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(新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

鏈格孢侵染對厚皮甜瓜抗菌物質及活性氧代謝相關酶活性的影響

李夢,白羽嘉,王玉紅,張明明,瑪爾哈巴·帕爾哈提,張露云，馮作山*

(新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

以伽師瓜為材料,研究貯藏期間果皮與果肉對病原菌抵抗能力的差異。分別采用3 mm(果皮)、5 mm(果皮果肉交界)、10 mm(果肉)深度接種鏈格孢(Alternariaalternata)后,于7 ℃貯藏。定期檢測果皮與果肉病斑直徑、總酚和黃酮含量及多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性。結果表明:貯藏期間,不同接種深度的果皮病斑直徑顯著小于果肉(p<0.05),果皮的抗病能力大于果肉;3、5、10 mm接種組果皮與果肉的抗菌物質含量和活性氧代謝相關酶活性顯著高于對照(p<0.05),其中3 mm接種組果實具有較高的抗性;甜瓜果皮與果肉協(xié)同抵御鏈格孢的侵染,果皮發(fā)揮更大的抗病作用。

厚皮甜瓜,鏈格孢,抗菌物質,活性氧代謝相關酶

厚皮甜瓜(CucumismeloL.)屬葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(CucumicLinn.)植物[1]。由于甜瓜采收期正值夏季高溫,采后極易遭受病原菌侵染[2]。鏈格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病是甜瓜儲藏期間危害性最大的病害[3-4]。伽師瓜屬晚熟厚皮甜瓜,是新疆最耐儲運的甜瓜品種[5-6]。

果皮是果實抵御病原菌侵染的第一道防線[7],甜瓜果皮與果肉在結構、組織上有很大的區(qū)別。甜瓜果皮組織致密,富含果膠、纖維素和木質素等物質;果肉細脆或松軟,富含糖類、蛋白質、VC等營養(yǎng)物質。研究發(fā)現鏈格孢侵染甜瓜0～13 d,果實未出現明顯病斑,但在侵染中后期,病斑迅速擴大[8]。推測侵染前期果皮有效阻止了病原菌的侵染;中后期,病原菌突破果皮的防線,果肉抵御能力較弱,病原菌在果肉中迅速繁殖,病斑直徑迅速擴大。

本研究為探索甜瓜果皮與果肉抵御病原菌侵染能力的差異,甜瓜果實不同深度接種鏈格孢,測量貯藏期間果皮與果肉病斑大小,分析抗菌物質含量及活性氧代謝相關酶活性的變化規(guī)律,比較果皮與果肉抵抗病原菌侵染能力的差異,了解甜瓜抗病性反應,為甜瓜采后病害的控制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晚熟厚皮甜瓜品種“伽師瓜”,選取可溶性固形物≥14%,單果重3.5±0.5 kg,無病蟲害、無機械損傷的果實,于2016年7月采摘于新疆喀什地區(qū)伽師縣。鏈格孢(Alternariaalternata)由新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供,分離自伽師瓜自然發(fā)病的果實,PDA保存待用。冰醋酸、無水醋酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、鄰苯二酚、Triton X-100、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二硫蘇糖醇(DTT)、甲硫氨酸、氮藍四唑(NBT)、EDTA-Na2、核黃素等 均為分析純(AR),購自天津市光復精細化工研究所。

FA2104N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;NBCJ-B型無菌操作臺、MHP-250型恒溫培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;TGL-16G型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用公司;FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;XSP-2C型顯微鏡 上海蔡康光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜瓜鏈格孢侵染 鏈格孢接種PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)7 d,收集孢子。用含有0.01% Tween-80的無菌水配制濃度為1×106個/mL孢子懸浮液。甜瓜用2%過氧化氫消毒,清水洗凈后晾干,7 ℃預冷。在甜瓜果實赤道等距刺孔6個(直徑3.5 mm),深度分別為3、5及10 mm,接種20 μL的孢子懸浮液,其中3 mm深度接種到甜瓜果皮組織,5 mm深度接種到甜瓜果皮與果肉交界處,10 mm深度接種到甜瓜果肉組織,對照組為3種深度接入等量的無菌水。接種后,置于7 ℃、相對濕度85%～90%的冷庫貯藏。分別于處理后每隔4 d取甜瓜病斑周圍5 mm處的組織,液氮速凍,-80 ℃保存。

