蔡 鑫，鄧 燈，王 穎，王文琪

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 合作社學(xué)院，山東 青島 266109 )

三疣梭子蟹多克隆抗體與4種經(jīng)濟(jì)蟹類血細(xì)胞交叉反應(yīng)的研究

蔡 鑫1，鄧 燈2，王 穎1，王文琪1

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 合作社學(xué)院，山東 青島 266109 )

采用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)3種方法對(duì)鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多克隆抗體與黃道蟹、日本蟳、中華絨螯蟹、勘察加帝王蟹血細(xì)胞的免疫交叉反應(yīng)進(jìn)行分析。激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果表明，該抗體與黃道蟹、日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細(xì)胞均發(fā)生了免疫交叉反應(yīng)，且發(fā)生反應(yīng)的抗原決定簇均位于細(xì)胞膜上；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定該抗體與黃道蟹顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞交叉反應(yīng)陽(yáng)性率最高，分別為99.45%、98%，與中華絨螯蟹顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞交叉反應(yīng)陽(yáng)性率最低，陽(yáng)性率分別為81.34%、78.56%；免疫印跡結(jié)果顯示該抗體與日本蟳血細(xì)胞結(jié)合的蛋白分子量是80、38.5 ku；與勘察加帝王蟹血細(xì)胞結(jié)合的蛋白分子量是80、93 ku；與中華絨螯蟹血細(xì)胞結(jié)合的蛋白分子量是82、41、30 ku；與黃道蟹血細(xì)胞結(jié)合的蛋白分子量是70、43 ku。

三疣梭子蟹;多克隆抗體;交叉反應(yīng)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、黃道蟹(Cancermagister)、日本蟳(Charybdisjaponica)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、勘察加帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)均屬于甲殼類，因味道鮮美而深受大眾喜愛[1-2]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]，但近年來(lái)隨著工廠集約化養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，各種疾病大規(guī)模爆發(fā)[4]。由于甲殼類動(dòng)物缺乏適應(yīng)性免疫，主要依靠非特異性免疫抵抗病原體，而參與非特異性免疫的細(xì)胞主要為血細(xì)胞，可通過(guò)吞噬、包埋、傷口修復(fù)、聚集、增生等方式消滅入侵的病原體[5-7]。目前甲殼類血細(xì)胞分類尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其分類存在爭(zhēng)議，多數(shù)學(xué)者根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及多種染色法，將甲殼類血細(xì)胞分為3類，即透明血細(xì)胞、半顆粒血細(xì)胞和顆粒血細(xì)胞[8-9]。由于流式細(xì)胞術(shù)可精確判斷血細(xì)胞大小及顆粒度，目前采用該技術(shù)對(duì)甲殼類動(dòng)物血細(xì)胞分類的研究逐漸增多[9-12]。交叉反應(yīng)是指不同抗原分子上有相同或相似的抗原決定簇，一種抗體可以與兩種或兩種以上的抗原發(fā)生反應(yīng)，其本質(zhì)是抗原決定簇與抗體的特異性結(jié)合[13-14]。多克隆抗體因具有易獲得、穩(wěn)定性好、效價(jià)高等優(yōu)點(diǎn)，成為疾病診斷、疫苗研制等研究領(lǐng)域的重要工具[15-17]。目前已有學(xué)者利用抗體研究甲殼類血細(xì)胞間的交叉反應(yīng)[18-20]，但是利用多克隆抗體分析日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹和黃道蟹血細(xì)胞之間的免疫交叉反應(yīng)未見報(bào)道，筆者在制備鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多克隆抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、免疫印跡技術(shù)分析了該抗體與4種蟹類血細(xì)胞的免疫交叉反應(yīng)情況，并利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量免疫交叉反應(yīng)的比率，以期為蟹類血細(xì)胞分類研究進(jìn)一步積累資料，提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三疣梭子蟹、黃道蟹、日本蟳、中華絨螯蟹、勘察加帝王蟹均購(gòu)自青島水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；Wistar大鼠購(gòu)于青島動(dòng)物檢疫監(jiān)督所。

