吳紅梅， 郭 宇

(遼寧工業(yè)大學 化學與環(huán)境工程學院， 遼寧 錦州 121001)

谷胱甘肽比率熒光探針分子的設(shè)計合成及其光譜性能

吳紅梅， 郭 宇*

(遼寧工業(yè)大學 化學與環(huán)境工程學院， 遼寧 錦州 121001)

將喹啉和丹磺酰胺兩種熒光基團同時引入配體L1，利用L1與鋅離子自組裝構(gòu)筑三核鋅有機-金屬大環(huán)化合物H-1(比率熒光探針)，實現(xiàn)了對生物分子谷胱甘肽(GSH)的有效識別。利用紫外光譜、熒光光譜、1H NMR、ESI-MS等表征方法研究了H-1對生物分子谷胱甘肽(GSH)的光譜識別作用。紫外滴定光譜表明，當向H-1中加入谷胱甘肽分子后，425 nm處的吸收峰強度降低，320 nm處的吸收峰強度增大，等吸收點為355 nm。利用320 nm處的吸光度值模擬計算平衡常數(shù)，lgK為4.03±0.11，說明H-1與GSH形成了1∶1的包合物。熒光光譜分析表明，當向H-1中加入GSH后，以340 nm光激發(fā)，波長為513 nm處丹磺酰胺的熒光強度下降，并且發(fā)生紅移，而396 nm處喹啉基團的熒光強度增大。利用喹啉基團與丹磺酰胺基團熒光發(fā)射峰強度變化的比值可以精準檢測谷胱甘肽分子，檢測限可達到2.5×10-6mol·L-1。

谷胱甘肽； 比率熒光探針； 三核鋅大環(huán)化合物； 識別

1 引 言

谷胱甘肽(GSH)是一種在細胞內(nèi)含量較高的非蛋白質(zhì)巰基化合物，是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸組成的小分子肽，作為體內(nèi)重要的自由基清除劑和抗氧化劑，能結(jié)合重金屬、自由基等有害物質(zhì)，將其排出體外，在人體中扮演著非常重要的角色。因此，谷胱甘肽含量的變化可與許多疾病相關(guān)聯(lián)，如神經(jīng)組織退化、癌癥、牛皮癬、艾滋病、糖尿病等[1-3]。研究對GSH的識別與傳感，是生物化學和藥物化學領(lǐng)域的重要課題，可以為眾多疾病的致病性檢測提供前提，進而可以更充分地了解疾病的發(fā)生、發(fā)展等特點，為靶向性治療疾病提供有力幫助。

近年來，檢測GSH的方法主要有液相色譜[4]、量子點[5]、電化學[6]、有機小分子熒光探針[7-9]等，它們應用了GSH分子含有巰基(—SH)的特征，通過與巰基發(fā)生特殊反應而實現(xiàn)的。但這些方法在樣品處理、運行時間、參數(shù)測定等方面具有局限性。熒光光譜檢測法可以根據(jù)熒光參數(shù)(熒光強度、波長、壽命等)的變化實現(xiàn)對微觀現(xiàn)象的響應，并將微觀信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暬墓庑畔⒈磉_出來，具有光和化學穩(wěn)定性強、簡便快捷、靈敏度高的優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標分子的實時監(jiān)測，在臨床醫(yī)學、化學、生物學、環(huán)境等領(lǐng)域已得到廣泛應用[10-13]。特別是利用有機-金屬大環(huán)結(jié)構(gòu)良好的主客體化學性能[14-15]，通過大環(huán)結(jié)構(gòu)開放的窗口、特定形狀和尺寸的空腔，能夠允許特定結(jié)構(gòu)的生物分子進入空腔，通過限域的空腔、靜電作用、氫鍵等協(xié)同作用實現(xiàn)對目標分子的高靈敏度識別[16-17]。然而，傳統(tǒng)的熒光探針根據(jù)單一發(fā)射波長處熒光強度的變化來檢測目標分子，會受到熒光探針分子在微環(huán)境中的濃度、檢測環(huán)境(粘度、溫度、pH等)、儀器設(shè)備、光源強度的波動、穩(wěn)定性等影響，不易控制檢測結(jié)果的精確度。比率熒光探針是用兩個熒光團的發(fā)射峰強度的比值作為檢測信號，在同一檢測環(huán)境下受干擾的誤差可相互抵消，比值不受影響，因此可以得到更加精準的檢測結(jié)果，不僅有利于分析對客體的識別作用，還可以增加對客體識別的靈敏度和選擇性響應范圍[18-19]。

