-4灌流裝置(ALA Scientific Instruments Inc，美國(guó))；倒置熒光顯微鏡(Zeiss，德國(guó))；刺激器(Nihon Kohden Inc，日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 采用Langendorff心臟灌流方法，平衡穩(wěn)定后以含有膠原酶P(0.1 g/L)、CaCl2(75 μmol/L)以及?；撬?20 mmol/L)的臺(tái)氏液繼續(xù)灌流10～20 min，用眼科剪剪下心室肌組織，置于高K+Krebs buff(KB)液中輕輕吹打，過150 μm不銹鋼篩網(wǎng)后，室溫保存?zhèn)溆肹1]。

取出保存在KB液內(nèi)的心室肌細(xì)胞，正常臺(tái)氏液(含鈣18 mmol/L)復(fù)鈣，負(fù)載熒光染料Fura-2/AM和2%BSA(37℃孵育40 min)，臺(tái)氏液清洗細(xì)胞后備用。

將細(xì)胞置于灌流槽中，臺(tái)氏液持續(xù)灌流(1～2 ml/min)。灌流槽底部?jī)啥诉B接有細(xì)鉑絲，鉑絲末端與刺激器相連，用10 V電壓以0.5 Hz頻率給予場(chǎng)刺激觸發(fā)細(xì)胞收縮。離子影像分析系統(tǒng)記錄激發(fā)光為340 nm和380 nm時(shí)的成對(duì)系列圖像，并計(jì)算340 nm/380 nm的熒光比值(F340/F380)，即為鈣瞬變峰值。鈣敏感性為F340/F380與細(xì)胞縮短數(shù)值的比值[3]。

2 結(jié)果

2.1抗NCX特異位點(diǎn)抗體可以增強(qiáng)單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變峰值，縮短細(xì)胞鈣恢復(fù)時(shí)程 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAA-FNMF145抗體(40 nmol/L)可以增加單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變峰值(F340/F380)，同時(shí)縮短TR90(time to 90% restore)(P<0.01，圖1、表1)。陰性IgG組與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異。該抗體對(duì)鈣敏感性無(wú)顯著影響，表明其對(duì)心室肌細(xì)胞變力性作用與收縮蛋白鈣敏感性關(guān)系不大。

2.2尼卡地平或KB-R7943預(yù)處理心室肌細(xì)胞可以分別抵消抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變峰值和細(xì)胞鈣恢復(fù)時(shí)程的作用 利用特異性較高的NCX抑制劑KB-R7943和L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平分別預(yù)處理心室肌細(xì)胞后，再次觀察抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變峰值和細(xì)胞鈣恢復(fù)時(shí)程的作用是否發(fā)生變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KB-R7943(10 nmol/L)預(yù)處理心室肌細(xì)胞后，心室肌細(xì)胞F340/F380較未處理前輕微下降，同時(shí)TR90延長(zhǎng)。再加入抗NCX特異位點(diǎn)抗體，心室肌細(xì)胞F340/F380明顯增加(P<0.01)，TR90無(wú)明顯變化(P>0.05，圖2、表2)。

尼卡地平(1 μmol/L)預(yù)處理心室肌細(xì)胞后，心室肌細(xì)胞F340/F380較未處理前顯著下降(P<0.05)，TR90無(wú)明顯變化(P>0.05)。再加入抗NCX特異位點(diǎn)抗體后，F(xiàn)340/F380有增加趨勢(shì)，但不顯著(P>0.05)，TR90顯著下降(P<0.05，圖3、表2)。

2.3聯(lián)合使用KB-R7943和尼卡地平預(yù)處理心室肌細(xì)胞，抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變峰值和細(xì)胞鈣恢復(fù)時(shí)程不再具有顯著影響 聯(lián)合使用KB-R7943(10 nmol/L)和尼卡地平(1 μmol/L)預(yù)處理心室肌細(xì)胞后，F(xiàn)340/F380下降(P<0.01)，TR90延長(zhǎng)(P<0.05)，表明心室肌細(xì)胞的收縮和舒張活動(dòng)都受到一定程度的抑制。再給予抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體，F(xiàn)340/F380和TR90無(wú)顯著變化(P>0.05，圖4、表2)。

圖1 抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響Fig.1 Effect of site specific antibody of NCX on Ca2+ transient in single ventricular myocyte

表1抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響

Tab.1EffectsofsitespecificantibodyofNCXonCa2+transientinsingleventricularmyocyte

GroupsnF340/F380TR90(ms)Ca2+sensitivityControl5188.30±18.88305.56±55.9152.43±9.61NegativeIgG5189.58±14.68305.49±30.5453.08±12.75Antibody5219.54±5.541)198.33±17.791)43.90±4.02

Note：TR90.Time to 90% restore；1)P<0.01 vs control.

