， ， ， ， ， (河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院， 河北 昌黎 066600)

納米材料鉬對(duì)大豆子葉節(jié)誘導(dǎo)的影響

張華雪1，張煒坤1，趙恢1，張小芳1，東方陽(yáng)1，李桂蘭1
(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院， 河北 昌黎 066600)

為提高大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化效率，以豫豆22為試驗(yàn)材料，研究不同濃度(0，20，40，60 mol/L)納米材料鉬(Mo)對(duì)大豆子葉節(jié)的影響。結(jié)果表明，納米材料鉬對(duì)出芽、抽莖和生根都有促進(jìn)作用，在0～40 mol/L范圍內(nèi)隨著濃度的升高逐漸增加，40 mol/L時(shí)達(dá)到最大值，出芽率、抽莖率和生根率分別比對(duì)照提高了13.54%、13.18%和11.96%；在60 mol/L時(shí)，3項(xiàng)指標(biāo)均下降，出芽率仍顯著高于對(duì)照，抽莖率降至與對(duì)照無(wú)顯著差異，生根受到抑制，生根率下降了4.76%，顯著低于對(duì)照。因此，在0～40 mol/L濃度范圍內(nèi)，向培養(yǎng)基中添加納米材料鉬可以提高大豆子葉節(jié)的誘導(dǎo)效果。

納米材料； 鉬； 大豆子葉節(jié)

大豆(Glycinemax(L.)Merr.)起源并馴化于我國(guó)，是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物[1]。目前，通過(guò)基因工程改良大豆的品質(zhì)是重要的育種手段[2-3]。大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法是獲得轉(zhuǎn)基因大豆的重要方法之一，但大豆在全球范圍內(nèi)被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)化效率極低的農(nóng)作物[4-5]，有報(bào)道其子葉節(jié)轉(zhuǎn)化效率大概在0.03%～6%之間[6]。大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化率低有2個(gè)主要原因，第1個(gè)是子葉節(jié)分化的速率比較低，第2個(gè)則是難以伸長(zhǎng)[7]，因此，如何提高大豆子葉節(jié)分化的速率是提高轉(zhuǎn)化效率的必要條件之一。

納米材料是指特征尺寸在1～100 nm之間的極細(xì)顆粒組成的固體材料。作為一種新型材料，納米材料已被廣泛應(yīng)用在電子學(xué)領(lǐng)域、光學(xué)領(lǐng)域、化工領(lǐng)域等。目前，納米材料已逐步應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域中，有研究結(jié)果顯示，納米材料在一定濃度下，具有促進(jìn)種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用，但隨著納米材料濃度的不斷增加，對(duì)植物生長(zhǎng)則出現(xiàn)抑制作用[8]。關(guān)于這類報(bào)告，目前國(guó)內(nèi)外已有眾多相關(guān)研究結(jié)果[9-13]。鉬是植物體內(nèi)固氮菌中鉬黃素蛋白酶的主要成分之一，也是植物硝酸還原酶的主要成分之一，還能激發(fā)磷酸酶活性，促進(jìn)作物內(nèi)糖和淀粉的合成與輸送，有利于作物早熟。關(guān)于納米材料鉬對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育的影響在國(guó)內(nèi)的報(bào)道很少。本研究以種植廣泛的大豆品種豫豆22為試驗(yàn)材料，通過(guò)在大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)時(shí)添加不同濃度的納米材料鉬，研究納米材料鉬對(duì)大豆子葉節(jié)出芽、抽莖以及生根的影響，以期明確大豆子葉節(jié)分化，伸長(zhǎng)時(shí)所使用納米材料鉬的最佳濃度，為提高大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材 料

豫豆22大豆種子(河南省農(nóng)科院提供)；納米材料鉬(OD為50 nm，購(gòu)自于北京德科島金)。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用B 5為大豆組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

1) 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：B 5基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%瓊脂，pH=5.8。

2) 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：B 5基本培養(yǎng)基+0 mg/L納米鉬/20 mg/L納米鉬/40 mg/L納米鉬/60 mg/L 納米鉬+1.7 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%瓊脂，pH=5.8。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子的滅菌與無(wú)菌苗的獲得

選取種皮完整無(wú)病斑蟲(chóng)害，色澤光亮且飽滿的成熟大豆種子作為試驗(yàn)材料，用氯氣熏蒸法進(jìn)行消毒：首先將挑選的大豆種子放置到干燥的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿不加蓋，然后將裝有大豆種子的培養(yǎng)皿放入到干燥的容器內(nèi)，在干燥容器內(nèi)放入裝有100 mL次氯酸鈉的小燒杯，沿?zé)诰徛尤?0 mL濃鹽酸,迅速蓋上干燥容器蓋，整個(gè)操作過(guò)程在通風(fēng)廚中進(jìn)行，滅菌12～16 h。將消完毒的種子接種到事先滅好菌的種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，放到培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)4～5 d。培養(yǎng)室溫度控制在22～24 ℃，晝夜光照時(shí)間為16 h/8 h。