1.2.2 病斑直徑的測量 在接種鏈格孢部位將甜瓜果實縱向剖開,測定果實過敏反應組織,每次測定6個瓜,計算平均值,即為病斑直徑。

1.2.3 黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[9]。

1.2.4 總酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[10]。

1.2.5 多酚氧化酶(PPO)活性的測定 參照曹健康[11]方法,以每克鮮重果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個活性單位(U),計算公式為:

1.2.6 過氧化物酶(POD)活性的測定 參照曹健康[11]方法,以每克鮮重樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個活性單位(U),計算公式為:

1.2.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 參照曹健康[11]方法,以每分鐘每克鮮重組織的反應體系對氮藍四唑(NBT)光化還原的抑制為50%時為一個SOD活性單位(U),計算公式為:

1.2.8 過氧化氫酶(CAT)活性的測定 參照Ren等[12]方法,以每克鮮重組織每分鐘OD值變化0.01為1 U,用U·g-1FW表示。

1.3 數據分析與作圖

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析,利用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鏈格孢侵染甜瓜病斑直徑的變化

甜瓜接種鏈格孢后,每4 d測定甜瓜病斑大小(圖1)。鏈格孢侵染甜瓜第12 d時,果皮與果肉出現病斑直徑,并隨貯藏時間延長均呈不斷增大的趨勢,果肉的病斑直徑大于果皮,差異顯著(p<0.05)。侵染第40 d時,3、5、10 mm接種果皮的病斑直徑分別是對應果肉的1.15、1.18、1.25倍;侵染期間,10 mm接種果皮與果肉病斑直徑大于3 mm和5 mm接種處理(p<0.05);3 mm接種果皮與果肉病斑直徑較小,且3 mm接種果皮病斑直徑最小。結果表明:果皮對鏈格孢侵染的抵抗能力大于果肉,果皮是抵御鏈格孢侵染的第一道防線。

圖1 鏈格孢侵染甜瓜病斑直徑的變化Fig.1 Change of A.alternata infection on lesion diameterin of muskmelon

2.2 鏈格孢侵染對甜瓜抗菌物質含量的影響

2.2.1 鏈格孢侵染對甜瓜黃酮含量的影響 甜瓜接種鏈格孢,在貯藏期間果皮與果肉黃酮含量隨貯藏時間的延長均呈先升高后下降的變化趨勢,且3種接種組的黃酮含量均高于相對應的對照組,差異顯著(p<0.05)。甜瓜接種鏈格孢第24 d時,3 mm接種果皮與果肉的黃酮含量大于5 mm和10 mm接種處理(p<0.05);3種不同深度接種果皮和果肉的黃酮含量均達到峰值,其中3 mm接種果皮的黃酮含量比10 mm高33.80%(p<0.01)(圖2A);3 mm接種果肉的黃酮含量比10 mm 高28.16%(p<0.01)(圖2B)。在貯藏期間,3種接種組的果皮黃酮含量均高于同時段的果肉,差異極顯著(p<0.01)。

圖2 鏈格孢侵染對甜瓜果皮(A)與果肉(B)黃酮含量的影響Fig.2 Effects of A. alternata infection on flavonoids content in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.2.2 鏈格孢侵染對甜瓜總酚含量的影響 甜瓜接種鏈格孢,在貯藏期間果皮與果肉總酚含量隨貯藏時間延長均呈先升高后下降的變化趨勢,且3種接種組的總酚含量均高于相對應的對照組,差異顯著(p<0.05)。甜瓜接種鏈格孢第28 d,3種深度接種果皮的總酚含量達到峰值,3 mm接種果皮的總酚含量大于5 mm和10 mm接種處理,3 mm接種高于10 mm 11.63%(p<0.05)(圖3A);甜瓜接種鏈格孢第24 d,3種深度接種果肉的總酚含量達到峰值,各處理間總酚含量差異不顯著(p>0.05)(圖3B)。在貯藏期間,3種接種組果皮的總酚含量均高于同時段的果肉,差異極顯著(p<0.01)。

圖3 鏈格孢侵染對甜瓜果皮(A)與果肉(B)總酚含量的影響Fig.3 Effects of A. alternata infection on total phenolic content in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3 鏈格孢侵染對甜瓜活性氧代謝相關酶活性的影響

