楊 珍，郝翠翠,2，李昊遠,3，焦 坤，王 通，王 冕，陳 娜， 陳明娜，潘麗娟，姜煥煥,4，禹山林*，遲曉元*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；3.哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術學院，山東 威海 264209；4.哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150001)

花生AhGPAT9與AhLPAAT4基因的原核表達及Western Blot分析

楊 珍1，郝翠翠1,2，李昊遠1,3，焦 坤1，王 通1，王 冕1，陳 娜1， 陳明娜1，潘麗娟1，姜煥煥1,4，禹山林1*，遲曉元1*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；3.哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術學院，山東 威海 264209；4.哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150001)

酰基轉移酶基因家族是甘油三酯合成的關鍵基因。本研究以前期克隆的AhGPAT9與AhLPAAT4基因部分序列設計引物，構建原核表達載體，轉化進大腸桿菌BL21，經IPTG誘導表達，利用SDS-PAGE檢測表明，重組蛋白在37℃，5h誘導條件下獲得高效表達。重組蛋白經純化和富集，對新西蘭兔進行4次免疫，純化獲得的多克隆抗血清，通過間接ELISA檢測，表明獲得了效價比較高的多克隆抗體。通過對重組蛋白純化后樣品進行Western Blot分析，結果顯示在純化樣品相應位置有明顯信號，表明所制備的抗體具有很高靈敏度和特異性。并采用制備的抗體對AhGPAT9與AhLPAAT4蛋白在花生不同組織及種子不同發(fā)育時期的表達進行了Western Blot分析。為深入研究AhGPAT9與AhLPAAT4基因的功能提供了科學數(shù)據。

花生；AhGPAT9；AhLPAAT4；原核表達；多克隆抗體；蛋白質免疫印記法

植物油脂作為植物細胞內的關鍵組分，對植物的生長、發(fā)育和繁衍過程具有重要意義，同時作為一種可再生的生物能源產品，得到了廣泛的關注和應用[1-2]。植物油主要來源于植物種子中儲存的的油脂，而油脂主要以三酰甘油(Triacylglycerol，TAG)的形式儲存。植物體內TAG的生物合成(或裝配)主要通過Kennedy Pathway途徑(KP)實現(xiàn)[1]。TAG合成的主要過程是：由甘油-3-磷酸(G-3-P)生成溶血性磷脂酸(LPA)，再生成磷脂酸(PA)，然后生成二酰甘油(DAG)，最后生成TAG。該生物合成過程中的三次酯化反應分別由甘油-3-磷酸?；D移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)、溶血磷脂酸?；D移酶[3](Lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT)和二酰甘油?；D移酶(Diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催化完成[4]。

在本實驗室前期研究中，已經克隆得到了AhGPAT9[5]與AhLPAAT4[6-7]基因并進行了初步功能分析。本研究分別構建了這2個基因的原核表達載體，并誘導重組蛋白表達，獲得了理想濃度的蛋白。制備了多克隆抗體，采用蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法定量確定了目標蛋白在花生不同組織和種子發(fā)育不同時期的表達情況。為AhGPAT9與AhLPAAT4基因在蛋白質水平上的研究提供了新的科學數(shù)據，為進一步了解AhGPAT9與AhLPAAT4蛋白功能奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用花生材料為花育33，由山東省花生研究所提供。種子萌發(fā)后，移入實驗室專用土壤中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待花生生長至三葉期時，取其根、莖、葉、子葉和下胚軸，-80℃凍存?zhèn)溆?。在花生開花下針后，分別采集其下針后12、24、36、48和60d的種子，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

載體pET-28b購自Novagen公司，T4 DNA連接酶、NdeI和XhoI內切酶購自寶生物有限公司(大連)，E.coliDH5a和E.coliBL21感受態(tài)購自天根生化科技有限公司，質粒提取試劑盒與膠回收試劑盒購自OMEGA有限公司，弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑均購自Sigma，辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)和蛋白提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 AhGPAT9與AhLPAAT4基因原核表達載體的構建

