劉芳

摘 要：對變異的大腸桿菌ATCC 11105中提取的青霉素G?；傅姆磻?yīng)及其逆反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究和其反應(yīng)常數(shù)的確定，結(jié)果表明，酶會(huì)被過量的青霉素G和兩種產(chǎn)物所抑制。在正反應(yīng)方向的脫酰作用中觀察到6-氨基青霉烷酸（6-APA）的非競爭性抑制和苯乙醛酸的競爭性抑制。逆?；磻?yīng)的最適pH是5.7。此逆反應(yīng)的機(jī)制被研究，底物抑制的影響也被研究，如6-APA，苯乙酸和產(chǎn)物。結(jié)果表明，青霉素G是逆反應(yīng)的混合型抑制劑。版權(quán)為2001 Elsevier科學(xué)股份有限公司所有。

關(guān)鍵詞：青霉素G?；?；單一可逆反應(yīng)；可逆單一反應(yīng)；抑制；動(dòng)力學(xué)；反應(yīng)機(jī)理

中圖分類號：TB 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.34.096

1 簡介

青霉素G?；福≒G?；?，EC3.5.1.11）催化青霉素分子中線性氨鍵水解成β-內(nèi)酰胺分子，6-氨基青霉烷酸（6-APA）和相應(yīng)的羧酸。PG?；赣糜诠I(yè)半合成青霉素和頭孢菌素的6-APA和7-氨基-3-脫酰頭孢菌酸（7-ADCA）的生產(chǎn)過程中。半合成青霉素是在酸性或中性環(huán)境中（pH4.0-7.0）產(chǎn)生，而6-APA和7-ADCA則是在堿性中（pH7.5-8.5）產(chǎn)生。PG?；缚梢岳媒湍?，細(xì)菌或霉菌生產(chǎn)。多數(shù)的PG?；甘怯么竽c桿菌生產(chǎn)的。重組大腸桿菌（如ATCC 31052，11105，21285和14945）消除了一些PG?；干a(chǎn)中遇到的問題如糖和其他碳源的代謝抑制。在多數(shù)的工業(yè)生產(chǎn)過程中，部分純化酶用在細(xì)胞或酶在不同支持物上的固定化。由于產(chǎn)品成本低，細(xì)胞的固定催化會(huì)更有利益。

在間歇和連續(xù)培養(yǎng)的攪拌反應(yīng)器中用固定化青霉素?；负退牟荒苋芙庋苌?，描述為大腸桿菌中PG?；傅姆蛛x和動(dòng)力學(xué)青霉素?；皋D(zhuǎn)化為6-APA。最近的研究包括從大腸桿菌ATCC 11105的變種中提取出的并固定在過氧聚丁二烯-丙烯酸凝膠上青霉素G?；傅姆磻?yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)理，青霉素G?；干锎呋瘎┑奶攸c(diǎn)和應(yīng)用以及工業(yè)上以硅土為載體的青霉素G?；傅臏?zhǔn)備的固定化研究。

在水相中，青霉素G?；笖嚅_青霉素G分子的肽鏈，產(chǎn)生一種羧酸和6-APA。目前，青霉素G?；笩o論是自由的還是固定化的都只有其正反應(yīng)動(dòng)力學(xué)被研究過，至今還沒有關(guān)于其逆反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的報(bào)道，例如6-APA和羧酸在青霉素G?；傅淖饔孟庐a(chǎn)生青霉素G和水的生物催化反應(yīng)。正逆反應(yīng)的研究和因此整個(gè)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的參數(shù)與完成比率的相等的結(jié)論需要用來預(yù)測應(yīng)用在這種酶反應(yīng)的反應(yīng)器的性能。在目前的文章中，研究了正逆反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。底物和產(chǎn)物對反應(yīng)機(jī)理和抑制的影響以及整個(gè)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)都已經(jīng)確定了。

2 材料和方法

2.1 材料和微生物

6-APA從Nakalai Tesque（東京，日本）購買，青霉素G鈉鹽由Jaber Ibn-e-Hayan Pharmaceutical公司（德黑蘭，伊朗）提供。所有試劑都是微生物純或分析純的。分析純的和酶分離與純化的化學(xué)純的試劑是從Merck AG（達(dá)姆施塔特，德國）和Sigma（圣路易斯，澳門）。