本文利用含有喹啉和丹磺酰胺雙熒光基團的配體L1(N-(3，5-雙(2-((2-奎啉亞甲基)甲酰肼基))苯基)-5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰胺)與鋅離子自組裝構(gòu)筑有機-金屬三元大環(huán)化合物H-1(比率熒光探針)，利用紫外光譜、熒光光譜、1H NMR、ESI-MS等表征方法研究了H-1對生物分子谷胱甘肽(GSH)的光譜識別作用。

2 實 驗

2.1儀器與藥品

儀器：熒光光譜測定使用Edinburgh instruments FS-920穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀；紫外光譜測定使用HP8453紫外可見光譜儀；電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)使用HPLC-Q-Tof MS 型質(zhì)譜儀測定，甲醇為流動相；紅外光譜使用Nicolet NEXUS670FT-IR光譜儀測定；C、H、N元素分析使用Vario EL Ⅲ元素分析儀；1H NMR使用Varian INOVA400核磁共振譜儀(TMS為內(nèi)標)。

藥品：丹磺酰氯、2-喹啉甲醛、水合肼、三乙胺、5-氨基間苯二甲酸、氯化亞砜、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、冰醋酸、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇。

2.2實驗過程

2.2.1配體L1的合成

合成過程主要包含以下4步，如圖1所示：(1)在5-氨基間苯二甲酸(1mmol，0.18g)的水溶液中滴加1mmol三乙胺使其溶解，然后利用恒壓漏斗將溶解在10mL丙酮中的丹磺酰氯(1mmol，0.27g)逐滴加入裝有5-氨基間苯二甲酸的燒瓶中，室溫攪拌24h，除去丙酮，用鹽酸將剩下溶液的pH值調(diào)至3左右。再用乙酸乙酯進行萃取，有機相用無水Na2SO4干燥，除去溶劑，得到淡黃色固體，即化合物1。(2)稱取化合物1(4.83mmol，2g)放入燒瓶中，加入100mL左右的甲醇，然后用恒壓漏斗逐滴加入過量的SOCl2，室溫攪拌24h，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水Na2SO4干燥，除去溶劑，得到黃色粉末，即化合物2。(3)稱取化合物2(4.52mmol，2g)放入燒瓶中，加入110mL左右的乙醇溶液及過量的水合肼(80%)，回流24h，冷卻后得到黃色固體，即化合物3。(4)稱取化合物3(4.52mmol，2g)放入燒瓶中，加入110mL左右的甲醇，再向其中加入2-喹啉甲醛(9.50mmol，1.02g)，滴加5-6滴冰醋酸，回流24h，產(chǎn)物為淺黃色固體，得到配體L1，產(chǎn)率為76.9%。1H NMR (d6-DMSO)δ：2.80(s，6H，HCH3)，7.3(d，1H，J=6.8Hz)，7.70(s，4H，J=7.2Hz)，7.85(d，2H，J=10.4Hz)，8.11(m，5H，J=31.6Hz)，8.22(d，2H，J=8.4Hz)，8.33(d，1H，J=6.4Hz)，8.40(d，1H，J=8.8Hz )，8.50(t，3H，J=17.6Hz)，8.59(s，2H)，11.29(s，1H，HSO2NH)，12.43(s，2H，HCONH)。元素分析: L1(C40H32N8O4S·3H2O)：C62.00，H4.94， N14.46；Found：C62.13，H4.86， N14.47。 IR (KBr 壓片，cm-1)ν：738(w)，790(w)，1016(w)，1140(s)，1320(m)，1428(w)，1503(m)，1599(m)，1669(m)，3249(w)，3437(s)。ESI-MSm/z：755.1([L1+Cl-])，719.2([L1-H+])。

圖1 配體L1的合成路線

2.2.2有機-金屬(鋅)配合物H-1的合成

稱取L1(0.30mmol，186.2mg) 和Zn(NO3)26H2O(0.30mmol，89.2mg)溶解在15mL CH3CN/CH3OH (2∶8)溶液中，攪拌30min，再向其中加入過量的NH4PF6，沉淀得到淡黃色固體。ESI-MS測試見圖2所示，從圖中可以觀察到3個峰，在1176.974處的信號對應于物種[Zn3(L1)3-4H+]2+(m/zcalcd:1176.974)；在785.3582處的信號對應于物種[Zn3(L1)3-3H+]3+(m/zcalcd:785.3582)；在721.2189處的信號對應于物種[ L1+H+]+(m/zcalcd:721.2189)。

