王 莉，周少嵐，朱 蓉

·論 著·

抗乙酰膽堿3受體抗體與原發(fā)性干燥綜合征相關(guān)性研究

王 莉，周少嵐，朱 蓉

目的探討抗毒蕈堿3型乙酰膽堿受體抗體(a-M3R)在原發(fā)性干燥綜合征(pSS)中的臨床意義。方法通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測pSS組(42例)和疾病對照組(系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者18例)、健康對照組(20例)的抗M3R抗體陽性率；并將pSS組分為抗M3R抗體陽性組和陰性組，分析pSS組中抗M3R抗體陽性患者與陰性患者在臨床及免疫學(xué)等指標(biāo)間的差異與關(guān)系。結(jié)果抗M3R抗體在pSS患者中的陽性率為71.43%，疾病對照組的陽性率為16.67%，健康對照組的陽性率為15.00%，pSS患者陽性率高于疾病對照組和健康對照組(P<0.05)。pSS組抗M3R抗體陽性患者IgG、IgA、RF值及抗SSB抗體陽性例數(shù)較陰性患者明顯增高。隨著唇腺病理分級增高，抗M3R OD值隨之升高。pSS抗M3R陽性患者血液系統(tǒng)受累較陰性患者明顯升高。結(jié)論抗M3R抗體對pSS有一定的輔助診斷價值；抗M3R抗體陽性的pSS患者易合并血液系統(tǒng)病變，唇腺組織機構(gòu)破壞較重。

原發(fā)性干燥綜合征；抗乙酰膽堿3受體抗體；酶聯(lián)免疫吸附法；唇腺

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是一種以侵犯外分泌腺，尤其是唾液腺及淚腺為主的慢性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為口、眼干燥，還可有皮疹、關(guān)節(jié)炎、膽囊炎、胰腺炎、肝臟病變、腎小管病變、肺間質(zhì)纖維化、血液系統(tǒng)受累等腺體外表現(xiàn)[1-2]。pSS的發(fā)病機制目前仍不十分清楚[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)這可能與pSS患者血清中可以找到抗乙酰膽堿3受體(M3受體)的自身抗體有關(guān)[4-5]。本研究旨在探討抗毒蕈堿3型乙酰膽堿受體抗體在原發(fā)性干燥綜合征中的臨床意義，以及與臟器受累、唇腺病理分級的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2014年8-12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院門診及住院治療的42例干燥綜合征患者為pSS組，均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，在征得患者同意后，采集血液及唇腺活檢標(biāo)本。其中男性2例，女性40例，男∶女=1∶20，年齡27～72歲，平均年齡(47±11.81)歲，病程1個月～20年，平均42.86個月，均排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等風(fēng)濕性疾病。選擇同期健康志愿者20例為健康對照組，其中男性4例，女性16例，男∶女=1∶4，年齡23～60歲，平均(44±11.08)歲，肝腎功能檢查均正常。選擇其他結(jié)締組織病組18例(系統(tǒng)性紅斑狼瘡9例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎9例)為疾病對照組，其中男性5例，女性13例，男∶女=1∶2.6，年齡23～74歲，平均(46±13.2)歲，符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)以及1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA)RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，排除繼發(fā)性干燥綜合征。3組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測抗M3受體抗體:取外周靜脈血靜置30 min，以3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清血清，置于-70 ℃冰箱中儲存。實驗前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻，洗滌緩沖液(50×)稀釋，96孔樣品加樣，標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔做復(fù)孔，用標(biāo)本稀釋液1∶1稀釋后加入50 μl于反應(yīng)孔內(nèi)，加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，加入待測樣品50 μl，立即加入50 μl生物素標(biāo)記抗體，蓋上膜板，振蕩混勻，37 ℃溫育1 h，甩去孔內(nèi)液體，加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，然后用吸水紙拍干，再重復(fù)操作3次。每孔加入60 μl親和鏈霉素-HRP，輕輕振蕩混勻，在37 ℃的條件下溫育30 min，甩去孔內(nèi)液體，再次加滿洗滌液，然后振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)操作3次。每孔加入底物A、B各50 μl，輕輕振蕩混勻，在37 ℃條件下溫育10 min，避免光照。于波長450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值，以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y)，相應(yīng)的M-ACHRM3標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，得到相應(yīng)的曲線，根據(jù)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品相應(yīng)的濃度。