圖2 KB-R7943預(yù)處理可以抵消抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞TR90的降低作用Fig.2 KB-R7943 abolished decrement of TR90 induced by site specific antibody of NCX in single ventricu-lar myocyte

表2KB-R7943和/或尼卡地平預(yù)處理后抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響(n)

Tab.2EffectsofsitespecificantibodyofNCXonCa2+transientinsingleventricularmyocytepretreatedwithKB-R7943and/orNicardipine(n)

GroupsF340/F380TR90/msControl188.18±22.63310.25±30.58KB-R7943165.21±22.37337.86±25.98Nicardipine125.33±8.702)312.58±29.15KB-R7943+Nicardipine107.59±16.902)356.73±17.85KB-R7943+antibody205.13±20.821)325.97±48.25Nicardipine+antibody134.05±10.872)247.43±45.211)KB-R7943+Nicardipine+antibody102.76±22.752)343.07±24.36

Note：1)P<0.05 vs control，2)P<0.01 vs control.

圖3 尼卡地平預(yù)處理可以抵消抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞F340/F380的增加作用Fig.3 Nicardipine abolished increment of F340/F380 induced by site specific antibody of NCX in single ventricular myocyte

圖4 KB-R7943和尼卡地平聯(lián)合預(yù)處理心室肌細(xì)胞后抗NCX特異位點(diǎn)抗體對(duì)鈣瞬變不再有顯著影響Fig.4 Site specific antibody of NCX had no significant effect on Ca2+ transient in presence of KB-R7943 and Nicardipine in single ventricular myocyte

3 討論

NCX是心室肌細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Na+、Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，為了能更好地對(duì)其功能進(jìn)行研究，在前期實(shí)驗(yàn)中，我們依據(jù)NCX分子結(jié)構(gòu)中重要的功能片段α-1重復(fù)序列124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145合成人工肽段，免疫大鼠后經(jīng)純化得到相應(yīng)的多克隆抗體。經(jīng)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該抗體對(duì)NCX正向及反向電流均具有激動(dòng)作用，同時(shí)對(duì)L-型Ca2+通道和Na+-K+泵也表現(xiàn)出一定程度的激動(dòng)效應(yīng)，對(duì)其他細(xì)胞膜上的主要離子通道電流無(wú)顯著影響[1]。在離體灌流大鼠心臟實(shí)驗(yàn)中，該抗體表現(xiàn)出同時(shí)增強(qiáng)心臟收縮和舒張功能的作用[2]。為了深入研究其作用的細(xì)胞機(jī)制，我們?cè)趩蝹€(gè)心室肌細(xì)胞水平，利用離子成像系統(tǒng)觀察該抗體對(duì)鈣瞬變峰值F340/F380和細(xì)胞鈣恢復(fù)時(shí)程TR90的影響，同時(shí)利用特異性較高的NCX抑制劑KB-R7943和L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平分別或聯(lián)合預(yù)處理心室肌細(xì)胞，探討激動(dòng)NCX、L-型Ca2+通道以及Na+-K+泵在該抗體增強(qiáng)心臟功能中的作用貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該抗NCX特異位點(diǎn)抗體主要是通過激動(dòng)L-型Ca2+通道和NCX影響心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變峰值以及細(xì)胞鈣衰減速率實(shí)現(xiàn)其對(duì)心室肌細(xì)胞收縮和舒張活動(dòng)的增強(qiáng)作用，激動(dòng)Na+-K+泵的效應(yīng)對(duì)于心室肌細(xì)胞收縮舒張活動(dòng)沒有直接的影響。

