高祥剛，鹿志創(chuàng)，田甲申，韓家波，赫崇波，宋新然

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2. 大連圣亞旅游控股股份有限公司，遼寧 大連 116023 )

斑海豹線粒體基因組序列分析及比較研究

高祥剛1，鹿志創(chuàng)1，田甲申1，韓家波1，赫崇波1，宋新然2

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2. 大連圣亞旅游控股股份有限公司，遼寧 大連 116023 )

本研究采用LA-PCR擴(kuò)增和引物步移相結(jié)合的方法對我國遼東灣斑海豹的線粒體基因組全序列進(jìn)行了測定，并完成了基因組成和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。遼東灣斑海豹線粒體基因組長為16 754 bp，其基因構(gòu)成與其他海洋哺乳動物基本一致，包括37個基因(2個rRNA基因、22個tRNA基因和13個蛋白質(zhì)編碼基因)和1個控制區(qū)。在其37個基因中，ND6、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro位于L鏈上，其余均位于H鏈上。對我國遼東灣、韓國和美國阿拉斯加斑海豹線粒體基因組進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，三者線粒體基因組長度略有不同，差異主要體現(xiàn)在以重復(fù)片段形式存在的控制區(qū)序列中。值得注意的是，在編碼區(qū)中，3個目標(biāo)群體的線粒體ND5基因核苷酸差異最為顯著，共檢測到了18個突變位點(diǎn)，造成4處氨基酸序列變異。斑海豹線粒體基因組蛋白編碼基因的變異分析及海豹科系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，我國遼東灣和韓國斑海豹的序列同源性顯著高于美國阿拉斯加斑海豹，說明遼東灣和韓國斑海豹很可能來自同一個種群。

斑海豹；線粒體基因組；結(jié)構(gòu)比較；系統(tǒng)進(jìn)化

線粒體DNA(mtDNA)是動物細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，與核DNA相比，具有母系遺傳、分子結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、無組內(nèi)特異性等特點(diǎn)。目前mtDNA已成為研究物種起源與系統(tǒng)發(fā)生、近緣物種和種內(nèi)群體間遺傳分化、物種鑒定、遺傳多樣性分析等的有力工具[1]。

海豹是對鰭足亞目種海豹科動物的統(tǒng)稱，現(xiàn)存的海豹種類較多，目前共有10屬19種。斑海豹(Phocalargha)屬食肉目、犬形亞目、海豹科、斑海豹屬，主要分布于北太平洋的北部和西部海域及其沿岸和島嶼。斑海豹在我國主要分布于渤海和黃海海域，偶見于南海。是唯一能在我國海域繁殖的鰭腳類動物，屬于國家二類重點(diǎn)保護(hù)野生動物，也是黃、渤海生態(tài)系統(tǒng)健康狀況的重要指示生物，因而受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍重視[2-3]。

筆者通過LA-PCR擴(kuò)增和引物步移相結(jié)合的方法對我國遼東灣斑海豹的線粒體基因組全序列進(jìn)行了測定，初步分析了斑海豹線粒體基因組序列的基本特征，探討了我國、韓國、美國阿拉斯加斑海豹線粒體基因組基因排列、蛋白質(zhì)編碼基因和多態(tài)位點(diǎn)等。同時利用線粒體基因組蛋白編碼序列，分析了海豹科的系統(tǒng)分類關(guān)系。本研究對于海豹的遺傳分化與系統(tǒng)發(fā)生研究、物種鑒定、遺傳多樣性的保護(hù)等諸多方面提供寶貴的遺傳信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和基因組DNA提取

解剖盤錦雙臺河口救助的當(dāng)年死亡斑海豹幼崽的肝臟，清洗后立即保存于-20 ℃冰柜中。采用常規(guī)酚氯仿法提取全基因組DNA[4]，溶于TE緩沖液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增及序列測定