1.2.2 唇腺標(biāo)本的采集：采用Daniels[8]推薦的方式，患者仰臥位，絡(luò)合碘消毒下唇內(nèi)側(cè)黏膜部，予2%利多卡因黏膜下麻醉，鋪巾，做一字形橫切口，分離并切取下唇唇腺組織適量，縫合傷口。取出的唇腺組織即刻入10%中性福爾馬林固定。脫蠟、染色、脫水、觀片。將制備好的病理片置于OLYMPUS生物顯微鏡×40下觀察唇腺組織中淋巴細胞浸潤灶，進行病理分級[9]。

1.3 臨床檢查及檢測指標(biāo)：眼科相關(guān)檢查:淚液流率、淚膜破碎時間、角膜染色評分、結(jié)膜染色評分[10]；血清學(xué)檢查:抗核抗體(免疫熒光法)、抗SSA、抗SSB(免疫印跡法)、IgG等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 17.5統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組抗M3R抗體陽性率比較：以健康對照組的抗M3R抗體OD值均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為陽性界定值，判斷3組中抗M3R抗體陽性率，結(jié)果pSS M3R抗體陽性率高于其余兩組(P<0.05),見表1。

表1 各組抗M3R抗體陽性率比較[n(%)]

注：*與pSS組比較，χ2=15.267，P<0.05；#與pSS組比較，χ2=17.328，P<0.05。

2.2 pSS患者抗M3R臨床檢查結(jié)果:pSS組抗M3R抗體陽性患者IgG、IgA較陰性患者明顯升高，P<0.05；pSS組抗M3R抗體陽性患者抗SSB、RF陽性例數(shù)明顯升高，P<0.05，其他均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)，見表2。

表2 pSS患者抗M3R抗體

2.3 光鏡下唇腺病理組織觀察結(jié)果：健康對照組的唇腺組織腺泡、導(dǎo)管飽滿，組織間沒有慢性炎癥細胞浸潤，見圖1(目錄后)；pSS組唇腺組織中可見腺泡結(jié)構(gòu)的破壞，腺泡變性、萎縮甚至消失，漿細胞和淋巴細胞浸潤，腺體導(dǎo)管擴張，導(dǎo)管上皮細胞增生、上皮細胞排列紊亂，導(dǎo)管周圍可見大量淋巴細胞浸潤，聚集成灶，見圖2(目錄后)。42例pSS患者4個級別唇腺病理分級間抗M3R抗體濃度比較，F(xiàn)=3.495，P<0.05，隨著唇腺病理分級增高，抗M3R抗體濃度增高。

2.4 pSS患者抗M3R陽性與臟器受累：42例pSS抗M3R陽性患者血液系統(tǒng)受累較陰性患者明顯升高(P<0.05)，而肺間質(zhì)病變與腎小管酸中毒患者2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 pSS患者抗M3R陽性與臟器受累

3 討論

原發(fā)性干燥綜合征的特點是大多數(shù)患者血清免疫球蛋白升高，存在多種自身抗體。在副交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配的效應(yīng)器上的膽堿受體稱為毒蕈堿型膽堿受體，簡稱M膽堿受體。根據(jù)分子克隆技術(shù)，將M膽堿受體家族分為5種亞型[9]，即M1、M2、M3、M4、M5， M3受體的分布在這5種亞型中最為廣泛，主要分布于副交感神經(jīng)節(jié)后纖維所支配的效應(yīng)器。研究發(fā)現(xiàn)抗M3受體抗體能夠識別并且激活M3受體，并且與之長期結(jié)合。這導(dǎo)致M3受體對乙酰膽堿的敏感性下降，還可以造成M3受體的進行性破壞，最后出現(xiàn)腺體分泌減少、膀胱逼尿肌收縮力減弱等一系列膽堿能神經(jīng)功能異常的表現(xiàn)[11-12]。