異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗大鼠IgG、堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗大鼠IgG，均購(gòu)自Sigma公司；5-溴-4-氯-3-吲哚—磷酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)、硝化纖維膜均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份公司。

1.2 方法

1.2.1 血細(xì)胞制備

購(gòu)買健康無(wú)病、肢體健全的5種蟹在條件控制為充氧24 h、20 ℃的水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)2 d，用無(wú)菌注射器從游泳足基部軟膜抽取血淋巴，置于4 ℃預(yù)冷的抗凝劑[21](450 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L HEPES，pH 7.3)，以1∶1比例混合。4 ℃，1000 r/min離心5 min，去上清液，用磷酸鹽緩沖液重懸血細(xì)胞，重復(fù)3次，調(diào)整血細(xì)胞密度至107個(gè)/mL備用。

1.2.2 三疣梭子蟹多克隆抗體制備及純化

采用文獻(xiàn)[22]描述的方法進(jìn)行免疫，取1 mL三疣梭子蟹血細(xì)胞懸液腹腔免疫大鼠，兩周后進(jìn)行二次免疫，以后每隔一周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，第四次免疫結(jié)束后3 d，心臟取血，4 ℃自然沉降12 h，2000 r/min離心10 min，取上層血清。采用辛酸—硫酸銨法對(duì)血清進(jìn)行純化，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察交叉反應(yīng)

調(diào)整血細(xì)胞密度為107個(gè)/mL，20 μL滴片，室溫自然沉降5 h后用含0.5% Triton的磷酸鹽緩沖液浸洗10 min，而后磷酸鹽緩沖液洗5 min；10%山羊血清的磷酸鹽緩沖液，室溫封閉45 min；滴加鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗50 μL(1∶256)，37 ℃濕盒中孵育1 h，然后用含0.05% Tween20的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；加50 μL(1∶3000)異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗大鼠IgG，37 ℃濕盒孵育1 h，而后磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色5 min，滴加防淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，并用Image Pro Plus分析熒光強(qiáng)度。

1.2.4 免疫印跡技術(shù)分析抗原決定簇分子量

取10 μL制備好的血細(xì)胞與5 μL示蹤染料混合，100 ℃水浴5 min后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，5%濃縮膠恒流30 mA，12%分離膠60 mA，示蹤染料到達(dá)最底端時(shí)結(jié)束電泳；一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250染液染色，染色結(jié)束后進(jìn)行脫色并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照；同時(shí)制備的另一塊膠與硝化纖維膜進(jìn)行“三明治”電轉(zhuǎn)膜，4 ℃ 200 mA恒流，轉(zhuǎn)移5 h。結(jié)束后將硝化纖維膜置于含3%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液中37 ℃封閉1 h；加鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多克隆抗體 37 ℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；加堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗大鼠IgG，37 ℃濕盒中孵育1 h，結(jié)束后磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min。5-溴-4-氯-3-吲哚—磷酸—氯化硝基四氮唑藍(lán)底物發(fā)色15 min，加終止液終止反應(yīng)，拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定交叉反應(yīng)陽(yáng)性率

取200 μL制備好的血細(xì)胞加鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多克隆抗體37 ℃振蕩孵育1 h，1500 r/min離心5 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，重復(fù)3次。加異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗大鼠IgG，37 ℃振蕩孵育1 h(陰性對(duì)照只加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗大鼠IgG孵育)，1500 r/min離心5 min，去上清液，而后磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，重復(fù)3次，調(diào)整細(xì)胞密度至107個(gè)/mL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以前向角散射為橫坐標(biāo)，側(cè)向角散射為縱坐標(biāo)，生成等高圖，并根據(jù)細(xì)胞群聚集程度強(qiáng)弱對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行分類，Win MDI 2.9軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察交叉反應(yīng)結(jié)果

