朱齊春 鄭 嬌 張 靜 劉賢德 王志勇 蔡明夷

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門 361021)

眼斑擬石首魚(yú)重復(fù)DNA序列的染色體定位

朱齊春 鄭 嬌 張 靜 劉賢德 王志勇 蔡明夷

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門 361021)

針對(duì)眼斑擬石首魚(yú)Sciaenops ocellatus染色體標(biāo)記匱乏的問(wèn)題, 利用熒光原位雜交(FISH)定位了眼斑擬石首魚(yú)的18S rDNA、5S rDNA和端粒序列。結(jié)果顯示, 眼斑擬石首魚(yú)的核型公式為2n=48t; 僅有1對(duì)18S rDNA位點(diǎn), 位于第1對(duì)染色體的次縊痕部位; 有2對(duì)5S rDNA位點(diǎn), FISH信號(hào)強(qiáng)度不等, 強(qiáng)信號(hào)位于第8對(duì)染色體的近著絲粒端, 弱信號(hào)位于第3對(duì)染色體的臂間。端粒FISH信號(hào)出現(xiàn)于所有染色體的兩端, 但表現(xiàn)出染色體兩端信號(hào)不平衡的特點(diǎn), 著絲粒端FISH信號(hào)明顯強(qiáng)于遠(yuǎn)端信號(hào)。這一特點(diǎn)為判定染色體的方向提供了便利。結(jié)合其他石首魚(yú)的核型數(shù)據(jù)可以推斷, 2n=48t的核型及單對(duì)近著絲粒分布的18S rDNA位點(diǎn)是石首魚(yú)的共同祖征; 在石首魚(yú)進(jìn)化過(guò)程中, 曾發(fā)生活躍但不影響宏觀核型的小規(guī)模重排。研究結(jié)果豐富了眼斑擬石首魚(yú)染色體的辨識(shí)標(biāo)記, 并為研究石首魚(yú)染色體進(jìn)化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

眼斑擬石首魚(yú); 核型; 染色體; 熒光原位雜交; 核糖體DNA; 端粒

染色體是遺傳物質(zhì)的載體。染色體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征是研究真核生物的基因組結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生、進(jìn)化、分類和育種的重要資料。1970年以來(lái),魚(yú)類染色體核型數(shù)據(jù)不斷積累, 至今報(bào)道過(guò)核型的魚(yú)類大約有3425種或亞種, 約占現(xiàn)存魚(yú)類的12.2%[1,2]。近年來(lái), 分子克隆、PCR和熒光原位雜交等新技術(shù)逐步應(yīng)用于魚(yú)類染色體研究, 極大地拓展了魚(yú)類染色體研究?jī)?nèi)容和深度。

眼斑擬石首魚(yú)(Sciaenops ocellatus), 也稱紅姑魚(yú)或黑斑紅鱸, 屬鱸形目, 石首魚(yú)科, 擬石首魚(yú)屬,主要分布在從新澤西到佛羅里達(dá)的大西洋和墨西哥灣沿岸。1991年引入我國(guó), 因其抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、適溫和適鹽性廣、存活率高、耐低溫, 非常適合高密度養(yǎng)殖, 很快成為我國(guó)重要海水養(yǎng)殖魚(yú)類[3,4]。尤鋒等[3]和王曉艷等[5]分別分析了眼斑擬石首魚(yú)的核型(2n=48t, NF=48), 并將核仁組織區(qū)(NOR)定位于1號(hào)染色體的近著絲粒區(qū), 但目前尚未見(jiàn)FISH定位相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步揭示眼斑擬石首魚(yú)的核型特征, 本研究應(yīng)用FISH技術(shù)在眼斑擬石首魚(yú)染色體上定位18S rDNA、5S rDNA和端粒序列3種重復(fù)序列, 以期為眼斑擬石首魚(yú)的染色體識(shí)別提供穩(wěn)定有效的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記, 也為石首科魚(yú)染色體進(jìn)化研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品和染色體制備

用于制備染色體的眼斑擬石首魚(yú)雌雄各5尾,購(gòu)自福建省寧德市金鈴水產(chǎn)有限公司。魚(yú)體注射秋水仙堿和植物血凝素后, 取頭腎細(xì)胞制備染色體,具體的操作方法按陳紫瑩所描述的方法[6]。同時(shí)采集眼斑擬石首魚(yú)的鰭條固定于無(wú)水乙醇中備用。

