王庚申，施 慧，謝建軍，汪 瑋，何 杰，許文軍

( 1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山316021； 2. 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山 316021 )

白斑綜合癥病毒在日本囊對蝦精養(yǎng)池塘中的動態(tài)變化

王庚申1,2，施 慧1，謝建軍1，汪 瑋1，何 杰1，許文軍1

( 1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山316021； 2. 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山 316021 )

用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了高密度精養(yǎng)池塘中日本囊對蝦體內(nèi)及浮游動物白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化，檢測結(jié)果顯示，兩口池塘的日本囊對蝦苗種均攜帶白斑綜合癥病毒，達(dá)2.43×105～9.42×105IU/mg；浮游動物也攜帶微量白斑綜合癥病毒，達(dá)6.78×102～8.02×102IU/mg。在整個養(yǎng)殖過程中，日本囊對蝦多個組織均攜帶白斑綜合癥病毒，平均病毒量為鰓>肌肉>肝胰腺>胃；各組織病毒攜帶量的變化趨勢不一致，肌肉、肝胰腺、胃等呈現(xiàn)明顯的先降后升趨勢，最低降至1.78×103IU/mg，鰓白斑綜合癥病毒攜帶量的下降幅度較小，最低為7.29×104IU/mg。浮游動物的病毒量在白斑綜合癥爆發(fā)前波動不明顯，發(fā)病時急劇升高。綜合認(rèn)為，苗種攜帶是白斑綜合癥病毒的主要來源；當(dāng)養(yǎng)殖進(jìn)入中后期，底質(zhì)變差、水溫降至病毒適宜復(fù)制的溫度時，易爆發(fā)白斑綜合癥。

日本囊對蝦；浮游動物；白斑綜合癥病毒；熒光定量 PCR

日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)俗稱花蝦、車蝦、竹節(jié)蝦等，在中國、日本、東南亞國家、澳大利亞、非洲國家及紅海等海區(qū)均有分布，具有耐低溫、耐干露、色澤絢麗、味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價值高等優(yōu)點，是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類之一[1-2]。近年來，日本囊對蝦養(yǎng)殖技術(shù)得到不斷的完善和提高，工廠化和高位池精養(yǎng)模式成為主要的養(yǎng)殖模式[3]。白斑綜合癥是近二十年來危害我國乃至世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)最主要的疾病，被世界動物衛(wèi)生組織列為需要報告的水生動物病毒性疫病之一[4]。該病發(fā)病快，感染率和致死率極高，通常情況下對蝦在感染后約3～5 d內(nèi)死亡率達(dá)100%[5]。由于日本囊對蝦對白斑綜合癥病毒抵抗力較弱，加上親體普遍未經(jīng)過無病化選育，導(dǎo)致蝦苗攜帶白斑綜合癥病毒，在養(yǎng)殖過程中極易爆發(fā)白斑綜合癥。目前，針對白斑綜合癥尚缺乏有效的治療措施，盡早發(fā)現(xiàn)病毒并及早采取預(yù)防措施是防控白斑綜合癥的有效策略[6-7]。

病毒攜帶量是決定白斑綜合癥爆發(fā)與否的關(guān)鍵指標(biāo)。徐麗美等[8]通過定量PCR 方法初步將每毫克組織含103個病毒粒子作為白斑綜合癥爆發(fā)的危險臨界值。因此，監(jiān)測宿主體內(nèi)的病毒量變化對于判斷白斑綜合癥病毒感染進(jìn)程具有重要意義。本研究旨在利用實時定量PCR技術(shù)，定期對高密度精養(yǎng)池塘日本囊對蝦體內(nèi)及浮游動物的白斑綜合癥病毒攜帶量進(jìn)行檢測，以期精確地反映白斑綜合癥病毒在日本囊對蝦體內(nèi)和浮游動物中的增殖變化規(guī)律，為高密度精養(yǎng)日本囊對蝦防控白斑綜合癥提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗條件

試驗在浙江省舟山市華祥水產(chǎn)有限公司進(jìn)行。選取2個日本囊對蝦高密度精養(yǎng)池塘，編號為26#、31#，面積分別為0.07 hm2、0.09 hm2。池塘為正方形，池底和四周用水泥澆灌，池底鋪沙20～30 cm，水深1.8～2.0 m，養(yǎng)殖用水經(jīng)50 mg/L漂白粉消毒后，第3 d使用。池塘配備22.5 kW/hm2水車增氧機(jī)及底部PVC增氧管。放苗時間為2015年7月20號，蝦苗長0.7～0.8 cm，放苗密度105萬尾/hm2。