結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有無(wú)顆粒，將日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹、黃道蟹血細(xì)胞分為兩大類，即顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞(圖1a3～d3)。細(xì)胞經(jīng)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色后細(xì)胞核為藍(lán)色(圖1a～d)，鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與4種蟹子血細(xì)胞均發(fā)生交叉反應(yīng)(圖1a1～d1)，點(diǎn)狀熒光信號(hào)在血細(xì)胞細(xì)胞膜上呈環(huán)狀密集分布，其中該抗體與黃道蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)烈(圖1d2)，熒光強(qiáng)度整體處于最高水平(圖1d4)；與日本蟳和勘察加帝王蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)比較強(qiáng)烈(圖1a2,b2)，熒光強(qiáng)度整體處于相對(duì)較高水平(圖1a4,b4)；與中華絨螯蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)最弱(圖1c2)，熒光強(qiáng)度整體較低(圖1c4)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多克隆抗體與4種蟹血細(xì)胞的免疫交叉反應(yīng)(1)a～d 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚通道；a1～d1 異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗大鼠IgG通道；a2～d2 合并通道；a3～d3 光鏡、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚、異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗大鼠IgG通道；a4～d4 熒光強(qiáng)度.(2)a～a3 日本蟳血細(xì)胞；b～b3 勘察加帝王蟹血細(xì)胞；c～c3 中華絨螯蟹血細(xì)胞；d～d3 黃道蟹血細(xì)胞.

2.2 免疫印跡分析抗原決定簇分子量結(jié)果

電泳圖譜中，4種蟹血細(xì)胞蛋白條帶豐富。免疫印跡結(jié)果顯示鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與日本蟳血細(xì)胞交叉反應(yīng)的蛋白條帶有2條，其分子量分別為80、38.5 ku；與勘察加帝王蟹交叉反應(yīng)的蛋白條帶有2條，其分子量分別為90、80 ku；與中華絨螯蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)的蛋白條帶有3條，其分子量分別為82、41、30 ku；與黃道蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)的蛋白條帶有2條，分別為70、43 ku(圖2)。

圖2 電泳圖譜(a)和免疫印跡(b)分析交叉反應(yīng)結(jié)果十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中各條帶分別為M marker、A 日本蟳、B帝王蟹、C中華絨螯蟹、D黃道蟹.免疫印跡中各條帶分別為M marker、a 日本蟳、b帝王蟹、c中華絨螯蟹、d黃道蟹.

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率結(jié)果

根據(jù)前向角散射和側(cè)向角散射流式等高圖，將日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細(xì)胞分為兩類，即透明血細(xì)胞(紅色環(huán)形標(biāo)記)和顆粒血細(xì)胞(深藍(lán)色環(huán)形標(biāo)記)(圖3a～c)；將黃道蟹血細(xì)胞分為透明血細(xì)胞(紅色環(huán)形標(biāo)記)，顆粒血細(xì)胞(深藍(lán)色環(huán)形標(biāo)記)和半顆粒血細(xì)胞(青色環(huán)形標(biāo)記)，3類(圖3d)。

圖4熒光直方圖中黑線為陰性對(duì)照，藍(lán)線為發(fā)生交叉反應(yīng)的4種蟹顆粒血細(xì)胞，紅線為發(fā)生交叉反應(yīng)的4種蟹透明血細(xì)胞，青色線則為黃道蟹半顆粒血細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與黃道蟹發(fā)生交叉反應(yīng)的陽(yáng)性率最高，發(fā)生交叉反應(yīng)的顆粒血細(xì)胞占總顆粒血細(xì)胞的99.45%、發(fā)生反應(yīng)的透明血細(xì)胞占總透明血細(xì)胞的98%(圖4d1, d)；鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與中華絨螯蟹發(fā)生交叉反應(yīng)的陽(yáng)性率最低，其中發(fā)生交叉反應(yīng)的顆粒血細(xì)胞占總顆粒血細(xì)胞的81.34%、發(fā)生交叉反應(yīng)的透明血細(xì)胞占總透明血細(xì)胞的78.56%(圖4c1, c)。另外，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果可知該抗體與4種蟹血細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)時(shí)顆粒血細(xì)胞的陽(yáng)性率均高于透明血細(xì)胞(表1)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4種蟹血細(xì)胞等高圖 a 日本蟳、b 勘察加帝王蟹、c 中華絨螯蟹、d 黃道蟹.H為透明血細(xì)胞；SG為半顆粒血細(xì)胞；G為顆粒血細(xì)胞,下同.