根據本實驗室已克隆報道過的AhGPAT9基因(登錄號：KC160499)和AhLPAAT4基因(登錄號：JX843441)部分序列，設計特異性引物，在5'端引物加入NdeI酶切位點，在3'端加入XhoI酶切位點。分別將獲得的AhGPAT9基因和AhLPAAT4基因目的片段PCR產物純化后用NdeI和XhoI雙酶切，同時也將大腸桿菌pET-28b質粒用Nde I和Xho I雙酶切，酶切產物用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，后將連接產物轉入大腸桿菌E.coliDH5a感受態(tài)細胞，在LB平板(含卡那霉素)上挑取陽性克隆單菌落，提取質粒，通過PCR、雙酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆測序驗證，將成功的重組質粒分別命名為pET-28b-AhGPAT9和pET-28b-AhLPAAT4。

1.3 轉 化

取1L重組的pET-28b質粒轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，42℃熱擊90s，冰上靜置2min后涂平板(LB，含卡那霉素)，37℃過夜培養(yǎng)。

1.4 AhGPAT9和AhLPAAT4重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析

挑取表達菌株的單菌落于含卡那霉素的4mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液按1:100比例分別接種于含卡那霉素的4mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min培養(yǎng)。當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導劑。為探索蛋白最佳誘導條件，設對比試驗，分為三組：一組220r/min，20℃誘導過夜；二組220r/min，37℃誘導5h；三組為陰性對照，不加IPTG誘導劑。誘導全部結束后，離心收集菌體后用1×PBS緩沖液懸浮。使用5%濃縮膠、12%分離膠進行SDS-PAGE電泳檢測，分析蛋白表達情況，選擇最佳的蛋白表達誘導條件。然后在最佳誘導條件下，按照上述方法大量誘導表達重組蛋白，并離心收集細胞菌體。

1.5 AhGPAT9和AhLPAAT4重組蛋白的純化及SDS-PAGE分析

1.5.1 超聲破碎菌體

將收集的菌體用破碎Buffer溶解，在冰浴中超聲破碎菌體20min(超聲2s，暫停6s，依次循環(huán))，功率400W。超聲完畢后，4℃，12000r/min，離心20min，取上清做下一步純化。

1.5.2 鎳瓊脂糖親和層析

(1)取5mL Ni-NTA，用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子，流速為5mL/min。將平衡好的柱料與上清混勻，4℃孵育0.5h。(2)上柱，流速為2mL/min，收集穿透液。(3)10倍柱床體積的Binding buffer清洗柱子，流速為10mL/min。(4)Wash Buffer洗雜，流速為5mL/min，收集洗脫液。(5)Elution Buffer洗脫，流速為2mL/min，收集洗脫液。(6)純化后的蛋白置于透析buffer中，4℃透析過夜，過濾分裝，-80℃保存。將透析后的樣品進行SDS-PAGE分析，電泳條件同1.4。

純化試驗用的Buffer配制如下：破碎Buffer：7mol/L鹽酸胍，50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，0.1%Triton X-100，1mmol/L DTT，pH=8.0。Binding buffer：8mol/L尿素，50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，0.1%Triton X-100，1mmol/L DTT，pH=8.0。Wash Buffer：8mol/L尿素，50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，10/20/50mmol/L咪唑，pH=8.0。 Elution Buffer：8mol/L尿素，50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，500mmol/L 咪唑，pH=8.0。透析buffer：1×PBS，1mmol/L DTT，0.1%SKL，pH=7.4。

1.6 重組蛋白濃度測定與Western Blot分析

采用SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照Western Blot步驟用TMB顯色試劑盒顯色，將純化后的蛋白進行Western Blot分析。

1.7 蛋白抗原制備多克隆抗體

選用4月齡2.1kg的健康雌性新西蘭大白兔，分別在1d、21d、35d和49d進行初免、二免、三免和四免。初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，二免、三免、四免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化。初免所用劑量為0.3mg/只，二免、三免、四免劑量為0.15mg/只。并在三免和四免結束后的第7天進行耳靜脈采血，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測抗血清效價；57d時，ELISA檢測抗血清效價達到要求，然后頸動脈采全血。終放后純化抗體，再進行ELISA檢測純化抗體效價。間接ELISA檢測過程中用到的一抗是將兔子的血清分別按照1:1000稀釋，37℃ 孵育1h；二抗是辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，按照 1:8000稀釋，37℃孵育45min。

