丁雯瑾，孫 超，桑玉爾，陳梅梅，范建高，袁 濤

環(huán)境新興污染物雙酚A暴露加重非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質代謝異常*

丁雯瑾，孫 超，桑玉爾，陳梅梅，范建高，袁 濤

目的探討在非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）背景下新興環(huán)境污染物雙酚A（BPA）對機體脂質代謝的影響。方法將18只SD大鼠隨機分為正常飲食組、高脂飲食（NAFLD）組和NAFLD/BPA處理組，飼養(yǎng)12 w。采用Western blot法檢測血清和肝組織脂代謝相關蛋白的變化。結果NAFLD組和NAFLD/BPA組肝質量分別為（20.5±2.8）g和（20.9±1.9）g、體質量為（500.1±19.1）g和（511.1±20.5）g、血清甘油三酯分別為（2.5±0.5）mmol/L 和（2.8±0.9）mmol/L、膽固醇為（2.4±0.7）mmol/L 和（2.8±0.6）mmol/L，游離脂肪酸（FFA）分別為（578.6±48.7）mmol/L 和（602.2±50.3）mmol/L，均顯著高于正常組【（15.2±2.3）g、（432.5±13.2）g、（2.0±0.8）mmol/L、（1.0±0.6）mmol/L 和（487.4±14.9）mmol/L，P＜0.05】；與正常組比，NAFLD 組和NAFLD/BPA 組肝組織脂肪酸合成酶（FAS）分別上調了2.45倍和1.91倍，靶基因乙酰輔酶A合成酶（ACS）蛋白表達量分別下降了1.54倍和1.5倍（P＜0.05）。結論BPA的長期攝入可加重機體肥胖，促進血脂異常。

非酒精性脂肪性肝??；雙酚A；脂質代謝；大鼠

雙酚A（bisphenol A，BPA）、鄰苯二甲酸酯和烷基酚是一類新興環(huán)境污染物，亦稱環(huán)境內分泌干擾物，世界衛(wèi)生組織將其定義為：能使內分泌功能發(fā)生變化，從而對個體及子孫或者群體產生有害影響的外因性化學物質或混合物[1-3]。BPA是世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一，不僅產生量大，而且人群暴露途徑多樣，因此對健康的影響較大，而對其研究相對薄弱。有研究證實BPA可以模擬雌激素效應，引起人體內分泌系統(tǒng)功能紊亂，與代謝性疾病、生殖系統(tǒng)疾病和性激素依賴性腫瘤的發(fā)生密切相關[4-7]。成年人暴露于BPA后患肥胖、2型糖尿病及心臟病的幾率增加[8]。國內流行病學調查也發(fā)現(xiàn)中老年人尿BPA濃度與全身型肥胖、腹型肥胖和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）呈正相關[9]。非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病機制尚不明確，通常認為與肥胖、IR、脂質紊亂、2型糖尿病和心血管疾病有關。本研究通過建立NAFLD動物模型，研究長期低劑量BPA暴露大鼠肝組織類固醇調節(jié)因子結合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）表達的變化，以探討在脂肪肝背景下環(huán)境新興污染物BPA與脂質代謝的關聯(lián)，為NAFLD的防治研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器和試劑 4周齡SPF級雄性SD大鼠購自中國科學院上海斯萊克實驗動物有限責任公司【生產許可證號：SCXK（滬）2007-0005】，飼養(yǎng)于清潔級動物房。大鼠飼養(yǎng)實驗室溫度為23±2℃，濕度為50±10%。實行12/12h循環(huán)光線控制。自由攝取食物和水。檢測血甘油三酯（TC）、總膽固醇（TG）和游離脂肪酸（FFA）試劑盒（美國Cell biolabs公司），抗脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）單克隆抗體（美國Santa公司，批號sc-55580），抗靶基因乙酰輔酶A合成酶（anti-acetyl CoA synthetase，ACS）兔多克隆抗體（美國 Abcam公司，批號 ab66038）、抗 SREBP裂解活化蛋白SCP、抗位點1蛋白水解酶（S1P）和抗位點2蛋白水解酶（S2P）兔多克隆抗體（美國Abcam公司，批號分別為 ab140592、ab175191和 ab189797），BPA（國藥集團化學試劑上海有限公司，將其溶解于DMSO中，終濃度不超過1%）。

1.2 動物模型的建立 動物實驗經上海交通大學實驗動物倫理委員會批準并按其實驗動物規(guī)范進行。適應性飼養(yǎng)大鼠1 w，隨機分為正常飲食（ND）組、高脂飲食（HFD，88%普通飼料/10%豬油/2%膽固醇）組和高脂飲食/BPA（HFD/BPA）組，每組6只。讓大鼠經飲水攝入BPA，為保證飲水中BPA含量（100 nmol/l），每2 d換水一次。在第12 w末，處死大鼠后稱量體質量。取出肝臟，稱量質量，計算肝指數（＝肝濕質量/體質量×100%）。