圖4 鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與4種蟹血細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)的熒光直方圖鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與透明血細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)陽(yáng)性率：a 日本蟳、b 勘察加帝王蟹、c 中華絨螯蟹、d 黃道蟹.鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與顆粒血細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)陽(yáng)性率：a1 日本蟳、b1 勘察加帝王蟹、c1 中華絨螯蟹、d1 黃道蟹.鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與半顆粒細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)陽(yáng)性率：d2黃道蟹.N代表陰性，為黑色線；紅線為與鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗發(fā)生陽(yáng)性交叉反應(yīng)的透明血細(xì)胞；藍(lán)色線為與鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗發(fā)生陽(yáng)性交叉反應(yīng)的顆粒血細(xì)胞.

表1 鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與4種蟹的細(xì)胞亞群交叉反應(yīng)陽(yáng)性率 %

3 討 論

利用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與4種蟹類血細(xì)胞的交叉反應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)4種蟹類血細(xì)胞的細(xì)胞膜上均有陽(yáng)性信號(hào)，激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)能精確地、高靈敏度地探測(cè)細(xì)胞熒光，通過(guò)激光斷層掃描，可以反映出從亞細(xì)胞器到離子水平的形態(tài)學(xué)方面結(jié)構(gòu)、同時(shí)借助其良好的橫向和縱向分辨率，使樣本的二維圖像非常清晰[23-24]，本試驗(yàn)采用該技術(shù)對(duì)鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗特異性結(jié)合的抗原決定簇進(jìn)行了準(zhǔn)確的定性和細(xì)胞定位分析。隨后采用了免疫印跡技術(shù)尋找含有共同抗原決定簇的血細(xì)胞蛋白的分子量，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的優(yōu)點(diǎn)[17]，采用該方法確定了4種蟹類血細(xì)胞與鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗發(fā)生特異性結(jié)合的血細(xì)胞蛋白多肽的分子量。在此基礎(chǔ)上為進(jìn)一步明確發(fā)生交叉反應(yīng)的血細(xì)胞種類及比率，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)4種蟹類血細(xì)胞進(jìn)行分類并檢測(cè)交叉反應(yīng)比例，流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)細(xì)胞大小及內(nèi)部顆粒，在單細(xì)胞水平上短時(shí)間內(nèi)對(duì)群體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析，同時(shí)在分類收集某一亞群細(xì)胞時(shí)，能避免主觀性因素造成的不確定性，使統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確[25-26]。由流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果可知，日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細(xì)胞分為顆粒血細(xì)胞、透明血細(xì)胞兩類，而黃道蟹血細(xì)胞則分為顆粒血細(xì)胞、半顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞3類，且鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與黃道蟹發(fā)生交叉反應(yīng)的陽(yáng)性率最高，與中華絨螯蟹的陽(yáng)性率最低。

Roulston等[27]利用流式細(xì)胞術(shù)與Percoll離心將蜘蛛蟹(Hyasaraneus)血細(xì)胞分為透明前體血細(xì)胞、透明血細(xì)胞、半顆粒血細(xì)胞及顆粒血細(xì)胞4類；王穎等[21]利用流式細(xì)胞術(shù)將三疣梭子蟹血細(xì)胞分為顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞兩類；Battison等[28]根據(jù)形態(tài)學(xué)將美國(guó)龍蝦(Homarusamericanus)血細(xì)胞分為11類。盡管目前對(duì)甲殼類血細(xì)胞分類標(biāo)準(zhǔn)尚不明確，但兩大類血細(xì)胞已確定，即細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含顆粒的顆粒血細(xì)胞和不含顆粒的透明血細(xì)胞[9]，本文由激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果可將4種蟹血細(xì)胞均分為顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞兩類，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也將日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細(xì)胞分為兩類。Oliver等[10]利用流式細(xì)胞術(shù)將凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)分為顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞兩類；William等[29]將岸蟹(Carcinusmaenas)血細(xì)胞也分為顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞兩類。這些研究結(jié)果與本文結(jié)論類似。但本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)卻將黃道蟹血細(xì)胞分為的顆粒血細(xì)胞、半顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞3類，Denis等[8,11-12]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)將印度淡水蟹(Paratelphusajacquemontii)、藍(lán)蟹(Callinectessapidus)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)血細(xì)胞也分為顆粒血細(xì)胞、半顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞3類。本試驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)與激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)針對(duì)蟹類血細(xì)胞分類得出不同結(jié)果，Xue等[30]指出顯微觀察不利于血淋巴細(xì)胞亞群的定量功能評(píng)估，而流式細(xì)胞術(shù)可以準(zhǔn)確、快速和定量分析血細(xì)胞形態(tài)學(xué)及相關(guān)免疫功能，為研究甲殼類血細(xì)胞提供一種更為準(zhǔn)確的方法。因此本研究以流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果為主。