圖2 H-1的ESI-MS，溶劑為DMF。

圖3 三核鋅有機-金屬大環(huán)H-1的分子結(jié)構(gòu)示意圖

配合物H-1的結(jié)構(gòu)：Zn2+與 L1通過雙三齒配位點O、N、N單元配位，形成三核鋅金屬-有機三元大環(huán)配合物H-1，如圖3所示。

2.3紫外光譜滴定

向比色皿中加入2mL10μmol/L 有機金屬大環(huán)H-1的H2O/DMF(體積比1∶9)溶液，分別用谷胱甘肽(GSH)及其組成氨基酸(半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu))的DMF溶液滴定，測定H-1對谷胱甘肽及其組成氨基酸響應的紫外吸收光譜。

2.4熒光光譜滴定

在石英比色皿中加入2mL10μmol/L 有機金屬大環(huán)H-1的H2O/DMF(體積比1∶9)溶液，向其中逐步滴加谷胱甘肽的DMF溶液直至飽和，用340nm的光激發(fā)，測定350～700nm的熒光發(fā)射光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1H-1對谷胱甘肽(GSH)紫外光譜測試

圖4(a)為H-1對谷胱甘肽(GSH)的紫外響應光譜，當向H-1(10μmol/L)中加入GSH后，425nm處的吸收峰減弱，320nm處吸收峰的強度增加，等吸收點為355nm。通過紫外光譜滴定，以320nm處的吸光度值A(chǔ)320為基準，利用Oringin軟件線性擬合計算平衡常數(shù)K，如圖4(b)所示。

圖4(a)向H-1中加入谷胱甘肽的紫外吸收光譜；(b)λ=320nm處吸收的平衡常數(shù)計算線性擬合圖。

Fig.4UV-Vis titration spectra (a) and the linear fitting of the UV-Vis titration at320nm (b) of H-1upon the addition of GSH

圖5向H-1中加入谷胱甘肽組成氨基酸的紫外吸收光譜。 (a) 半胱氨酸；(b) 甘氨酸；(c) 谷氨酸;(d)在H-1中分別加入2倍的谷胱甘肽、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸時，吸光度(A320)的比較圖;(e)向配體L1中加入谷胱甘肽的紫外響應光譜。

Fig.5UV-Vis titration spectra of H-1in the presence of Cys (a), Gly (b), Glu (c), respectively. (d)The absorbance at320nm of H-1obtained by adding two times of GSH, Cys, Gly, Glu, respectively. (e) UV-Vis titration spectra of L1upon addition of GSH.

具體計算過程如下：

(1)

其中，K為平衡常數(shù)，A0為單純大環(huán)化合物H-1的吸光度值，Al為加入過量GSH的最大吸光度值，A為在加入一定量濃度為C0的GSH后的吸光度值，n為加入谷胱甘肽的倍數(shù)。

為了清晰地理解H-1識別GSH的過程，又分別測試了H-1對組成GSH的氨基酸(半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu))的紫外響應及單純配體L1對GSH的紫外光譜，見圖5。H-1對半胱氨酸(Cys)也有良好的紫外響應，與向H-1中加入GSH時具有相同的光譜變化，加入2倍時體系平衡，如圖5(a)所示。利用320nm處的吸光度值A(chǔ)320，模擬計算平衡常數(shù)，結(jié)果證明H-1與Cys是1∶2包合關(guān)系，平衡常數(shù)(lgKCys)為8.12±0.10；當向H-1中分別加入10倍谷氨酸(Glu)和10倍甘氨酸(Gly)時，響應很弱，如圖5(b)和(c)所示。圖5(d)為向單純配體H-1中分別加入2倍GSH、Cys、Gly、Glu時的紫外吸收光譜比較圖。圖5(e)為向單純配體L1中加入GSH的紫外光譜變化，從圖中可以看出L1對GSH無響應。以上測試結(jié)果證明H-1對谷胱甘肽的響應除了三核鋅有機-金屬大環(huán)H-1所提供的靜電、配位、幾何學和類似籠狀的功能外，還有組成谷胱甘肽的半胱氨酸(—SH)與有機-金屬大環(huán)的氫鍵作用。