1.3 指標測定 常規(guī)檢測血TC、TG和FFA水平；采用Western blot法檢測肝組織 FAS、ACS、SCP、S1P 和 S2P 蛋白表達：取肝組織，提取總蛋白，蛋白上樣量為50 μg，內參為GAPDH；加樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，待蛋白分離后，將目的蛋白轉至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入 PBST 稀釋的抗 FAS（1：1000）、抗 ACS（1：1000）、抗SCP1（1：1000）、抗 S1P（1：1000）和抗 GAPDH（1：5000）4℃孵育過夜。次日，用PBST洗膜5 min×3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1：3000），室溫孵育 1 h。PBST 洗膜10 min×3次，置膜于暗處，待出現(xiàn)亮條帶，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮PVDF膜包好，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體質量和肝質量的比較 NAFLD組和NAFLD/BPA組大鼠體質量和肝質量明顯重于正常組（P＜0.05），而NAFLD/BPA 組與NAFLD 組比，無顯著差異（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠體質量、肝質量與肝指數（±s）的比較

表1 大鼠體質量、肝質量與肝指數（±s）的比較

與正常組比，①P＜0.05，②P＜0.01

只 肝質量（g） 體質量（g） 肝指數正常組 6 15.2±2.3 432.5±13.2 3.5±0.5 NAFLD 6 20.5±2.8① 500.1±19.1① 4.1±0.3①NAFLD/BPA 6 20.9±1.9① 511.1±20.5② 4.1±0.8①

2.2 大鼠血脂和游離脂肪酸水平比較 見表2。

表2 大鼠血清生化指標（±s）的比較

表2 大鼠血清生化指標（±s）的比較

與正常組比，①P＜0.05，②P＜0.01；與 NAFLD 組比，③P＜0.05

只 TC（mmol/L） TG（mmol/L） FFA（mmol/L）正常組 6 2.0±0.8 1.0±0.6 487.4±14.9 NAFLD 6 2.5±0.5① 2.4±0.7② 578.6±48.7②NAFLD/BPA 6 2.8±0.9①③ 2.8±0.6② 602.2±50.3②③

2.3 大鼠肝組織SREBP相關蛋白表達的變化 與正常組比，NAFLD和NAFLD/BPA組動物肝組織FAS蛋白表達分別增加了2.45倍和1.91倍，而靶基因乙酰輔酶A合成酶（ACS）蛋白量則下調1.54倍和1.5倍（P＜0.05）。與此同時，SREBP裂解活化蛋白SCP、S1P和S2P無顯著變化（圖1）。

圖1 各組肝組織SREBP相關蛋白表達的變化

3 討論

近年來，美國食品藥物管理局（FDA）禁止在奶瓶中使用BPA，使其對人類健康的危害進一步被重視。美國環(huán)境保護局甚至設立BPA日攝入量的最高濃度[10]。BPA是苯酚和丙酮衍生物，多用于罐頭食品和飲料的包裝、瓶類和牙齒填充物所用的密封膠。人群主要通過使用含BPA的包裝物及飲料瓶而廣泛暴露于BPA。本實驗發(fā)現(xiàn)即便是在低濃度下，長期BPA攝入對大鼠的體質量和肝質量仍有影響。

內質網上的膜連接蛋白-SREBP能調節(jié)細胞脂質代謝，影響體內脂質含量的穩(wěn)定。本實驗結果表明，BPA暴露可進一步加重NAFLD大鼠TC和FFA調節(jié)異常。

本研究尚未發(fā)現(xiàn)高脂飲食的兩組動物間與脂代謝相關的蛋白表達存在顯著性差異，產生這種結果的原因可能有以下幾種：①BPA的暴露劑量較低。FDA規(guī)定的BPA安全劑量是 50 μg·kg-1·d-1，本實驗采用的劑量為 100 nmol/l，顯著低于規(guī)定的極限劑量。但即便是低劑量的暴露，SD大鼠已發(fā)生血脂代謝異常；②暴露的時間問題。許多動物實驗證實長期低劑量的BPA攝入仍可發(fā)生許多副作用，若進一步延長實驗終點時間，或許各組蛋白表達量改變會進一步顯著。

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（收稿：2017-02-10）

（本文編輯：陳宗炳）

Changes of lipid metabolism induced by bisphenol A in rats with NAFLD

Ding Wenjin，Sun Chao，Sang Yu’er，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital，Shanghai JiaoTong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Nonalcoholic fatty liver disease；Bisphenol A；Lipid metabolism；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.044

國家自然科學基金資助項目（編號：81400610）；教育部留學回國人員科研啟動基金項目（編號：201404802）；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會青年科研項目（編號：20134Y043）；上海交通大學醫(yī)工交叉研究基金資助項目（編號：YG2016MS72）

200092上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院消化科（丁雯瑾，孫超，桑玉爾，陳梅梅，范建高）；環(huán)境科學與工程學院（袁濤）

丁雯瑾，女，36歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事肝病診斷與治療學研究。Email:wenjin_ding@163.com

袁濤，Email：taoyuan@sjtu.edu.cn