激光共聚焦掃描顯微鏡、免疫印跡與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與4種蟹血細(xì)胞均發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明三疣梭子蟹血細(xì)胞與該4種蟹血細(xì)胞上存在共同抗原決定簇；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與黃道蟹血細(xì)胞免疫交叉反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)，且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與黃道蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)陽(yáng)性率最高，Kumar等[18]利用抗鋸緣青蟹(Scyllaserrata)血細(xì)胞抗體檢測(cè)其與紫螯青蟹(S.tranquebarica)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、羅氏沼蝦等甲殼類血細(xì)胞交叉反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系近的物種，其交叉反應(yīng)的免疫熒光信號(hào)強(qiáng)；Van de Braak等[19]利用斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞單抗分析斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞與羅氏沼蝦、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)等甲殼類血細(xì)胞交叉反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該抗體與羅氏沼蝦血細(xì)胞具有較高的陽(yáng)性熒光強(qiáng)度，其認(rèn)為是由于該兩種對(duì)蝦親緣關(guān)系較近，抗原決定簇具有更好的保守性。由此推測(cè)三疣梭子蟹血細(xì)胞與黃道蟹血細(xì)胞的抗原決定簇更為接近，即三疣梭子蟹與黃道蟹親緣關(guān)系較其他3種蟹親緣關(guān)系更近。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼠抗三疣梭子蟹血細(xì)胞多抗與4種蟹血細(xì)胞交叉反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)4種蟹的顆粒血細(xì)胞陽(yáng)性率均高于透明血細(xì)胞陽(yáng)性率。Kumar等[18,20-21]應(yīng)用抗體分析甲殼類血細(xì)胞交叉反應(yīng)，也得到同樣的結(jié)果。究其原因?yàn)轭w粒血細(xì)胞相比透明血細(xì)胞，其細(xì)胞中含有較多免疫因子，如酚氧化酶原、細(xì)胞黏附蛋白、抗菌肽等，其分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象更復(fù)雜，免疫原性更強(qiáng)[1,6]，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生更多針對(duì)顆粒血細(xì)胞的抗體。

本研究發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹血細(xì)胞抗體與日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹、黃道蟹均發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明三疣梭子蟹血細(xì)胞與4種蟹血細(xì)胞細(xì)胞膜上存在共同抗原決定簇，從分子水平為蟹類血細(xì)胞發(fā)生與分化的研究提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)對(duì)梳理三疣梭子蟹與4種蟹的親緣關(guān)系有一定參考意義。

[1] S?derh?ll K. Invertebrate Immunity[M].New York: Springer US, 2010:239-259.

[2] Jiang K, Zhang F, Pi Y, et al. Amino acid, fatty acid, and metal compositions in edible parts of three cultured economic crabs:Scyllaparamamosain,Portunustrituberculatus, andEriocheirsinensis[J]. J Aquat Food Prod T, 2014,23(1):73-86.

[3] 洪宇航, 楊筱珍, 張金彪, 等. 中華絨螯蟹血細(xì)胞原代培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2012,47(2):52-58.

[4] 王曉璐. 凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子ALF-AVK基因的克隆及其特性研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué), 2013.

[5] Lv S, Xu J, Zhao J, et al. Classification and phagocytosis of circulating haemocytes in Chinese mitten crab (Eriocheirsinensis)and the effect of extrinsic stimulation on circulating haemocytes in vivo[J]. Fish & Shellfish Immun, 2014,39(2):415-422.