1.2 探針制備

用DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)從無(wú)水乙醇固定的鰭條中提取全基因組DNA。18S rDNA部分編碼序列經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得, 其上、下游引物序列分別為5′-CGCGCAAATTACCCAC TCCC-3′和5′-CTGAACGCCACTTGTCCCT-3′。5S rDNA的全部編碼序列和間隔序列同樣也用PCR擴(kuò)增獲得, 所用上、下游引物序列為5′-GTCAGGC CTGGTTAGTACTTGGAT-3′和5′-GGGCGCATTCAGGGTGGTAT-3′。端粒重復(fù)序列(TTAGGG),通過(guò)引物(TTAGGG)5和(TAACCC)5無(wú)模板擴(kuò)增獲得[7]。

18S rDNA、5S rDNA和端粒重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增均為20 μL反應(yīng)體系[10×buffer (含Mg2+) 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、10 mmol/L的上下游引物各1 μL、5 U/μL的EasyTaqDNA聚合酶 0.2 μL和50 ng基因組DNA 1 μL, 加ddH2O至20 μL]。不同目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)應(yīng)PCR擴(kuò)增條件略有不同。18S rDNA擴(kuò)增條件如下: 94℃預(yù)變性4min; 94℃變性30S, 54℃退火1min, 72℃延伸1min, 循環(huán)30次; 72℃充分延伸5min。5S rDNA的擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性2min, 54℃退火1min, 循環(huán)30次。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性90S; 94℃變性45S, 52℃退火30S, 72℃延伸30S, 循環(huán)30次; 72℃充分延伸10min。

上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用缺口平移法制備生物素或地高辛標(biāo)記探針, 操作方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)(Roche)。

1.3 染色體載玻片制備和染色

采用蒸汽滴片法獲得染色體制片, 室溫風(fēng)干后在60℃恒溫箱中老化3h后, 室溫存放備用, 具體操作同陳紫瑩等[8]的描述。部分制片用吉姆薩染液、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)染色, 方法同鄭嬌等[9]的描述。

1.4 原位雜交、信號(hào)檢測(cè)及觀察

FISH操作參考前人描述[10,11], 包括制片和探針的變性、雜交過(guò)夜、嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌、信號(hào)放大等步驟。其中, 生物素標(biāo)記用親和素-Alexa fluor-488(Introgen)顯示綠色熒光信號(hào), 地高辛標(biāo)記用抗地高辛-諾丹明(Roche)顯示紅色熒光信號(hào)。最后, 滴加含PI或DAPI的抗褪色劑封片。

1.5 顯微觀察、測(cè)量與核型排列

在正置熒光顯微鏡(Olympus BX53)下觀察染色體, 用電荷藕合器件圖像傳感器(CCD, Olympus DP80)拍照。選取5個(gè)染色體完整、分散良好的中期相(PI染色)的數(shù)碼圖像, 應(yīng)用Image-pro plus 6.0(IPP 6.0)軟件輔助排列并測(cè)量染色體的長(zhǎng)度、寬度、面積和累積光密度(IOD), 方法參考前人的描述[6,9]。核型圖中的染色體按相對(duì)長(zhǎng)度降序排列。

2 結(jié)果

2.1 核型特征

選取形態(tài)清晰、分散良好及數(shù)目完整的眼斑擬石首魚(yú)的中期分裂相顯微觀察統(tǒng)計(jì), 結(jié)果顯示眼斑擬石首魚(yú)的細(xì)胞含有48條染色體, 核型公式為2n=48t (圖1), 且雄魚(yú)和雌魚(yú)的染色體數(shù)目沒(méi)有差異。根據(jù)染色體的形態(tài)特征和信號(hào)特征對(duì)其進(jìn)行配對(duì), 將配對(duì)的染色體按照相對(duì)長(zhǎng)度降序排列并編號(hào)(圖1b)。取分散良好的5個(gè)中期相進(jìn)行染色體配對(duì), 并按降序排列成5幅核型圖, 利用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)染色體的長(zhǎng)度、面積、寬度和IOD進(jìn)行測(cè)量, 通過(guò)Excel計(jì)算核型圖的同源染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)面積、相對(duì)寬度和相對(duì)IOD, 并統(tǒng)計(jì)5幅核型圖的平均值, 結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)表明,眼斑擬石首魚(yú)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度在2.62%—5.45%、相對(duì)面積在2.20%—5.88%、相對(duì)寬度在3.63%—4.67%、相對(duì)IOD在2.05%—6.14%, 分布連續(xù)。值得注意的是, 吉姆薩染色在1號(hào)染色體近著絲粒區(qū)域有明顯的次縊痕, 而DAPI染色在相應(yīng)位置出現(xiàn)陰性帶(圖2a、圖2b)。