2.3.1 鏈格孢侵染對甜瓜PPO活性的影響 甜瓜接種鏈格孢,在貯藏期間果皮與果肉PPO活性隨貯藏時間延長均呈先升高后下降的變化趨勢,且3種接種組的PPO活性均高于對照組,差異顯著(p<0.05)。甜瓜接種鏈格孢,3種深度接種果皮的PPO活性先升高達到峰值后急劇下降最終趨于平緩。第12 d,5 mm接種果皮的PPO活性達到峰值;第16 d,3 mm和10 mm接種果皮活性達到峰值,3 mm接種果皮活性高于10 mm 11.11%(p<0.05)(圖4A);甜瓜接種鏈格孢第12 d,3 mm和5 mm接種果肉的PPO活性達到峰值;第16 d,10 mm接種果肉活性達到峰值,3 mm接種果肉活性高于5 mm 21.43%(p<0.05)(圖4B)。3種接種組果皮的PPO活性峰值均高于果肉,差異顯著(p<0.05)。

圖4 鏈格孢侵染對甜瓜果皮(A)與果肉(B)PPO活性的影響Fig.4 Effects of A. alternata infection on PPO activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3.2 鏈格孢侵染對甜瓜POD活性的影響 甜瓜接種鏈格孢,在貯藏期間果皮與果肉POD活性隨貯藏時間延長均呈先波動升高后下降的變化趨勢,且3種接種組的POD活性均高于對照組,差異顯著(p<0.05)。甜瓜接種鏈格孢第28 d,10 mm接種果皮的POD活性達到峰值;第32 d,3 mm和5 mm接種果皮活性達到峰值,3 mm接種果皮活性高于10 mm 22.17%(p<0.05)(圖5A);甜瓜接種鏈格孢第24 d,3種接種果肉的POD活性均達到峰值,3 mm接種果肉活性高于10 mm 14.63%(p<0.05)(圖5B)。貯藏期間,3種接種組果皮的POD活性均高于果肉,差異極顯著(p<0.01)。

圖5 鏈格孢侵染對甜瓜果皮(A)與果肉(B)POD活性的影響Fig.5 Effects of A.alternata infection on POD activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3.3 鏈格孢侵染對甜瓜SOD活性的影響 甜瓜接種鏈格孢,在貯藏期間果皮與果肉SOD活性隨貯藏時間延長均呈先升高后下降的變化趨勢,且3種深度接種果實的SOD活性均高于對照組,差異顯著(p<0.05)。甜瓜接種鏈格孢第28 d,3種深度接種果皮的SOD活性均達到峰值,其中3 mm接種活性高于10 mm 22.10%(p<0.05)(圖6A);甜瓜接種鏈格孢,果肉的SOD活性在接種中后期變化平緩。第32 d,3種深度接種果肉的SOD活性達到峰值,3 mm接種果肉活性最大(圖6B)。貯藏期間,3種接種組果皮的SOD活性均高于果肉,差異極顯著(p<0.01)。

圖6 鏈格孢侵染對甜瓜果皮(A)與果肉(B)SOD活性的影響Fig.6 Effects of A.alternata infection on SOD activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3.4 鏈格孢侵染對甜瓜CAT活性的影響 甜瓜接種鏈格孢,在貯藏期間果皮與果肉的CAT活性隨貯藏時間延長均呈先升高后下降的變化趨勢,且3種接種組的CAT活性均高于對照組,差異顯著(p<0.05)。甜瓜接種鏈格孢第28 d,10 mm接種果皮的CAT活性達到峰值;第32 d,3 mm和5 mm接種果皮的CAT活性達到峰值,3 mm接種活性高于5 mm 14.15%(p<0.05)(圖7A);甜瓜接種鏈格孢第16 d,3種接種果肉的CAT活性達到峰值,3 mm接種果肉活性高于10 mm 16.29%(p<0.05)(圖7B)。3種接種組果皮的CAT活性峰值均高于果肉,差異顯著(p<0.05)。

圖7 鏈格孢侵染對甜瓜果皮(A)與果肉(B)CAT活性的影響Fig.7 Effects of A.alternata infection on CAT activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

3 討論

植物在抗病過程中,常伴有生理生化的變化[13-14],如小分子抗菌物質黃酮、總酚和活性氧代謝相關酶PPO、POD、SOD、CAT等的變化[15]。類黃酮可以抑制真菌孢子的萌發(fā)和生長[16],同時是重要的植保素,抑制病斑擴大及病原物在未侵染細胞中的擴增,其產生速度和積累的量直接反映植物抗病性的強弱[17]。