[6] Johansson M W, Keyser P, Sritunyalucksana K, et al. Crustacean haemocytes and haematopoiesis[J]. Aquaculture,2000,191(1):45-52.

[7] Seksan M, Piyachat S, Tanatchaporn U, et al. Characterization of the circulating hemocytes in mud crab (Scyllaolivacea) revealed phenoloxidase activity[J]. Dev Comp Immunol, 2013, 44(1):116-123.

[8] Denis M, Thayappan K, Ramasamy S M, et al. Opsonic function of sialic acid specific lectin in freshwater crabParatelphusajacquemontii[J]. Springer Plus, 2014, 4(1):1-15.

[9] Matozzo V, Marin M G. First cytochemical study of haemocytes from the crabCarcinusaestuarii(Crustacea, Decapoda)[J]. Eur J Histochem, 2010,54(1): 44-49.

[10] Oliver J D,Dusty Loy J,Parikh G, et al. Comparative analysis of hemocyte phagocytosis between six species of arthropods as measured by flow cytometry[J]. J Invertebr Pathol, 2011, 108(2):126-130.

[11] Alvarez J V, Chung J S.The involvement of hemocyte prophenoloxidase in the shell-hardening process of the blue crab,Callinectessapidus[J]. Plos One, 2015,10(9):e0136916.

[12] Du J, Zhu H, Ren Q, et al. Flow cytometry studies on theMacrobrachiumrosenbergiihemocytes sub-populations and immune responses to novel pathogen spiroplasma MR-1008[J]. Fish & Shellfish Immun, 2012,33(4):795-800.

[13] 王欣欣, 繩秀珍, 戰(zhàn)文斌. 降低交叉反應(yīng)的魚類病原菌檢測(cè)抗體芯片初步研究[J]. 海洋湖沼通報(bào), 2013(1):23-28.

[14] 陳路, 張新紅. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與病原生物學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2013:8-9.

[15] 李華, 李重實(shí), 李明, 等. 抗鯰愛德華氏菌多克隆抗體的制備及特性分析[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2010,40(10):29-32.

[16] 竇勇, 寧喜斌. 副溶血弧菌多克隆抗體的制備及其特性分析[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007,26(3):85-89.

[17] 戰(zhàn)文斌, 齊繼光, 劉洪明, 等. 水產(chǎn)動(dòng)物6種主要病原菌與抗血清的免疫交叉反應(yīng)[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004,11(1):14-19.

[18] Kumar B,Deepika A,Makesh M, et al. Production and characterization of monoclonal antibodies to the hemocytes of mud crab,Scyllaserrata[J].J Invertebr Pathol, 2012, 111(1):86-89.

[19] Van de Braak C B, Botterblom M H, Taverne N, et al. Monoclonal antibodies against haemocyte molecules ofPenaeusmonodonshrimp react with haemolymph components of other crustaceans and disparate taxa[J].Dev Comp Immunol,2001,25(4):279-283.

[20] Winotaphan P,Sithigorngul P,Muenpol O, et al. Monoclonal antibodies specific to haemocytes of black tiger prawnPenaeusmonodon[J].Fish & Shellfish Immun, 2005,18(3):189-198.

[21] 王穎, 王文琪, 程順?lè)? 三疣梭子蟹顆粒血細(xì)胞單克隆抗體的研制及7種甲殼類動(dòng)物血細(xì)胞的交叉反應(yīng)研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2015, 39(6):810-817.

[22] 陳騁. 半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)免疫相關(guān)基因CsG3BP的克隆、表達(dá)及功能研究[D]. 青島:中國(guó)科學(xué)院研究生院海洋研究所, 2013.

[23] 韓卓, 陳曉燕, 馬道榮, 等. 激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)技術(shù)與應(yīng)用[J]. 科技信息, 2009(19):27-28.

[24] 夏宏林, 何穎, 鄒澤紅, 等. 蘋果過(guò)敏原Mal d 4蛋白抗原表位預(yù)測(cè)及交叉反應(yīng)分析[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2012,28(1):57-61.

[25] 王有基, 林江興, 李瓊珍, 等. 翡翠貽貝血淋巴細(xì)胞亞群鑒定及相關(guān)免疫功能的流式細(xì)胞分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 38(3):385-399.