2.2 重復(fù)序列的FISH定位

以生物素標(biāo)記的端粒重復(fù)序列作探針做FISH,用PI對(duì)染色體進(jìn)行染色, 染色體染為紅色, 端粒信號(hào)顯示綠色(圖1a)。綠色信號(hào)分布在染色體兩端。兩端端粒信號(hào)呈現(xiàn)強(qiáng)度不平衡的特點(diǎn), 著絲粒端信號(hào)強(qiáng), 遠(yuǎn)端信號(hào)弱, 因而根據(jù)端粒信號(hào)強(qiáng)弱可以輕易的判斷染色體方向, 并直觀顯示眼斑擬石首魚(yú)含48條端部著絲粒染色體。18S和5S rDNA雙色FISH中, 18S rDNA用生物素標(biāo)記, 5S rDNA用地高辛標(biāo)記, 染色體用DAPI負(fù)染。結(jié)果顯示(圖2c), 染色體負(fù)染為藍(lán)色; 整個(gè)染色體組僅有一對(duì)18S rDNA信號(hào), 呈綠色, 分布于1號(hào)染色體次縊痕部位; 2對(duì)5S rDNA信號(hào), 均呈紅色, 但信號(hào)強(qiáng)度不同。強(qiáng)信號(hào)5S rDNA位點(diǎn)位于8號(hào)染色體近著絲粒區(qū)域, 弱信號(hào)5S rDNA位點(diǎn)位于3號(hào)染色體臂間。兩類rDNA位點(diǎn)不具同線性(圖2c、圖2d)。雌雄性個(gè)體間未見(jiàn)明顯的核型差異。

3 討論

3.1 宏觀核型的特征

目前認(rèn)為, 2n=48t是硬骨魚(yú)核型的共同祖征[12]。在海水魚(yú)中, 大多數(shù)鱸形目魚(yú)類具有這一保守核型,石首魚(yú)是其中核型最為保守的一個(gè)科[1]。目前已知核型的石首魚(yú)約38種, 核型包含48條染色體有36種,核型公式為2n=48t約32種[2]。眼斑擬石首魚(yú)的核型公式為2n=48t, 與石首魚(yú)科的主流核型一致, 具硬骨魚(yú)原始核型特征

3.2 rDNA序列的定位

圖1 基于FISH的眼斑擬石首魚(yú)染色體核型圖Fig. 1 Karyotype of Sciaenops ocellatus based on FISH

表1 眼斑擬石首魚(yú)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)面積、相對(duì)寬度和相對(duì)IODTab. 1 The relative length, relative area, relative wide and relative IOD of the chromosomes of Sciaenops ocellatus

圖2 眼斑擬石首魚(yú)染色體中期相Fig. 2 Metaphase of Sciaenops ocellatus

宏觀核型穩(wěn)定、保守是石首魚(yú)科的基本細(xì)胞遺傳學(xué)特征。然而, 在許多宏觀核型穩(wěn)定的海水魚(yú)分類單元中常常觀察到微小的染色體重排, 特別是rDNA位點(diǎn)及其鄰近區(qū)域[13]。在真核生物細(xì)胞核中,rDNA組織為兩個(gè)獨(dú)立的基因家族, 串聯(lián)重復(fù)單元分別為45S rDNA和5S rDNA。其中, 45S rDNA編碼5.8S、18S和28S rRNA, 5S rDNA編碼5S rRNA[14]。45S rDNA在染色體上的分布可以通過(guò)銀染顯示核仁組織中心(NOR)、DAPI染色顯示陰性帶或CMA染色體顯示高亮帶等方法來(lái)顯示, 更直接的方法是以45S rDNA的部分序列(如18S rDNA)為探針作FISH來(lái)定位[15]。在石首魚(yú)中, 進(jìn)行過(guò)45S rDNA (或NOR)定位研究共有12種(含本研究), 其中開(kāi)展過(guò)FISH定位的有5種(表2)。12種石首魚(yú)均含有單對(duì)45S rDNA (或NOR)的位點(diǎn), 但分布位置存在種間變異。其中, 廈門白姑魚(yú)(Argyrosomus amoyensis)、美洲無(wú)鰾石首魚(yú)(Menticirrhus americanus)、箕作黃姑魚(yú)(Micropogonias furnieri)、黃姑魚(yú)(N. albiflora)和眼斑擬石首魚(yú)等5種的分布模式一致, 均在1號(hào)染色體近著絲粒區(qū)域; 另外4種分布模式各不相同, 還有3種分布位置尚未明確。根據(jù)原始性狀的普遍性原則可以推斷, 單對(duì)45S rDNA單對(duì)分布于1號(hào)染色體近著絲粒位置是石首魚(yú)原始核型的特征。可見(jiàn), 眼斑擬石首魚(yú)18S rDNA位點(diǎn)的染色體分布仍保留著石首魚(yú)共有祖先的特征。