1.2.2 子葉節(jié)的獲得和再生培養(yǎng)

大豆在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 d后，選擇生長(zhǎng)健壯，無(wú)病菌、無(wú)污染剛剛萌發(fā)變綠的大豆，剝凈大豆種皮，用解剖刀沿縱向線切開(kāi)，切除胚根以及腋芽，保留子葉和3～5 mm的上胚軸，獲得大豆子葉節(jié)。將獲得的大豆子葉節(jié)接種到添加不同濃度納米鉬的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此過(guò)程必須在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行操作，防止子葉節(jié)被污染，生長(zhǎng)所需溫度為22～24 ℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

從子葉節(jié)接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基之日起，每隔5 d記錄發(fā)芽數(shù)、抽莖數(shù)和生根數(shù)。統(tǒng)計(jì)大豆子葉節(jié)的出芽率、抽莖率、生根率。

出芽率(%)=總發(fā)芽數(shù)/總外植體數(shù)×100%；

抽莖率(%)=總抽莖數(shù)/總外植體數(shù)×100%；

生根率(%)=總生根數(shù)/總外植體數(shù)×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，向培養(yǎng)基中添加納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)的出芽率、抽莖率和生根率都有影響。

2.1 不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)出芽率的影響

芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中納米鉬濃度在20，40 mg/L和60 mg/L時(shí)，對(duì)大豆子葉節(jié)的出芽率都有提高作用，分別比對(duì)照提高了13.4%、17.7%和12.7%，均達(dá)到顯著差異水平。其促進(jìn)作用趨勢(shì)從20 mol/L到40 mol/L逐漸增加，40 mol/L到60 mol/L有所減少。當(dāng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中納米鉬的濃度為40 mg/L時(shí)，大豆子葉節(jié)的出芽率為89.87%，達(dá)到最高，與對(duì)照的差異極顯著。說(shuō)明在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入適量的納米鉬有利于提高大豆子葉節(jié)的出芽，40 mol/L為最佳濃度(表1)。

表1 不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)出芽率的影響

濃度(mg/L)出芽率(%)差異顯著性;5%;1%ck76．33±1．42cB2086．59±1．92bAB4089．87±2．68aA6086．05±1．68bB

大豆子葉節(jié)在添加不同濃度納米鉬的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，尤其是前期，子葉節(jié)的出芽率比較快(圖1)。大豆子葉節(jié)的出芽率在處理前30 d中每隔5 d相比之前增加5%～10%，且增加速率平穩(wěn)，30 d時(shí)出芽率達(dá)到最高峰，30～35 d時(shí)，各處理之間出芽率基本趨于穩(wěn)定。在整個(gè)子葉節(jié)培養(yǎng)過(guò)程中，20，40 mg/L和60 mg/L 3種濃度納米鉬處理液對(duì)大豆子葉節(jié)的出芽率平均效果高于對(duì)照組，20 mg/L和60 mg/L納米鉬處理液對(duì)子葉節(jié)的出芽速率基本一致，40 mg/L納米鉬處理對(duì)大豆子葉節(jié)的出芽率明顯高于各處理組。試驗(yàn)結(jié)果表明：添加一定濃度的納米鉬，可以促進(jìn)大豆子葉節(jié)的出芽，提高出芽率，其中納米鉬的濃度為40 mg/L時(shí)，對(duì)大豆子葉節(jié)出芽率有顯著提高作用。

圖1 不同濃度納米鉬在不同時(shí)期對(duì)大豆子葉節(jié)出芽率的影響

2.2 不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)抽莖率的影響

當(dāng)培養(yǎng)基中納米鉬濃度為40 mg/L時(shí)，大豆子葉節(jié)的抽莖率為78.72%，與對(duì)照(65.54%)之間存在顯著差異，且抽莖率高于對(duì)照組，20 mg/L和60 mg/L的納米鉬對(duì)子葉節(jié)的抽莖率均與對(duì)照之間無(wú)顯著差異(表2)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中納米鉬的濃度為20 mg/L和60 mg/L時(shí)，對(duì)大豆子葉節(jié)的抽莖無(wú)顯著作用，40 mg/L時(shí)對(duì)大豆子葉節(jié)的抽莖有顯著促進(jìn)作用。

表2 不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)抽莖率的影響

濃度(mg/L)抽莖率(%)差異顯著性;5%;1%ck65．54±1．98bB2068．23±2．43bB4078．72±1．76aA6067．96±2．21bB