1.2 樣品采集

1.2.1 對蝦樣品

2口日本囊對蝦高密度精養(yǎng)池塘，從放苗開始連續(xù)跟蹤其養(yǎng)殖全程，每10 d取樣一次。因2口塘均因白斑綜合癥爆發(fā)導(dǎo)致養(yǎng)殖終止，26#池塘跟蹤取樣共計60 d，31#池塘共計70 d。試驗蝦均為活蝦，每次隨機(jī)采集對蝦樣品30尾/塘，分別取日本囊對蝦的鰓、肌肉、肝胰腺、胃等組織，用75%酒精固定。

1.2.2 浮游動物

用13號浮游生物網(wǎng)撈取浮游動物，低溫保存帶回實驗室。經(jīng)3000 r/min離心5 min，去雜質(zhì)，滅菌生理鹽水清洗干凈用于DNA提取。

1.3 樣品DNA的提取

30尾樣品蝦隨機(jī)分為3組，任選1組，并分別取10尾蝦的鰓和肌肉組織混合成1個樣品，鰓總質(zhì)量(14.91±1.83) mg，肌肉總質(zhì)量(16.90±2.23) mg，肝胰腺組織總質(zhì)量(17.71±2.53) mg，胃總質(zhì)量(7.73±0.92) mg；浮游生物總質(zhì)量(20.45±1.19) mg。各組織樣品DNA用Qiagen DNA提取試劑盒提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物與探針

用于Real-time PCR檢測白斑綜合癥病毒的引物和探針設(shè)計參考文獻(xiàn)[9]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物和探針的序列

1.5 實時定量PCR檢測

Real-time PCR檢測白斑綜合癥病毒的方法參照文獻(xiàn)[10]所建立的方法，20 μL反應(yīng)體系包括：10 μL 2×TransStart? Probe qPCR SuperMix，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，10 μmol/L探針0.4 μL，模板DNA 2 μL，補(bǔ)充雙蒸水至20 μL。試驗在羅氏LightCycler480上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，并設(shè)置空白對照。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法制備。10倍梯度稀釋陽性質(zhì)粒并對其進(jìn)行擴(kuò)增，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游動物白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化

2口池塘中浮游動物白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化見圖1。26#池塘浮游動物白斑綜合癥病毒量在養(yǎng)殖前50 d保持平穩(wěn)，基本維持在102IU/mg水平，在養(yǎng)殖60 d時升至6.23×103IU/mg；31#池塘病毒攜帶量的第一個波動高峰出現(xiàn)在9月8日，達(dá)到了1.32×103IU/mg，隨后出現(xiàn)下降；9月28日白斑綜合癥爆發(fā)，病毒量高達(dá)3.0×103IU/mg。由此可見，浮游動物病毒攜帶量快速上升與日本囊對蝦爆發(fā)白斑綜合癥時間同步。

圖1 浮游動物白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化

2.2 日本囊對蝦白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化

2.2.1 鰓白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化

2口池塘的日本囊對蝦苗種均攜帶白斑綜合癥病毒，其中鰓病毒攜帶量超過105IU/mg。在養(yǎng)殖前20 d，2口池塘的鰓病毒量波動較平穩(wěn)，20 d之后出現(xiàn)下降，但幅度較小，最低攜帶量分別為7.29×104IU/mg、9.83×104IU/mg；在養(yǎng)殖第50 d時又升至105IU/mg以上水平。在白斑綜合癥爆發(fā)前，鰓病毒量最高為9.42×105IU/mg和1.15×106IU/mg，爆發(fā)之后達(dá)到了1.53×109IU/mg和8.68×108IU/mg。在整個養(yǎng)殖過程中，鰓組織病毒量均超104IU/mg，說明日本囊對蝦處于高風(fēng)險的養(yǎng)殖狀態(tài)(圖2)。