NCX在心室肌細(xì)胞膜上存在正向和反向兩種轉(zhuǎn)運(yùn)模式，分別介導(dǎo)3Na+入胞/1Ca2+出胞和3Na+出胞/1Ca2+入胞。生理狀態(tài)下，NCX主要以正向模式為主，介導(dǎo)心室肌細(xì)胞舒張期Ca2+外排，但是也有報(bào)道認(rèn)為在動(dòng)作電位早期，NCX以反向模式介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，參與細(xì)胞內(nèi)“鈣觸發(fā)鈣釋放(Calcium induced calcium release，CICR)”的過程。L-型Ca2+電流是心室肌細(xì)胞平臺(tái)期的主要內(nèi)向電流，由其介導(dǎo)的Ca2+流入是CICR的主要機(jī)制，因此也是心室肌細(xì)胞收縮幅度的決定性因素[4]。Na+-K+泵雖然不直接介導(dǎo)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，但是Na+-K+泵活動(dòng)增強(qiáng)形成的細(xì)胞膜電位超極化以及細(xì)胞外Na+濃度增加，可以間接促進(jìn)NCX的正向模式，抑制其反向模式轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體可以增加單個(gè)心室肌細(xì)胞F340/F380，同時(shí)減小TR90，這些結(jié)果與前期離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)中該抗體同時(shí)增強(qiáng)心臟收縮和舒張的功能相一致[2]。NCX抑制劑KB-R7943預(yù)處理心室肌細(xì)胞可以消除該抗體減小TR90的大部分效應(yīng)，L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平預(yù)處理心室肌細(xì)胞可以消除該抗體增強(qiáng)F340/F380的大部分效應(yīng)，聯(lián)合使用二者預(yù)處理細(xì)胞后該抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的作用幾乎完全消失。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對(duì)心臟收縮舒張的增強(qiáng)作用主要是通過其激動(dòng)L-型Ca2+通道和NCX的作用實(shí)現(xiàn)的，其中增強(qiáng)NCX可以加速其正向模式，促進(jìn)心室肌細(xì)胞舒張時(shí)Ca2+的外排，而激動(dòng)L-型鈣通道主要表現(xiàn)在增強(qiáng)心室肌細(xì)胞收縮時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高的程度，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們的預(yù)期一致。聯(lián)合使用NCX抑制劑KB-R7943和L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平預(yù)處理心室肌細(xì)胞后，抗體對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的作用幾乎完全消失，我們推測(cè)該抗體對(duì)Na+-K+泵的激動(dòng)作用不直接參與其通過改變Ca2+濃度變化的幅度和速度而增強(qiáng)心室肌細(xì)胞收縮舒張功能的效應(yīng)，但是不排除Na+-K+泵活動(dòng)增強(qiáng)可以間接地促進(jìn)NCX的正向模式，進(jìn)而增強(qiáng)心室肌細(xì)胞舒張功能。

通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)該抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對(duì)于心室肌細(xì)胞膜離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體的多靶點(diǎn)激動(dòng)構(gòu)成了一種新的強(qiáng)心模式組合，激動(dòng)L-型Ca2+通道可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮功能，激動(dòng)NCX和Na+-K+泵則促進(jìn)心肌細(xì)胞的舒張功能。在臨床實(shí)踐中，盡管強(qiáng)心藥物在目前心力衰竭的治療地位有所下降，但在某些特定情況下仍然是必不可少的手段，我們會(huì)進(jìn)一步研究這種抗NCX特異位點(diǎn)124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對(duì)于急性、慢性心力衰竭模型的強(qiáng)心效應(yīng)。另外，由于激動(dòng)Na+-K+泵可能會(huì)加重心臟耗能，我們會(huì)聯(lián)合使用改善心肌細(xì)胞能量代謝的藥物[6]，以求達(dá)到更理想的實(shí)驗(yàn)效果，為臨床心力衰竭治療提供新的思路。

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[2] 白曉潔，封啟龍，吳博威.抗鈉鈣交換體特異位點(diǎn)抗體對(duì)離體大鼠心臟和血管活動(dòng)的效應(yīng)及其與哇巴因、(±)Bay K8644作用的比較[J].中國(guó)病理生理雜志，2013，29(10)：1793-1797.

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EffectsofsitespecificantibodyofNa+-Ca2+exchangeroncalciumtransientinsingleventricularmyocytesofrats

BAIXiao-Jie,WUBo-Wei.

DepartmentofPhysiology,ShanxiKeyLaboratoryofCellularPhysiology，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001,China

Objective:To investigate the effects of site specific(124HNFTAGDLGP STIVGSAAFNMF145)antibody of Sodium calcium exchanger(NCX) on calcium transient in single ventricular myocytes of normal adult rats.MethodsIsolated adult rat hearts were perfused using Langendorff method and single ventricular myocytes were then obtained.The ventricular myocytes were incubated with Fuar-2/AM and 2% bovine serum albumin for about 40 min and then,the fluorescence images were recorded when excitation wavelengths were 340 nm and 380 nm using ion imaging system.Fluorescence value F340/F380,length of cell shortening,time to 90% restore(TR90)and calcium sensitivity(ratio of F340/F380 and cell shortening) were calculated.ResultsThe site specific antibody of NCX increased F340/F380 and decreased TR90in single ventricular myocytes,but had no more significant effect on calcium sensitivity.Pretreatment with KB-R7943 or Nicardipine could significantly inhibit the TR90decrease or F340/F380 increase induced by the antibody.Pretreating ventricular myocytes with combination of KB-R7943 and Nicardipine,the antibody had no more significant effects on calcium transient.ConclusionSite specific (124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145)antibody of NCX could increase calcium transient and accelerate the decrease of intracellular calcium during diastole,which mainly related to its effects of activating L-type Ca2+channel and NCX.

Na+-Ca2+exchanger;Antibody;Calcium transient;Ventricular myocyte;L-type Ca2+channel

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.008

R331.3

A

1000-484X(2017)12-1795-04

白曉潔(1973年-)，女，博士，副教授，主要從事循環(huán)生理學(xué)方面研究，E-mail：baixiaojie_1973@163.com。

[收稿2017-07-04]

(編輯 倪 鵬)