[26] 吳曉娜, 蔣紅兵. 流式細(xì)胞術(shù)的工作原理及其臨床應(yīng)用[J]. 中國(guó)醫(yī)療設(shè)備, 2011,26(3):91-93.

[27] Roulston C, Smith V J. Isolation and in vitro characterisation of prohaemocytes from the spider crab,Hyasaraneus(L.)[J]. Dev Comp Immunol, 2010,35(5):537-544.

[28] Battison A, Cawthorn R, Horney B. Classification ofHomarusamericanushemocytes and the use of differential hemocytes counts in lobsters inflected withAerococcusviridansvar. homari(Gaffkemia)[J]. J Invertebr Pathol, 2003,84(3):177-197.

[29] Williams A J, Lutz P L. Blood cell types inCarcinusmaenasand their physiological role[J]. J Mar Biol Assoc UK, 1975,55(3):671-674.

[30] Xue Q G, Renault T, Chilmonczyk S. Flow cytometric assessment of haemocyte sub-populations in the European flat oyster,Ostreaedulis, haemolymph[J]. Fish & Shellfish Immunol,2001, 11(7):557-567．

AntigenicCross-reactivityofCrustaceanHemocytesUsingPolyclonalAntibodiesofSwimmingCrabPortunustrituberculatus

CAI Xin1, DENG Deng2, WANG Ying1, WANG Wenqi1

( 1. College of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;2. College of Cooperatives Institute, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China )

In order to research the role of hemocytes in immune mechanism of crustaceans, polyclonal antibodies against hemocytes of swimming crabPortunustrituberculatuswere raised, and laser scanning confocal microscopy (LSCM), Western-blotting and Flow Cytometry (FCM) were used to detect the cross-reaction between antisera of swimming crab and 4 species crustacean (Cancermagister,Charybdisjaponic,Eriocheirsinensis,Paralithodescamtschaticus)hemocytes.Two types of hemocytes inC.japonic,E.sinensi, andP.camtschaticusand three types of hemocytes inC.magisterwere distincted by FCM. The strongest intensity of immuno-reactivity was inC.magisterby LSCM, and the maximal positive rate was that antisera reacted with hemocytes ofC.magisterdetected by FCM, with 99.45% of granulocytes and 98% of hyalinocytes. The results indicated antigenic similarities were found among the two species. Thus,C.magisterbeing more closely related species to swimming crab exhibited many immuno-reactions, while the other species with a phylogenetically longer distance to swimming crab did not. The immuno-reactive epitopes inC.magisterand swimming crab on the hemocyte membranes and in the plasma seemed to be well conserved, however, they are not necessarily the same, with similar functions. There was higher positive rate in granulocytes (81.34%) than in hyalinocytes (78.56%) detected by FCM in four species. The findings indicate that antigenic similarities exist among the four crustaceans species,C.magisterbeing more closely related species to swimming crab.

Portunustrituberculatus; polyclonal antibody; cross-reactivity

關(guān)于《水產(chǎn)科學(xué)》增頁(yè)的通知

隨著《水產(chǎn)科學(xué)》雜志影響力的不斷提升，論文來(lái)稿量亦不斷增多，為更快的傳播漁業(yè)科技信息，縮短論文出版時(shí)滯，滿足科研人員的發(fā)表科研論文需求，經(jīng)遼寧省新聞出版廣電局批準(zhǔn)，《水產(chǎn)科學(xué)》雜志由2017年第3期始，頁(yè)碼增至144頁(yè)。特此通知。歡迎廣大讀者踴躍投稿。

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.008

S917

A

1003-1111(2017)03-0303-08

2016-06-16；

2016-08-31.

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蝦蟹類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-15-011-06)；山東省“兩區(qū)”建設(shè)專項(xiàng).

蔡鑫(1990—)，女，碩士；研究方向：水產(chǎn)病害及免疫學(xué).E-mail：caixin0105@163.com.通訊作者：王文琪(1969—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：水產(chǎn)疾病防治.E-mail：wenqi31@163.com.

(本刊編輯部)