5S rDNA位點(diǎn)的染色體分布模式只能通過(guò)FISH定位確定, 因此迄今開(kāi)展過(guò)5S rDNA定位研究的石首魚(yú)僅有4種。然而, 現(xiàn)有數(shù)據(jù)已初步顯示, 石首魚(yú)5S rDNA位點(diǎn)在染色體上分布模式存在較高水平的種間變異: 廈門白姑魚(yú)具有1對(duì)信號(hào); 大黃魚(yú)具有9—11對(duì)信號(hào); 黃姑魚(yú)和眼斑擬石首魚(yú)均具有2對(duì)信號(hào), 但分布位置不同(表2)?？梢?jiàn), 在石首魚(yú)進(jìn)化進(jìn)程中, 染色體曾發(fā)生過(guò)活躍的染色體重排, 但是這些重排沒(méi)有改變宏觀核型結(jié)構(gòu)。這種宏觀核型穩(wěn)定而rDNA位點(diǎn)分布模式高度變化的現(xiàn)象也見(jiàn)于其他硬骨魚(yú)類群。例如,科(Serranidae)中多數(shù)魚(yú)類核型包含48條單臂染色體, 但45S rDNA (或NOR)存在很大的種間變化; 銀鱸科尖口銀鱸屬(Eucinostomus)中也觀察到穩(wěn)定的核型和兩種rDNA的位置變動(dòng)[1,23]。導(dǎo)致rDNA位點(diǎn)位置差異的機(jī)制可能是轉(zhuǎn)座子的作用或同源染色不平衡交換等[24,25]。在石首魚(yú)中, 什么因素導(dǎo)致5S rDNA的種間變異尚需進(jìn)一步研究。

雙色FISH直觀顯示, 眼斑擬石首魚(yú)的18S rDNA和5S rDNA位點(diǎn)不具有同線性。多數(shù)魚(yú)類的45S rDNA和5S rDNA位點(diǎn)分布在不同的染色體上,大多數(shù)的高等植物和動(dòng)物也具有同樣的特征[14]。45S rDNA和5S rDNA位點(diǎn)分別位于不同染色體, 可以避免兩個(gè)基因簇之間的易位, 并使其可以獨(dú)立進(jìn)化[26]。但是, 也有一些魚(yú)類的兩種rDNA位點(diǎn)位于同一條染色體上, 甚至在相鄰的位置上, 如黃姑魚(yú)(Nibea albiflora)有2對(duì)5S rDNA位點(diǎn), FISH信號(hào)較強(qiáng)的一對(duì)與18S rDNA間隔分布在同一條染色體上[9];牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大西洋鮭(Salmosalar)、雜斑盔魚(yú)魚(yú)(Coris julis)等魚(yú)類的兩類rDNA位點(diǎn)則串聯(lián)分布于同一染色體[27,28]。

3.3 端粒序列的定位

端粒是一種在動(dòng)植物中廣泛分布的重復(fù)序列,是染色體的重要功能元件, 主要功能是維持染色體的完整性和獨(dú)立性[29]。目前在定位過(guò)端粒序列的80多種魚(yú)中, 存在端部以外端粒序列雜交信號(hào)的約42%[30]。眼斑擬石首魚(yú)的端粒序列雜交信號(hào)均出現(xiàn)在染色體的兩端, 未見(jiàn)臂間端粒信號(hào), 說(shuō)明眼斑擬石首魚(yú)在進(jìn)化過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生涉及端粒的染色體倒位或融合。值得注意的是, 眼斑擬石首魚(yú)的端粒信號(hào)呈現(xiàn)出一個(gè)有趣的現(xiàn)象, 各條染色體上著絲粒端的端粒信號(hào)較強(qiáng), 而遠(yuǎn)著絲粒端的端粒信號(hào)弱。這種染色體兩端端粒信號(hào)強(qiáng)度不一致的現(xiàn)象并未見(jiàn)于其他石首魚(yú), 但偶見(jiàn)于其他脊椎動(dòng)物和植物, 如人類和菠菜(Spinacia oleraceaL.)[29,31]。導(dǎo)致端粒信號(hào)強(qiáng)度不一致的可能原因有: (1)著絲粒端粒序列長(zhǎng)度長(zhǎng)于遠(yuǎn)端著絲粒; (2)著絲粒DNA含有端粒序列, 兩種來(lái)源的端粒信號(hào)重疊。雖然, 導(dǎo)致眼斑擬石首魚(yú)兩端端粒信號(hào)不一致的原因仍然未明, 但這一現(xiàn)象可以直觀地呈現(xiàn)染色體的方向, 并證明眼斑擬石首魚(yú)的染色體全部為端部著絲粒染色體。