3.2H-1對谷胱甘肽響應的熒光光譜

三核鋅大環(huán)化合物H-1結(jié)構(gòu)中含有丹磺酰胺和喹啉兩種熒光基團，可以作為比率熒光探針對GSH進行識別檢測。當向H-1中加入GSH后，以340nm光激發(fā)，丹磺酰胺在波長為513nm處的熒光強度下降，并且發(fā)生紅移；此時，喹啉基團在396nm處的熒光強度隨之升高，如圖6所示。這主要是由于丹磺酰胺熒光基團的發(fā)射過程是一個從單線態(tài)到三線態(tài)過程，所以被激發(fā)后將自身三線態(tài)的能量傳遞給喹啉基團，導致隨著GSH的加入，丹磺酰胺基團的熒光強度下降、喹啉基團的熒光強度增大。F396和F513分別為喹啉基團和丹磺酰胺的特征峰發(fā)射強度，利用F396/F513的比值可以實現(xiàn)H-1對谷胱甘肽的比率檢測，檢測限可達到2.5×10-6mol·L-1。由圖7可以看出，隨著谷胱甘肽加入量的增加，F(xiàn)396/F513的比值升高，直至平衡。上述測試結(jié)果證明，金屬有機大環(huán)H-1對GSH的識別過程除了大環(huán)化合物的限域作用外，還有包合在H-1內(nèi)部的GSH與H-1上的丹磺酰胺相連的—NH基團和底部三元環(huán)的酰胺基團之間的相互作用。

圖6 向H-1加入GSH的熒光滴定曲線

Fig.6Fluorescence titration spectra of H-1in the presence of GSH

圖7 GSH的加入量與F396/F513的比值關(guān)系圖

Fig.7Relationship between the addition amount of GSH andF396/F513

4 結(jié) 論

本文利用具有比率熒光特性的三核鋅有機-金屬三元大環(huán)仿生系統(tǒng)研究了其對生物分子谷胱甘肽的識別作用。結(jié)果表明，H-1能夠1∶1包合谷胱甘肽，平衡常數(shù)lgK為4.03±0.11；通過H-1空腔的限域作用、GSH與H-1氫鍵作用，實現(xiàn)了對GSH的比率熒光檢測，即加入GSH后丹磺酰胺基團的熒光波長發(fā)生紅移，且熒光強度下降、喹啉基團的熒光強度增大。以喹啉基團與丹磺酰胺基團熒光發(fā)射強度的比值為信號精準檢測谷胱甘肽分子，具有誤差小、靈敏度高的優(yōu)點。

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SynthesisofRatiometricFluorescentProbeforTheRecognitionofGlutathione

WUHong-mei,GUOYu*

(SchoolofChemicalandEnvironmentalEngineering,LiaoningUniversityofTechnology,Jinzhou121001,China)

Two fluorescent groups of quinoline and dansylamide were introduced into ligand L1together, and a trinuclear zinc metal-organic compound H-1as a ratiometric fluorescent probe was self-assembled by L1and zinc ion, and the sensitive recognition of γ-glutamyl-cysteinyl-glycine (GSH) was realized by H-1. The recognition process was studied by UV-Vis, fluorescence spectra,1H NMR and ESI-MS. UV-Vis adsorption titration results show that the addition of GSH to the solution of H-1causes a significant absorbance decrease at425nm and an obvious absorbance increase at320nm. The isobestic point is355nm. The equilibrium constant lgKof4.03±0.11is obtained with the absorbance value at320nm. This indicates that1∶1stoichiometric host-guest complexation of H-1for GSH is formed. The fluorescence spectra show that the addition of GSH to the solution of H-1causes an obvious dansyl-based fluorescence decrease at513nm upon excitation at340nm with a significant red-shift, and an increase of quinoline-based fluorescence at396nm. The ratio of dansyl-based fluorescence to quinoline-based fluorescence can be used to detect GSH and the detection limit is up to2.5×10-6mol·L-1.

glutathione (GSH); ratiometric fluorescent probe; trinuclear zinc metal-organic compound; recognition

2017-05-10；

2017-07-26

國家自然科學基金(21601075)； 遼寧省自然科學基金(2015020249)資助項目

Supported by National Natural Science Foundation of China (21601075); Natural Science Foundation of Liaoning Province (2015020249)

1000-7032(2017)12-1561-06

O433.5

A

10.3788/fgxb20173812.1561

*CorrespondingAuthor,E-mail:guoyulnut@163.com

吳紅梅(1979-)，女，遼寧阜新人，博士，副教授，2009年于大連理工大學獲得博士學位，主要從事熒光探針的設(shè)計及分子識別方面的研究。E-mail: wuhongmei@lnut.edu.cn

郭宇(1981-)，男，遼寧沈陽人，博士，副教授，碩士研究生導師，2010年于大連理工大學獲得博士學位，主要從事功能膜材料和光電材料的設(shè)計及應用方面的研究。E-mail: guoyulnut@163.com