酚類是植物重要的抗菌性物質,在PPO作用下氧化成對病原菌高毒性的醌類物質,直接抑制侵染寄主的病原物生長[18-20]。同時,酚類物質還參與果皮中木質素的形成;且與纖維素共同作用增強果實的果皮結構,從而提高其抗病性[21-22]。

活性氧(ROS)是細胞信號傳導和調控的重要組成部分[23-25]。植物被病原菌侵染后會產生活性氧爆發(fā),直接殺死病原微生物,促進細胞壁木質化等[26],增強抗病性。但高濃度活性氧也會對自身產生傷害,因而植物體內普遍存在著活性氧清除酶。SOD、PPO、POD和CAT就是清除活性氧的主要酶[27-30],控制活性氧的合成、積累和消除,維持活性氧代謝平衡。而抗氧化酶活性的升降表明植物盡其所能地抑制病原物的侵入和繁殖,又可使活性氧對其自身的危害降至最低[31]。

本研究中,對甜瓜進行3、5、10 mm穿刺深度接種鏈格孢處理,3種深度接種處理組的果皮與果肉均在鏈格孢侵染第12 d出現病斑,12～40 d病斑直徑不斷擴大,果肉的病斑直徑大于果皮;其中3 mm接種果實的病斑直徑最小,10 mm最大,5 mm介于中間。3種接種組的甜瓜在鏈格孢侵染期間,果皮與果肉的總酚、黃酮含量及PPO、POD、SOD、CAT活性均呈現先升高后下降的變化趨勢,并顯著高于對照組,說明總酚、黃酮及活性氧代謝相關酶在鏈格孢侵染甜瓜后積極地發(fā)揮抗性作用。3 mm接種果實的抗菌物質含量與活性氧代謝相關酶活性在鏈格孢侵染期間均整體大于5 mm和10 mm接種組,10 mm接種組的抗菌物質含量與酶活性較小,這與3 mm接種果實的病斑直徑最小一致。說明鏈格孢侵染甜瓜期間,果皮發(fā)揮了關鍵抵御作用,果肉協(xié)同果皮積極地抵御鏈格孢的侵染。

4 結論

對甜瓜采用3、5、10 mm不同深度接種鏈格孢處理后,3 mm接種果實的病斑直徑最小,果肉的病斑直徑顯著大于果皮。甜瓜果皮與果肉通過增高抗菌物質黃酮與總酚含量及活性氧代謝相關酶活性來抵御鏈格孢的侵染,果皮的抗菌物質含量與活性氧代謝相關酶活性顯著高于果肉。果皮和果肉均發(fā)揮抵御病原菌的作用,但是果皮發(fā)揮更大的作用。

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EffectsofAlternariaalternatainfectiononantimicrobialsubstancesandactivitiesofenzymesrelatedtoreactiveoxygenmetabolisminMuskmelon

LIMeng,BAIYu-jia,WANGYu-hong,ZHANGMing-ming,MaerhabaPaerhati,ZHANGLu-yun,FENGZuo-shan*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,china)

Take Jiashi Melon as the experimental materials,this study was aimed to study the resistance difference of pericarp and sarcocarp to pathogenic bacteria during storage.muskmelon was inoculated withA.alternataat different depths were 3 mm(pericarp),5 mm(pericarp and sarcocarp at the junction)and 10 mm(sarcocarp),and stored at 7 ℃ cold storage.Regular inspection of the Lesion diameter of pericarp and sarcocarp,the contents of total phenols and flavonoids in antibacterial substances,and the activities of polyphenol oxidase(PPO),peroxidase(POD),superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)activity. The results revealed that pericarp lesion diameter was significantly smaller than the sarcocarp(p<0.05)during the storage. The disease resistance of pericarp is greater than sarcocarp. The contents of antibacterial substances and reactive oxygen metabolism related enzymes in the 3,5 and 10 mm inoculated groups were significantly higher than those in the control group(p<0.05),the fruit of 3 mm inoculation group had higher resistance to disease,pericarp and sarcocarp cooperate to resist the infection ofAlternariaalternata,pericarp exerts a greater resistance to disease.

muskmelon;Alternariaalternata;antibacterial substances;activity of enzymes related to reactive oxygen metabolism

2017-06-20

李夢(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工原理與技術，E-mail：limeng19920824@126.com。

*通訊作者:馮作山(1963-)，男，博士，教授，研究方向：農產品貯藏與加工，E-mail：fengzuoshan@126.com。

國家自然科學基金項目(31460413)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)23-0245-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.045