圖2 鰓白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化

2.2.2 肌肉白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化

2口池塘日本囊對蝦肌肉白斑綜合癥病毒攜帶量變化見圖3。在養(yǎng)殖10 d后，2口池塘日本囊對蝦肌肉白斑綜合癥病毒量均出現(xiàn)下降，隨后26#池塘肌肉病毒量為3.80×103～ 3.26×104IU/mg，直至發(fā)病時達(dá)2.08×108IU/mg，最低值出現(xiàn)在8月19日；31#池塘肌肉病毒量持續(xù)降至103IU/mg水平，最低值為1.52×103IU/mg，在9月8日快速升至3.30×105IU/mg，之后逐漸升高，至9月28日白斑綜合癥爆發(fā)時達(dá)到1.50×108IU/mg。

圖3 肌肉白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化

2.2.3 肝胰腺白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化

2口池塘日本囊對蝦肝胰腺白斑綜合癥病毒攜帶量均先降后升。26#池塘病毒量為1.78×103～3.24×104IU/mg，發(fā)病時高達(dá)1.18×108IU/mg，最低值出現(xiàn)在8月9日。31#池塘日本囊對蝦肝胰腺病毒量低于26#池塘，波動范圍為1.79×103～ 2.10×104IU/mg，發(fā)病時高達(dá)2.89×108IU/mg(圖4)。整體上看，肝胰腺白斑綜合癥病毒攜帶量低于肌肉。

圖4 肝胰腺白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化

2.2.4 胃白斑綜合癥病毒攜帶量的動態(tài)變化

2口池塘日本囊對蝦胃白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化見圖5。胃病毒攜帶量動態(tài)變化與肝胰腺基本一致，呈現(xiàn)先降后升的趨勢。26#池塘胃病毒量在8月9日降至4.99×103IU/mg，隨后在2.84×103～1.20×104IU/mg波動，發(fā)病時達(dá)到8.29×109IU/mg；31#池塘胃病毒量也在8月9日降至103IU/mg水平，隨后其波動范圍為1.89×103～6.52×104IU/mg，發(fā)病時高達(dá)2.67×107IU/mg。

圖5 胃白斑綜合癥病毒攜帶量動態(tài)變化

3 討 論

3.1 日本囊對蝦攜帶白斑綜合癥病毒動態(tài)變化

本研究利用TaqMan探針法熒光定量PCR對高密度精養(yǎng)池塘日本囊對蝦體內(nèi)白斑綜合癥病毒攜帶量進(jìn)行了監(jiān)測，結(jié)果表明，2口池塘的日本囊對蝦苗種均攜帶白斑綜合癥病毒，攜帶量達(dá)2.43×105～9.42×105IU/mg，屬于中度感染。從病毒攜帶量動態(tài)變化規(guī)律來看，鰓組織變化幅度較小，僅在8月份樣品中最低降至7.29×104IU/mg，而肌肉、肝胰腺、胃等組織均呈現(xiàn)明顯的先降后升趨勢，最低降至1.78×103IU/mg。王奕玲等[11]利用實時定量PCR對高密度精養(yǎng)池塘對蝦白斑綜合癥病毒攜帶量進(jìn)行跟蹤調(diào)查，結(jié)果顯示，養(yǎng)殖前期各個池塘對蝦白斑綜合癥病毒攜帶量均有一定程度上升，與本試驗中養(yǎng)殖前期保持穩(wěn)定或有所下降不同，可能與本次試驗的日本囊對蝦苗種白斑綜合癥病毒攜帶量較高有關(guān)。當(dāng)養(yǎng)殖前期水體環(huán)境優(yōu)良，對蝦免疫力較強(qiáng)時，病毒難以快速復(fù)制。從組織分布來看，日本囊對蝦多個組織均攜帶白斑綜合癥病毒，平均病毒量為鰓>肌肉>肝胰腺>胃。戰(zhàn)文斌等[12]采用單克隆抗體FAT的原位觀察病毒在日本囊對蝦體內(nèi)增殖，結(jié)果顯示鰓、皮下組織和血竇中感染強(qiáng)度最高，與本試驗熒光定量結(jié)果比較一致。而劉波等[13]用套氏PCR和斑點雜交的方法研究了白斑綜合癥病毒在日本囊對蝦不同組織內(nèi)的分布，結(jié)果顯示肌肉和附肢擴(kuò)增出的目的條帶明顯好于鰓、肝胰臟和心臟等其他組織， 與本試驗結(jié)果有所差異，原因可能是病蝦處于不同的感染階段[14]。