1.8 基因在花生不同組織和種子不同發(fā)育時期的Western Blot分析

采用蛋白提取試劑盒，提取花育33的根、莖、葉、子葉、下胚軸和5個不同發(fā)育時期的種子蛋白并進行SDS-PAGE分析，經電泳轉膜、免疫反應完成Western Blot分析。

2 結果與分析

2.1 AhGPAT9和AhLPAAT4基因原核表達載體的構建

采用TMHMM 2.0 Server分析蛋白跨膜結構(圖1)，根據結果截取AhGPAT9蛋白N端的236個氨基酸(圖2)和AhGPAT9蛋白中間的260個氨基酸(圖3)進行原核表達研究。陽性克隆測序結果比對正確，表明原核表達載體pET-28b-AhGPAT9和pET-28b-AhLPAAT4構建成功。

2.2 重組蛋白的誘導表達

如圖4(a)(b)所示，SDS-PAGE檢測分析結果表明，在分子量25kD和35kD之間出現(xiàn)特異性目的條帶，與生物信息學預測出的蛋白分子量基本一致。另外，在37℃ 5h誘導條件下的蛋白表達量高于20℃過夜的誘導條件。

2.3 重組蛋白的純化

AhGPAT9和AhLPAAT4重組蛋白經過鎳瓊脂糖親和層析法純化后，在25kD和35kD之間位置出現(xiàn)明顯單一條帶(圖5)，表明AhGPAT9和AhLPAAT4重組蛋白均成功得到了純化，為蛋白功能的進一步研究奠定了基礎。

圖1 AhGPAT9和AhLPAAT4基因的跨膜結構預測 Fig.1 Predicted transmembrane domain for AhGPAT9 and AhLPAAT4

圖2 AhGPAT9原核表達蛋白序列的選擇 Fig.2 The AhGPAT9 protein sequence used for prokaryotic expression注：劃線的蛋白序列用于原核表達研究。下同。Note: The underlined protein sequences were used for prokaryotic expression. The same as below.

圖3 AhLPAAT4原核表達蛋白序列的選擇 Fig.3 The AhLPAAT4 protein sequence used for prokaryotic expression

圖4 AhGPAT9(a)和AhLPAAT4(b)重組蛋白小試SDS-PAGE分析圖 Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant AhGPAT9 (a) and AhLPAAT4(b) 注：M：蛋白Marker；1：誘導前全菌；2：20℃誘導全菌；3：37℃誘導全菌。Note: M: protein marker; 1: total proteins before induction; 2: induced total proteins at 20℃; 3: induced total proteins at 37℃.

圖5 AhGPAT9(a)和AhLPAAT4(b)重組蛋白純化的SDS-PAGE分析圖 Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant AhGPAT9 (a) and AhLPAAT4 (b) 注：M：蛋白Marker；1：純化的目的蛋白。Note: M: protein marker; 1: the purified target protein.

AhGPAT9重組蛋白濃度1.190393μg/μL，AhLPAAT4重組蛋白濃度1.1313945μg/μL。

2.4 多克隆抗體制備

AhGPAT9多克隆抗體制備結果如圖6所示，三免后抗血清效價：A≥64k，B≥512k；四免后抗血清效價：A≥512k，B≥512k；終放后抗血清效價：A≥512k，B≥512k；終放后抗血清純化抗體效價：A≥512k，B≥512k。

AhLPAAT4多克隆抗體制備結果如圖7所示，三免后抗血清效價：A≥512k，B≥512k；四免后抗血清效價：A≥512k，B≥512k；終放后抗血清效價：A≥512k，B≥512k；終放后抗血清純化抗體效價：A≥512k，B≥512k。證明血清里抗體濃度高，特異性強，可以用于后續(xù)的蛋白印跡實驗。

2.5 AhGPAT9和AhLPAAT4重組蛋白Western Blot分析

對誘導純化后的重組蛋白進行Western blot分析，結果顯示純化后樣品在相應位置有明顯信號，所獲免疫血清與誘導表達后的目的蛋白專一結合顯色(圖8)。證明所獲抗體確實是含AhGPAT9和AhLPAAT4基因的抗體。