參考韓國、美國阿拉斯加斑海豹(GenBank號分別為：FJ895151、NC_008430)線粒體基因組序列，應(yīng)用FastPCR v3.6軟件設(shè)計引物COⅠ_F 和COⅠ_R。利用課題組已設(shè)計引物[5-6]COⅠ_F、COⅠ_R、L16274_F 、H34_R，形成引物組合(表1)L16274_F + COⅠ_R 、COⅠ_F + ND4L_R、 ND4L_F + H34_R進(jìn)行遼東灣斑海豹的線粒體基因組Long-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件和反應(yīng)體系見表2。測序采用引物步移法進(jìn)行雙向測通。因?yàn)镻CR產(chǎn)物直接測序法不能準(zhǔn)確讀出測序引物后面約50 bp長度的序列，所以在設(shè)計擴(kuò)增片段的引物時，盡可能保證相鄰擴(kuò)增片段之間包含80 bp以上的序列重疊，以保證測序后序列的準(zhǔn)確性及正確拼接。由于在控制區(qū)測序時出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，此段區(qū)域采用克隆后測序的方法。

表1 用于擴(kuò)增遼東灣斑海豹線粒體基因組的引物

表2 遼東灣斑海豹線粒體基因組擴(kuò)增的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系

1.3 序列分析、基因預(yù)測

首先使用Chromas 2.4.1軟件打開和核實(shí)基因測序得到的峰圖，并用CONSED手工檢查以避免錯配[7]。利用DOGMA軟件對13個蛋白質(zhì)編碼基因和2個核糖體RNA 的位置進(jìn)行預(yù)測[8]，與其他海豹屬物種的線粒體基因組比對后確定精確的起始位置。利用tRNAscan-SE 1.21軟件對轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及它們的二級結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測[9]。

1.4 斑海豹線粒體基因組的比較分析

將所測得的遼東灣斑海豹mtDNA序列，應(yīng)用Clustal 1.83和Mega 5.0生物信息學(xué)軟件，分別與韓國、美國阿拉斯加斑海豹線粒體基因組全序列進(jìn)行比較分析，探討三者在蛋白編碼基因的氨基酸和核苷酸序列、tRNAs、rRNAs上的差異，以及在非編碼區(qū)的變異情況。

1.5 海豹科線粒體基因組的系統(tǒng)進(jìn)化

對NCBI上已公布的海豹科的15個種、17條線粒體基因組DNA序列的13個蛋白編碼基因的氨基酸序列和核苷酸序列采用鄰接法分別構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹。

2 結(jié) 果

2.1 遼東灣斑海豹線粒體基因組的組成

將所測得的遼東灣斑海豹線粒體基因組全序列拼接完整后提交至GenBank(NCBI登錄號：KT818831)，其長度為16 754 bp，呈現(xiàn)典型的海洋哺乳動物線粒體基因組的特點(diǎn)。即斑海豹線粒體基因組為環(huán)狀，由37個基因組成，其中的 13個蛋白質(zhì)編碼基因包括：1個細(xì)胞色素b基因(CytB)、2個ATP酶亞基的基因(ATPase6, ATPase8)、3個細(xì)胞色素氧化酶亞基的基因(COⅠ，COⅡ，CO Ⅲ)和7個呼吸鏈NADH脫氫酶亞基的基因(ND1-6，ND4L)；2個rRNA基因分別為1個12S rRNA和 1個16S rRNA；另外還有22個tRNA基因。

在13個蛋白質(zhì)編碼基因中，12個是由H 鏈編碼，僅ND6由L鏈編碼；在22個tRNA中，tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro的編碼基因位于L鏈上，其余則位于H 鏈上。

2.2 與其他斑海豹的比較

將所測得的中國遼東灣斑海豹線粒體基因組與韓國、美國阿拉斯加斑海豹線粒體基因組進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，三者線粒體基因組長度略有不同，分別為16 754、16 728、16 701 bp，主要的變化出現(xiàn)在控制區(qū)(OH)，OH長度分別為1316、1290、1264 bp。

對上述3個線粒體基因組的37個基因分別進(jìn)行了比較研究，在rRNA中，發(fā)現(xiàn)5個單核苷酸變異；在tRNA中，發(fā)現(xiàn)阿拉斯加斑海豹的tRNALeu出現(xiàn)1個堿基缺失，其他的tRNAPhe、tRNAAla、tRNATyr、tRNAThr等各有1個單核苷酸變異，除此之外的17個tRNA完全一致；13個蛋白質(zhì)編碼基因中，均發(fā)現(xiàn)有核苷酸變異，其中8個基因(ATPase6、COⅠ、COⅡ、CytB、ND1、ND3、ND4、 ND4L)相對比較保守，其氨基酸序列在3個基因組中完全一致，5個基因出現(xiàn)氨基酸序列變化(表3)，其中，ND5的核苷酸突變程度最大，總長1821 bp的核苷酸中有18個突變位點(diǎn)，變異率為0.99%，出現(xiàn)4個氨基酸序列突變。