本研究表明，健康對照組、疾病對照組的陽性率均明顯低于SS組，說明抗M3R抗體在SS患者中有一定的特異性，對診斷SS有一定的意義。這與國外Bacman[13]等學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。本研究發(fā)現(xiàn)，抗M3R抗體陽性患者的角膜染色評分高于抗體陰性患者，而陽性患者的Schirmer、BUT值低于陰性患者，說明抗M3R抗體陽性患者臨床癥狀比較嚴重。ELISA法發(fā)現(xiàn)陽性組的IgG、RF值以及抗SSB陽性比例高于陰性組。雖然唇腺活檢陽性率在抗M3R抗體陽性組和陰性組間無統(tǒng)計學(xué)意義，但是抗體陽性組淋巴細胞浸潤較陰性組為重，提示抗M3R抗體陽性患者的唇腺浸潤比陰性患者明顯，病情更重?？紤]這些可能是由于抗M3R抗體能競爭性地與位于唾液腺、淚腺腺泡細胞膜上的M3受體結(jié)合，占據(jù)M3受體的結(jié)合位點，導(dǎo)致M3受體對副交感神經(jīng)的遞質(zhì)乙酰膽堿的敏感性降低，并造成M3受體的進行性破壞，M3受體降解，進而影響乙酰膽堿與M3受體而發(fā)揮增加外分泌腺分泌等的M樣效應(yīng)?？筂3R抗體陽性組血液系統(tǒng)受累較陰性組明顯升高，肺間質(zhì)病變、腎小管酸中毒等臟器受累較陰性組無明顯升高。通過以上結(jié)果可以認為抗M3R抗體對評價原發(fā)性干燥綜合征病情嚴重程度有一定意義。至于與其他臟器受累之間的相關(guān)性分析，還需進一步擴大研究對象及臨床觀察指標(biāo)，并在干燥綜合征患者中進行抗M3R抗體的動態(tài)觀察。

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CorrelationstudyonAnti-muscarinic3acetylholinereceptorantibodyandprimarySjgren'ssyndrome

WANGLi,ZHOUShaolan,ZHURong.

DepartmentofRheumatism,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

ObjectiveTo investigate the anti-muscarinic 3 acetylholine receptor antibody (a-M3R) in primary Sjgren’s syndrome ( pSS) clinical significance,and the relationship with organ involvement and with labial gland pathology classification.MethodsThe anti M3R antibody was detected by ELISA in pSS group (42 cases) and control group (18 cases of systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis) and healthy volunteers (20 cases);and the pSS group was divided into Anti M3R antibody positive group and negative group,and analyzed the differences and relationship in clinical and immunological indexes.ResultsThe positive rate of anti M3R antibody in pSS patients was significantly higher than that in the disease control group and the healthy control group (71.43%,16.67% and 15%,P<0.05). In the pSS group,the number of IgG,IgA,RF and anti SSB antibodies in patients with positive anti M3R antibody was significantly higher than that in the negative patients. With the pathological grading of the labial glands increased,the anti M3ROD value increased. The blood system involvement in pSS positive M3R patients was significantly higher than that in the negative patients.ConclusionThe detection of serum anti M3R antibody has certain auxiliary diagnostic value for pSS. The patients with anti M3R antibody positive pSS are prone to complicated with hematological diseases;the patients with high concentration of anti M3R antibodies have severe labial gland destruction in pSS patients.

PrimarySjgren’ssyndrome;Anti-musearinie3acetylholineantibodies;EnzymeLinkedimmunosorbentassay;Lipglands

R 442.8

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0971

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，寧夏 銀川 750004

王莉(1976-)，女，山西籍，碩士研究生，副主任醫(yī)師，從事風(fēng)濕免疫科臨床工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1542.018.html

2017-07-01責(zé)任編輯馬興忠