2.3 不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)生根率的影響

20，40 mg/L和60 mg/L納米鉬處理的子葉節(jié)生根率與對(duì)照處理的子葉節(jié)生根率均存在顯著差異(表3)。20 mg/L和40 mg/L納米鉬處理的子葉節(jié)的生根率均高于對(duì)照組處理，而60 mg/L納米鉬處理的子葉節(jié)的生根率小于對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果表明，納米鉬的濃度在0～40 mg/L范圍內(nèi)，子葉節(jié)的生根率逐漸增大，即納米鉬的濃度在0～40 mg/L范圍內(nèi)，可以促進(jìn)大豆子葉節(jié)生根；當(dāng)納米鉬的濃度為60 mg/L時(shí)，子葉節(jié)的生根率低于對(duì)照組，即納米鉬的濃度達(dá)到60 mg/L時(shí)，對(duì)子葉節(jié)生根有抑制作用。

表3 不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)生根率的影響

濃度(mg/L)生根率(%)差異顯著性;5%;1%ck78．74±2．14bB2085．36±2．17aA4090．70±5．37aA6073．98±4．76cC

3 討 論

目前關(guān)于納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)的影響眾說(shuō)紛紜，正負(fù)效應(yīng)以及無(wú)影響的結(jié)果均有報(bào)道[14]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有研究表明，納米材料在水稻、玉米、番茄、豌豆等作物的種子萌發(fā)及生長(zhǎng)方面起到了促進(jìn)作用[15-17]。其中對(duì)單壁碳納米管研究表明，40 mg/L單壁碳納米管可以促進(jìn)大豆子葉節(jié)分化速率，并且生長(zhǎng)勢(shì)比對(duì)照組也有顯著提高的效果；10～40 mg/L單壁碳納米管對(duì)番茄的出芽率有顯著提高的作用，但對(duì)黃瓜的生根卻有抑制作用[18]。Mall[19]等發(fā)現(xiàn)納米材料TiO2可以促進(jìn)作物的伸長(zhǎng)，對(duì)作物的產(chǎn)量有顯著提高，郭莉等[20]發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi),納米TiO2對(duì)豌豆萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)起促進(jìn)作用,表現(xiàn)出了較高的生物活性，當(dāng)超出濃度范圍時(shí)，納米TiO2對(duì)豌豆萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)主要針對(duì)納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)誘導(dǎo)的影響進(jìn)行研究，研究結(jié)果也顯示出不同濃度對(duì)大豆子葉節(jié)出芽、抽莖和生根或促進(jìn)或抑制，作用不等，且在納米鉬的濃度達(dá)到40 mol/L時(shí)的促進(jìn)效果最佳，與其他處理間差異顯著。綜合研究發(fā)現(xiàn)，納米材料在大豆遺傳轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用是一項(xiàng)完全不同于傳統(tǒng)措施的新技術(shù)，而且影響植株遺傳轉(zhuǎn)化與不同納米材料的形態(tài)特征、濃度和植株本身特性都有一定關(guān)系。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)以豫豆22為材料，研究不同濃度納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)發(fā)芽率、抽莖率和生根率的影響。在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加一定濃度的納米鉬對(duì)大豆子葉節(jié)的出芽率、抽莖率和生根率都有不同程度的提高，在納米鉬濃度為40 mol/L時(shí)均達(dá)到最佳水平。

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Effect of Nano Materials Molybdenum on Induction of Soybean Cotyledonary Node

ZHANGHuaxue1，ZHANGWeikun1，ZHAOHui1，ZHANGXiaofang1，DONGFangyang1，LIGuilan1
(Life Science and Technology College,Hebei Normal University of Technology,Changli Hebei 066600，China)

To improve the transformation efficiency of soybean cotyledonary node,different concentration nano materials of molybdenum(Mo) were conducted to study the effects of soybean cotyledonary node of Yudou 22.The results show that the nano materials of molybdenum have a promoting effect on budding,pumping stems and rooting which gradually increased with the increase of concentration during 0-40 mol/L,and the 40 mol/L of concentration reached the maximum,the budding rate,pumping stems rate and rooting rate improve by 13.54%,13.18% and 11.96% respectively.The three index have declined at 60 mol/L,budding rate was significantly higher than control,pumping stems rate dropped to no significant differences compared with control,root was restrained,rooting rate dropped by 4.76% and significantly lower than control.Therefore,adding nano materials of molybdenum at 0-40 mol/L into the culture medium can improve the induction effect of soybean cotyledon node.

nano materials； molybdenum(Mo)； soybean cotyledonary node

2017-01-09

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014 ZX 0800404 B)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C 2014407051；C 2016407100)。

張華雪(1990—)，女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市人；碩士研究生，研究方向：遺傳學(xué)；E-mail:191798470@qq.com。

東方陽(yáng)，男，博士，教授，研究方向：分子遺傳；E-mail:yang_dongfang@hotmail.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.045

S 565.1

A

1001-4705(2017)07-0045-04