表3 斑海豹3個線粒體基因組蛋白編碼基因的突變比較分析

2.3 海豹科線粒體基因組的系統(tǒng)進(jìn)化

以海洋哺乳動物的鯨目白鰭豚(Lipotesvexillifer，登錄號：NC_007629)、和海牛目儒艮(Dugongdugon，登錄號： NC_003314)作外群，根據(jù)鰭足亞目海豹科的2個亞科17條mtDNA序列，用鄰接法構(gòu)建13個編碼蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)關(guān)系樹(圖1)，與最大似然法和最小進(jìn)化法構(gòu)建的系統(tǒng)樹基本一致。結(jié)果顯示遼東灣斑海豹首先和韓國斑海豹聚為一支，然后與阿拉斯加斑海豹聚為一支，3個斑海豹再與海豹亞科的其他海豹聚為一大支。僧海豹亞科的5個物種序列單獨(dú)聚為一大支。根據(jù)13個編碼蛋白的核苷酸與氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹結(jié)果基本一致，并且均顯示遼東灣斑海豹與韓國斑海豹的關(guān)系較阿拉斯加斑海豹更近。

圖1 基于13種線粒體蛋白質(zhì)的氨基酸序列的鄰接法進(jìn)化樹中國遼東灣斑海豹(KT818831)、韓國斑海豹(FJ895151)、美國阿拉斯加斑海豹(NC_008430)、港海豹(NC_001325)、環(huán)斑海豹(NC_008433)、貝加爾環(huán)海豹(NC_008432)、里海環(huán)斑海豹(NC_008431)、灰海豹(NC_001602)、鞍紋海豹(NC_008429)、帶紋海豹(NC_008428)、冠海豹(NC_008427)、髯海豹(NC_008426)、夏威夷僧海豹(NC_008421)、食蟹海豹(NC_008423)、韋德爾海豹(NC_008424)、豹形海豹(NC_008422)、南象海豹(NC_008422)、白鰭豚(NC_007629)和儒艮(NC_003314).

3 討 論

3.1 斑海豹線粒體控制區(qū)異質(zhì)性現(xiàn)象

異質(zhì)性是指在有些脊椎動物，如中華鱘(Acipensersinensis)、弓鰭魚(Amiacalva)，體內(nèi)存在多種重復(fù)序列數(shù)目不同的線粒體基因組。至于控制區(qū)異質(zhì)型和多態(tài)性水平高的原因，有學(xué)者指出線粒體基因異質(zhì)性中的重復(fù)序列可能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)引起高頻率回復(fù)突變，這也許是導(dǎo)致異質(zhì)性形成的原因，當(dāng)然也不排除父本mtDNA的滲漏造成異質(zhì)性的可能性。同時異質(zhì)性也是物種進(jìn)化的原因，線粒體中的串聯(lián)重復(fù)、存在的大量插入與缺失等是物種進(jìn)化的特征[10-12]。

而本文通過比較分析我國遼東灣、韓國、美國阿拉斯加斑海豹線粒體基因組控制區(qū)發(fā)現(xiàn)，三者主要變化出現(xiàn)在控制區(qū)CSB-Ⅲ上游約500 bp序列中，其上有大量重復(fù)片段，且重復(fù)片段長度有差異，這些重復(fù)片段主要為：ACGTAC、GCACAC、ACGT、ACGC、AC、GC。Bahn等[13-14]在比較韓國與日本斑海豹的控制區(qū)57個單倍型時，未發(fā)現(xiàn)完全一致的序列。孫凡越[15]也對7頭遼東灣斑海豹控制區(qū)序列進(jìn)行了克隆測序，得到了146個單倍型，其中異質(zhì)型數(shù)目占所測序列總數(shù)的92%，并發(fā)現(xiàn)序列差異的原因主要是存在6種重復(fù)單元(GTACACAC、GTACAC、GTAC、GCACACAC、GCACAC和GCAC)，而各單倍型的重復(fù)單元及重復(fù)次數(shù)均不相等，由此造成了遼東灣斑海豹不同個體之間出現(xiàn)長度異質(zhì)性。這一結(jié)論與本試驗(yàn)的研究結(jié)果較類似，說明我國遼東灣斑海豹的線粒體DNA異質(zhì)性程度比較高，因此，OH重復(fù)單元的特征以及線粒體ND5基因的序列多態(tài)性，都有可能成為區(qū)分斑海豹個體和不同種群的重要分子標(biāo)記。