圖6 AhGPAT9多克隆抗體制備結果 Fig.6 Polyclonal antibody preparation of AhGPAT9 注：(a)三免后抗血清效價檢測結果及酶標儀測出的數(shù)據，(b)四免后抗血清效價檢測結果及酶標儀測出的數(shù)據，(c)終放后抗血清效價檢測結果及酶標儀測出的數(shù)據，(d)終放后抗體效價檢測結果及酶標儀測出的數(shù)據。Note: (a) The titer of the antiserum after the third immunization and the data measured by microplate reader. (b) The titer of the antiserum after the fourth immunization and the data measured by microplate reader. (c) The titer of the antiserum after the final blood letting and the data measured by microplate reader. (d) The result of antibody titer test and the data measured by microplate reader.

圖7 AhLPAAT4多克隆抗體制備結果 Fig.7 Polyclonal antibody preparation of AhLPAAT4注：(a)三免后抗血清效價檢測結果圖及酶標儀測出的數(shù)據，(b)四免后抗血清效價檢測結果圖及酶標儀測出的數(shù)據，(c)終放后抗血清效價檢測結果圖及酶標儀測出的數(shù)據，(d)終放后抗體效價檢測結果及酶標儀測出的數(shù)據。Note: (a) The titer of the antiserum after third immunization and the data measured by microplate reader. (b) The titer of the antiserum after fourth immunization and the data measured by microplate reader. (c) The titer of the antiserum after final blood letting and the data measured by microplate reader. (d) The result of antibody titer test and the data measured by microplate reader.

2.6 花生不同組織及種子不同發(fā)育時期的Western Blot分析

對花育33的組織蛋白進行提取，然后進行蛋白質印跡實驗。結果如圖9所示，AhGPAT9與 AhLPAAT4蛋白在花生葉中均表達，在根、莖、子葉、下胚軸中均未見表達。AhGPAT9蛋白在種子發(fā)育至12d、24d、36d時的表達量逐漸上調，但不明顯，發(fā)育到48d時表達量略有下降，隨后在60d時表達量有所上升。AhLPAAT4蛋白在種子發(fā)育至12d時的表達量處于很低水平，到24d時，表達量明顯上調，隨后逐漸緩慢下降，到60d時又有所上升。

圖8 AhGPAT9重組蛋白(a)和AhLPAAT4重組蛋白(b)Western Blot分析圖 Fig.8 Western Blot analysis of recombination AhGPAT9 (a) and AhLPAAT4 (b) protein 注：M: 蛋白Marker；1:目的蛋白. Note: M: protein marker; 1: target protein.

圖9 AhGPAT9和AhLPAAT4在不同組織和種子不同發(fā)育時期的Western Blot分析Fig.9 Western Blot analysis of AhGPAT9 and AhLPAAT4 at different tissues and different seed development stages

3 討 論

原核表達系統(tǒng)具有目的基因表達水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強，成本相對低等優(yōu)點。本試驗構建了原核表達載體，進行了重組蛋白的體外誘導表達，成功獲得了AhGPAT9 和AhLPAAT4重組蛋白。這比利用生物信息學軟件預測出的分子量(AhGPAT9，43.5kD；AhLPAAT4，43.9kD)小，這是因為生物信息學軟件預測的蛋白分子大小是以完整的氨基酸序列進行，而實驗中通過設計引物已經把基因跨膜區(qū)序列切除，所以表達蛋白的分子量要比預測值小。

本實驗室在前期通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術分別檢測了AhGPAT9[5]與AhLPAAT4[7]基因在花生不同組織器官、6個種子發(fā)育不同時期的表達特性。將熒光定量PCR結果與Western Blot結果進行對比分析。熒光定量PCR結果顯示，AhGPAT9基因在花生不同組織中均有表達，莖中的表達量最高，其次是花；AhLPAAT4基因在葉中的表達量明顯高于其他組織。這與Western Blot分析結果不同，這可能與選用的花生品種不同有關，熒光定量試驗選用的是花育19號，而本實驗選用的是花育33號，基因的表達與蛋白的表達可能存在差異。另外，熒光定量PCR結果顯示，AhLPAAT4基因在種子不同發(fā)育時期的表達規(guī)律為：前30d表達量逐漸上調，在40d時略微下降，至50d時表達量下降明顯，60d時又略微上調。這與Western Blot分析結果一致。AhGPAT9基因的熒光定量結果顯示在前50d，表達量逐漸上調，60d時略微下調，基本保持平穩(wěn)，這與Western Blot分析結果相比，只在60d時表達存在差異，整體上基本一致。