大腸桿菌ATCC 11105的變種是由沙里夫技術(shù)大學(xué)（德黑蘭，伊朗）的生化和生物環(huán)境工程研究中心提供的。間歇培養(yǎng)在0.500 L的搖瓶中裝入0.100 L。震動(dòng)設(shè)為250 rpm溫度25℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基組成如下（重量/體積）%：苯乙酸0.20%，酵母膏0.50%，NH4Cl 0.10%，K2HPO4 0.10%， KH2PO4 0.01% 和MgSO4·7H2O0.02%。

2.2 酶分離和純化

大部分細(xì)胞都是菌懸液在轉(zhuǎn)速6000rpm溫度為0-4℃條件下通過40分鐘管狀離心從培養(yǎng)基中分離出來的。細(xì)胞破壁是菌懸液在pH7.8的0.10M的磷酸緩沖液中利用90周波的超聲儀作用90秒。菌懸液經(jīng)過在轉(zhuǎn)速8000rpm溫度為0-4℃條件下通過管狀離心去除細(xì)胞碎片。利用（NH4）2SO4溶液沉淀法使酶液部分純化。酶液在（NH4）2SO4的飽和度為40-60%時(shí)沉淀分離在0.10M、pH7.8的磷酸緩沖液中。溶液滲析后，收集沉淀，利用EDTA-纖維素作進(jìn)一步純化。

2.3 蛋白含量和酶活的測定

利用Lowry法測蛋白含量。用Balasingham法測定PG?；傅谋然盍?，如下。PG?；富盍σ粏挝患?U，指在pH7.8、溫度37℃100mM的磷酸緩沖液中1分鐘分解1μmol的青霉素G轉(zhuǎn)化為6-APA所需的酶量。

3 結(jié)果與討論

3.1 整個(gè)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與平衡常數(shù)

從不同種類的大腸桿菌獲得的PG?；傅拇呋碌那嗝顾氐乃鈺?huì)被底物的高濃度抑制，此反應(yīng)的產(chǎn)物6-APA和苯乙酸（PAA）分別產(chǎn)生非競爭性抑制和競爭性抑制。在PG?；福‥）催化下的青霉素的脫酰化正反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)包括一種底物和兩種產(chǎn)物即6-APA和PAA（Q）。

3.2 正反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)

3.3 正反應(yīng)中底物（青霉素G）抑制的影響

高濃度的青霉素G（30.00， 40.00， 50.00，60.00 和70.00 mM）對底物抑制的影響很明顯，據(jù)研究它也受底物抑制常數(shù)Kia的影響。青霉素G濃度在這樣的范圍（30.00-70.00mM），6-APA的產(chǎn)率會(huì)隨著青霉素G的濃度的增加而降低。這表明了青霉素G在上述濃度范圍內(nèi)的抑制影響。

3.4 正反應(yīng)產(chǎn)物（PAA和6-APA）的抑制影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青霉素G?；笗?huì)產(chǎn)生底物抑制。為了研究產(chǎn)物的抑制影響，分別測定PAA或6-APA的不同量時(shí)的反應(yīng)速率。

缺乏6-APA時(shí)，不同濃度的PAA （0.50，0.75，1.00，1.25mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的截距值，表明了PAA的競爭性抑制。endprint

缺乏PAA時(shí)，研究不同濃度的6-APA （0.20，0.30，0.40，0.50 和0.60mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的抑制影響，在抑制物的缺乏與存在時(shí)，6-APA的非競爭性抑制受到影響。結(jié)果顯示青霉素G的加入可產(chǎn)生兩種產(chǎn)物抑制：首先非競爭性抑制（6-APA）然后是競爭性抑制（PAA）。因此，PG酰化酶催化的青霉素G反應(yīng)是一種有序的單一雙向反應(yīng)。