3.2 浮游動物病毒攜帶量與日本囊對蝦的關(guān)系

有研究表明，浮游動物是白斑綜合癥病毒的中間宿主[15-16]，同時又可作為餌料被對蝦攝食[17-18]，因此檢測養(yǎng)殖水體中浮游動物的病毒攜帶量對判斷浮游動物與白斑綜合癥爆發(fā)之間的關(guān)系具有重要意義。本試驗中，浮游動物白斑綜合癥病毒攜帶量在白斑綜合癥爆發(fā)前變化不明顯，為6.78×102～8.02×102IU/mg。當(dāng)日本囊對蝦發(fā)病時，浮游動物病毒攜帶量急劇升至逾103IU/mg，這也證實了在對蝦發(fā)病季節(jié)，浮游動物攜帶病毒的強(qiáng)度也會上升[19]。在整個養(yǎng)殖過程中，浮游動物病毒攜帶量的變化趨勢與鰓相似，但與肌肉、肝胰腺、胃等先降后升的趨勢明顯不同，同時，浮游動物病毒攜帶量也極顯著低于日本囊對蝦組織(P<0.01)。

3.3 白斑綜合癥爆發(fā)原因及病毒來源

筆者發(fā)現(xiàn)，水溫長期處于約25 ℃和底質(zhì)變差是兩口池塘白斑綜合癥爆發(fā)的主要原因。有研究認(rèn)為，25 ℃是白斑綜合癥病毒的最佳復(fù)制溫度[20-21]，當(dāng)病毒數(shù)量超過一定閥值時造成白斑綜合癥爆發(fā)。當(dāng)養(yǎng)殖進(jìn)入中后期，大量的殘餌、糞便、死亡藻類在沙層積聚使底質(zhì)變差，消耗大量溶解氧形成氧債，一定程度上抑制了對蝦的新陳代謝，對蝦抗病力下降，病毒易感性往往大幅提高。從病毒來源來看，白斑綜合癥病毒主要來自日本囊對蝦蝦苗，且平均病毒量超過105IU/mg，養(yǎng)殖水體中的浮游動物也攜帶微量病毒。因此，獲得不攜帶病毒的日本囊對蝦苗種和做好水體消毒是降低白斑綜合癥爆發(fā)風(fēng)險的重要途徑。

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VariationinWSSVinKurumaShrimpMarsupenaeusjaponicasCulturedandZooplanktoninIntensiveFarmingPonds

WANG Gengshen1,2, SHI Hui1, XIE Jianjun1, WANG Wei1,HE Jie1, XU Wenjun1

( 1. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China; 2. Key Laboratory of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province,Zhoushan 316021, China )

The variation in white spot syndrome virus (WSSV) infection intensity of kuruma shrimpMarsupenaeusjaponicasand zooplankton were quantified in intensive farming ponds by real-time PCR. The results showed that the shrimp larvae in the ponds carried WSSV at concentrations from 2.43×105to 9.42×105IU/mg; the zooplankton carried WSSV at concentrations from 6.78×102to 8.02×102IU/mg. Four tissues (gill, muscle, stomach and hepatopancreas) of kuruma shrimp carried WSSV genomes through the entire farming perid. The maximal mean number of WSSV copies were observed in the gill and the minimal mean number of WSSV copies in the stomach. The variation of WSSV in the tissues was different. The variation in amounts of WSSV genome showed first decrease then increase in the tissues (muscle, stomach and hepatopancreas) with the minimal value 1.78×103IU/mg. The WSSV genome amount in the gill was decreased, less than the other tissues, with the minimal value of 7.29×104IU/mg. The amounts of WSSV in the zooplankton had no obvious fluctuation before the breakout of WSS, and increased rapidly after the breakout of WSS. The findings indicated that the main source of WSSV in the ponds was shrimp seed; WSS was easily outbreak during the middle and later rearing periods, when the sediment was polluted and the water temperature decreased at the WSSV vulnerable temperature of kuruma shrimp.

Marsupenaeusjaponicas; zooplankton; WSSV; real-time PCR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.012

S945.4

A

1003-1111(2017)06-0763-05

2016-10-26；

2017-02-03.

浙江省科技廳項目(2015F30003, 2015F50004).

王庚申(1988-)，男，工程師，碩士；研究方向：海水健康養(yǎng)殖. E-mail:wgs-1988@163.com.通訊作者：許文軍(1971-)，男，教授級高級工程師；研究方向：海水健康養(yǎng)殖. E-mail:xwenjun@sina.com.