大腸桿菌表達重組蛋白的影響因素有很多，包括誘導溫度、誘導時間、誘導劑濃度等，為了能高效表達重組蛋白，本試驗通過對比試驗摸索條件，SDS-PAGE電泳結果顯示，37℃ 5h的誘導條件為最佳，能夠獲得較純、較大量的重組蛋白。高質量重組蛋白的獲得與多克隆抗體的成功制備為進一步研究AhGPAT9和AhLPAAT4蛋白的結構解析、生物學功能、及與其他蛋白質的相互作用奠定了基礎，同時為家族內其他成員的表達和純化提供借鑒。

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[4] Maisonneuve S, Bessoule J J, Lessire R, et al. Expression ofBrassicanapusmicrosomal lysophosphatidic acid acyltransferase isozymes enhances seed oil content inArabidopsisthaliana[J]. Plant Physiol, 2010, 152:670-684.

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[7] Chi X, Dong F, Yang Q, et al. Expression and characterization of Lysophosphatidyl acyltransferase genes from peanut[J]. Research on Crops, 2014, 15(1):141.

ProkaryoticExpressionandWesternBlotofAhGPAT9andAhLPAAT4ofPeanut

YANG Zhen1, HAO Cui-cui1,2, LI Hao-yuan1,3, JIAO Kun1, WANG Tong1, WANG Mian1, CHEN Na1, CHEN Ming-na1, PAN Li-juan1, JIANG Huan-huan1,4, YU Shan-lin1*, CHI Xiao-yuan1*

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China; 2.CollegeofMarineScienceandBiologicalEngineering,QingdaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266042,China; 3.CollegeofMarineandTechnology,HarbinInstituteofTechnology,Weihai264209,China; 4.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150001,China)

Acyltransferase family genes play important roles in triacylglycerol synthesis. The prokaryotic expression vectors ofAhGPAT9 andAhLPAAT4 genes were constructed, and the fusion proteins were super-expressed inE.coliBL21 under induction of IPTG. SDS-PAGE analysis showed that the fusion proteins were highly expressed after induction for 5h at 37℃. Then the fusion proteins were purified and used as antigens to inject rabbits for four times. The prepared polyclonal antiserums were obtained and purified. The indirect ELISA analysis showed that the polyclonal antibodies have a high titer of 1:512000. The polyclonal antibodies were used to test the expression of fusion proteins inE.coliBL21 through Western Blot, and detected the specific bands. It suggested that the polyclonal antibodies have high specificity and sensitivity. Furthermore, the expressions of AhGPAT9 and AhLPAAT4 proteins at different tissues and different seed developmental stages were determined by Western Blot. This study provided scientific data for the further study ofAhGPAT9 andAhLPAAT4 genes.

peanut; AhGPAT9; AhLPAAT4; prokaryotic expression; polyclonal antibody; Western Blot

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.03.002

S565.2; Q786

A

2017-07-19

2014年國家“萬人計劃”青年拔尖人才；國家花生產業(yè)技術體系項目(CARS-14)；山東省自然科學基金項目(ZR2014YL011；ZR2014YL012)；國家自然科學基金項目(31000728；31200211)；山東省農業(yè)科學院青年科研基金項目(2016YQN14)；青島市應用基礎研究項目(17-1-1-51-jch)；青島市民生計劃項目(14-2-3-34-nsh)；山東農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新項目(CXGC2016B02)；山東省農業(yè)科學院青年英才培養(yǎng)計劃

楊珍(1979-)，女，山東膠南人，山東省花生研究所助理研究員，碩士，研究方向為花生遺傳育種。

*通訊作者：禹山林(1956-)，研究員，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail: yshanlin1956@163.com 遲曉元(1979-)，副研究員，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail: chi000@126.com