3.5 逆反應(yīng)的pH最優(yōu)化

正反應(yīng)是在堿性條件（pH=7.8）下的，在青霉素G?；复呋碌?-APA與PAA（酰化）反應(yīng)在酸性條件下。這個(gè)反應(yīng)在一定pH之下才能進(jìn)行，pH是由酶反應(yīng)與6-APA，PAA，青霉素G和酶原之間折中決定的。青霉素G（正反應(yīng)）酶水解的最適pH為7.8，產(chǎn)物的形成和青霉素G和6-APA的退化都可以忽略。在最適pH下，水解時(shí)的緩沖要求會(huì)降低，低的產(chǎn)物抑制影響會(huì)很明顯。眾所周知這種?；磻?yīng)只能在pH5.0到6.0中進(jìn)行。磷酸鹽，檸檬酸鹽和磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液用于pH為4.5，5.0，5.3，5.7和6.0，為了優(yōu)化?；磻?yīng)的pH值和選擇合適的緩沖液類型。產(chǎn)物濃度，青霉素G濃度在反應(yīng)120s中測定1.00mM6-APA和PAA。產(chǎn)生最大量的青霉素G的條件為pH=5.7，100mM檸檬酸鹽緩沖液濃度可得到0.05mM的青霉素G。青霉素G的最高濃度為0.03和0.02mM，條件為pH=5.7由100mM磷酸鹽和磷酸-檸檬酸鹽緩沖液提供。因此，逆反應(yīng)的最優(yōu)條件為用100mM檸檬酸緩沖液構(gòu)建pH=5.7，產(chǎn)物（青霉素G）和反應(yīng)物（6-APA和PAA）對于后續(xù)的反應(yīng)處理要足夠，而且酶反應(yīng)的速率（青霉素G產(chǎn)量最大）也最大。

3.6 逆反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)

研究逆反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)要在兩種不同條件下：在不斷改變的PAA濃度時(shí)測定6-APA的濃度。當(dāng)6-APA濃度改變，逆反應(yīng)的速率方程如等式（4）所示有Segel給出。

不同濃度的PAA（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00mM）的逆反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果即當(dāng)副底物6-APA在不同的固定濃度（2.00，3.00，4.00 和5.00 mM）時(shí)1/v和1/Q成比例。在6-APA或PAA作為變化的底物的兩種不同情況下，其逆反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的結(jié)果都很一致。因此，此可逆反應(yīng)的假設(shè)機(jī)理也很好的符合了這個(gè)以PG?；复呋a(chǎn)生6-APA和PAA的可逆雙向單一反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)資料。

3.7 在可逆反應(yīng)中產(chǎn)物（青霉素G）的抑制影響

低濃度的青霉素G（0.02，0.04，0.06和0.08 mM）用于研究此可逆反應(yīng)中青霉素G的抑制反應(yīng)。較高濃度的青霉素G可能會(huì)導(dǎo)致正反應(yīng)過強(qiáng)。在兩種獨(dú)特的條件下研究這種抑制反映：固定PAA的濃度（2.00mM）改變6-APA的濃度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）和固定6-APA的濃度（2.00mM）改變PAA的濃度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）。測定產(chǎn)生的6-APA（青霉素G的產(chǎn)物）的濃度，利用檸檬酸緩沖液將pH調(diào)制5.7。此變化6-APA濃度的雙向單一可逆反應(yīng)的產(chǎn)物抑制速率平衡方程如等式（6）所示由Segel給出。

反應(yīng)中產(chǎn)物抑制的動(dòng)力學(xué)常數(shù)是由A的不同濃度下和一定的P不飽和濃度下，1/v與1/Q的比值得出的。由P和Q的不飽和濃度得出的Kia和Kma的值。表示青霉素G作為一種混合型抑制劑在PAA不飽和時(shí)與6-APA有關(guān)。飽和的PAA會(huì)掩蓋這種抑制。另一方面，青霉素G是一種在任意6-APA濃度下都與PAA有關(guān)的競爭性抑制劑。飽和6-APA使當(dāng)前的Vmax變?yōu)檎鎸?shí)的Vmax，但當(dāng)前的Kmq依然取決于A。速率比率的常數(shù)是： k1/k-1=0.05； k2/k-2=-1.28； k3/k-3=1.69。從1/A的斜率或1/v軸的截距與抑制物濃度的比值計(jì)算得出的表觀值kis值，此值可以由反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的定義或酶抑制物混合物的不相關(guān)常數(shù)來確認(rèn)。正反應(yīng)和逆反應(yīng)的機(jī)理和它們的比率等式以及動(dòng)力學(xué)常數(shù)可用來分析反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和預(yù)測青霉素G向6-APA轉(zhuǎn)化的酶生化反應(yīng)的表現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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