表2 石首魚(yú)科魚(yú)類的核型特點(diǎn)和rDNA位點(diǎn)定位研究概況Tab. 2 The karyotypes characteristics and summary of locations of rDNA on the chromosome of Sciaenidae

4 結(jié)論

本研究首次利用雙色FISH分析了眼斑擬石首魚(yú)的核型特征, 豐富了該物種的染色體辨識(shí)標(biāo)記,并為研究石首魚(yú)染色體進(jìn)化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。結(jié)合其他石首魚(yú)核型數(shù)據(jù), 可以推斷: 2n=48t的核型及單對(duì)近著絲粒分布的18S rDNA位點(diǎn)是石首魚(yú)的共同祖征。盡管開(kāi)展過(guò)石首魚(yú)5S rDNA定位的石首魚(yú)僅有4種, 現(xiàn)有數(shù)據(jù)已初步揭示, 石首魚(yú)染色體進(jìn)化過(guò)程中, 染色體上曾發(fā)生過(guò)活躍但不影響宏觀核型的小規(guī)模重排。FISH是分析核型特征和染色體進(jìn)化的有力工具。以FISH為核心技術(shù)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)是聯(lián)結(jié)信息學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)的橋梁。在魚(yú)類基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究飛速發(fā)展的今天, 魚(yú)類分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究將迎來(lái)新的發(fā)展契機(jī)和更廣闊的應(yīng)用前景。

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LOCATION OF REPETITIVE DNA SEQUENCES ON THE CHROMOSOME OF SCIAENOPS OCELLATUS

ZHU Qi-Chun, ZHENG Jiao, ZHANG Jing, LIU Xian-De, WANG Zhi-Yong and CAI Ming-Yi
(The Key Laboratory of Helthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture, Fisheries College, Jimei University,Xiamen 361021, China)

The chromosome characteristics of red drum (Sciaenops ocellatus) were analyzed to enhance the cytogenetic markers inSciaenops ocellatusby fluorescencein situhybridization (FISH) with 18S rDNA, 5S rDNA and telomeric repetitive DNA as probes. The karyotype of red drum consists of 48 telomeric chromosomes. FISH with 18S rDNA probes showed a single pair of signals at the secondary constriction sites of Chromosome 1. Whereas, two pairs of signal with different intensity were detected with the 5S rDNA probes: the strong signals were on the proximal of Chromosome 8, and the weak ones were on the interstitial of Chromosome 3. The signals of telomeric repetitive DNA appeared at both ends of all chromosomes with uneven intensity, and signals at the centromeric ended stronger than those at the distal ends, which facilitated determining the direction of the chromosome. These results, together with the available cytogenetic data of other sciaenids, suggested that the karyotype of 2n=48t and single 18S rDNA locus were the symplesiomorphic cytogenetic features of sciaenids, and the active and cryptic chromosomal rearrangements may have occurred along the evolution of sciaenids. The distribution patterns of these three kinds of repetitive DNAs would be useful to assist identifying the chromosomes of red drum, and be the basic data for studying chromosome evolution in Sciaenidae.

Sciaenops ocellatus; Karyotype; Chromosome; FISH; Ribosomal DNA; Telomere

Q343.2

A

1000-3207(2017)06-1218-07

2016-12-28;

2017-04-26

國(guó)家自然科學(xué)基金(41706157和31272653); 福建省自然科學(xué)基金(2017J01449)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (41706157, 31272653); the Natural Science Foundation of Fujian Province (2017J01449)]

朱齊春(1991—), 男, 安徽安慶人; 碩士研究生; 主要從事水產(chǎn)生物遺傳育種研究。E-mail: 17859736800@163.com

蔡明夷(1973—), 女, 教授, 博士; 主要從事水產(chǎn)生物遺傳育種研究。E-mail: myicai@jmu.edu.cn