3.2 我國遼東灣斑海豹與韓國、阿拉斯加斑海豹的親緣關(guān)系

本文在比較分析斑海豹線粒體基因組蛋白編碼基因的突變時，發(fā)現(xiàn)在5個突變蛋白質(zhì)編碼基因中，共有10個位點(diǎn)出現(xiàn)氨基酸變化，總突變核苷酸位點(diǎn)數(shù)為61個，由表3可見，遼東灣和韓國斑海豹的蛋白編碼基因中，只出現(xiàn)1個氨基酸突變，證明這兩個個體的序列比較保守；相對應(yīng)的阿拉斯加與遼東灣、阿拉斯加與韓國的突變氨基酸位點(diǎn)數(shù)分別為6個、10個，突變核苷酸位點(diǎn)數(shù)分別為56個、58個。通過對斑海豹3個線粒體基因組蛋白編碼基因的突變比較分析(表3)及系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)可以看出，遼東灣和韓國斑海豹的序列同源性顯著高于阿拉斯加與遼東灣、阿拉斯加與韓國，說明遼東灣和韓國斑海豹很可能來自同一個斑海豹種群。

北太平洋的北部和西部海域及其沿岸和島嶼都是斑海豹在世界上的主要分布區(qū)[16]，美國阿拉斯加海域與中國、韓國沿海相距較遠(yuǎn)，而從韓家波等[17]的衛(wèi)星信標(biāo)跟蹤斑海豹研究可以看出，我國遼東灣的斑海豹可以到達(dá)韓國西海岸的白翎島，說明我國海域與韓國西海岸的斑海豹有交流，這進(jìn)一步表明了我國遼東灣與韓國斑海豹較美國阿拉斯加斑海豹的親緣關(guān)系更近。

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AnalysisandComparisonofCompleteMitochondrialGenomeinSpottedSealPhocalargha

GAO Xianggang1, LU Zhichuang1, TIAN Jiashen1, HAN Jiabo1, HE Chongbo1, SONG Xinran2

( 1. Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China; 2. Dalian Sun Asia Tourism Holding Co, Ltd, Dalian 116023, China )

The complete sequence of the mitochondrial genome of the spotted seals (Phocalargha) in the Liaodong Gulf has been determined by long and accurate polymerase chain reaction (LA-PCR) and primer walking technology. The genome is 16 754 bp in size, containing 2 ribosomal RNA genes, 13 protein-coding genes, 22 transfer RNA (tRNA) genes and one control region, demonstrating a structure basically in accordance with other marine mammals. The ND6, tRNAAla, tRNAAsn, tRNACys, tRNATyr, tRNASer(UCN), tRNAGluand tRNAProgenes were located on the light strand (L strand), and the remainders lied on the heavy strand (H strand). The comparative analysis of the seal mitochondrial genome among Liaodong, Korean and Alaskan populations revealed the existence of length differences and that the major variations exhibited in the form of repeat motifs were located in the control region. Notably, in the coding region of the three targeted populations, ND5 showed the maximal mutation degree in total of 18 mutant bases was detected, which resulted in four amino acid changes. The variant and phylogenetic analysis of protein-coding genes indicated that the Liaodong seal shared higher homology with Korean seal than with Alaskan seal. It is inferred that Liaodong seal and Korean seal probably belong to one population.

Phocalargha; mitochondrial genome; comparative structure；phylogeny

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.018

Q786

A

1003-1111(2017)04-0509-05

2016-07-01；

2016-08-16.

遼寧省海洋與漁業(yè)科研項(xiàng)目(201417)；香港海洋公園保育基金資助項(xiàng)目(MM04-1516).

高祥剛(1980-)，男，副研究員；研究方向:動物分子遺傳學(xué). E-mail:xiangganggao@163.com. 通訊作者： 赫崇波(1961-)，男，研究員，博士；研究方向：動物分子遺傳學(xué). E-mail:chongbohe@163.com.