扈雪歡，寧歡歡，劉光照，吳能表，2*

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄生理生化、氮代謝及次生代謝的影響

扈雪歡1，寧歡歡1，劉光照1，吳能表1，2*

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

采用無(wú)土栽培的方式，研究0.75 mmol/L 水楊酸(SA)對(duì)100 mmol/L NaCl脅迫下顛茄幼苗生理生化、氮代謝與次生代謝的影響。結(jié)果表明，外源SA處理后：顛茄葉片葉綠素含量增多，最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ的潛在活性(Fv/Fo)、PSⅡ激發(fā)能捕獲效率(Fv′/Fm′)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)顯著升高，初始熒光(Fo)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)明顯降低；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)活性明顯增強(qiáng)，丙二醛(MDA)含量明顯降低；可溶性蛋白含量顯著升高，脯氨酸和可溶性糖含量降低；NO3-含量增加，NH4+含量減少，谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性提高，谷氨酸脫氫酶(GDH)活性降低；次生代謝產(chǎn)物莨菪堿和東莨菪堿含量顯著提升。說(shuō)明0.75 mmol/L外源SA能顯著改善100 mmol/L NaCl脅迫下顛茄幼苗的光合性能，調(diào)節(jié)有機(jī)滲透物質(zhì)含量，提高抗氧化酶活性，減小膜脂過(guò)氧化程度，以緩解鹽脅迫造成的傷害。并使氮代謝相關(guān)酶活性恢復(fù)或增強(qiáng)，為生物堿的合成提供更多的前體物質(zhì)和能量，從而直接或間接地促進(jìn)了次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。

顛茄；鹽脅迫；水楊酸；氮代謝；次生代謝

顛茄(Atropabelladonna)是我國(guó)藥典規(guī)定的唯一托品烷類生物堿的藥源植物，同時(shí)也是商業(yè)化生產(chǎn)東莨菪堿(scopolamine)和莨菪堿(hyoscyamine)的主要藥源植物。其中，東莨菪堿可用于阻斷副交感神經(jīng)，也可用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑，是托品烷類生物堿中藥理作用強(qiáng)且副作用小的一種生物堿，但其在野生顛茄內(nèi)的含量很低[1]。土壤鹽漬化是現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題之一。隨著人類耕作活動(dòng)的增加，鹽漬化土壤面積逐年呈不可逆的形式升高，預(yù)計(jì)到2050年，可用耕地的50%將面臨鹽漬化[2]。因此，如何提高植物的抗(耐)鹽能力，培育抗(耐)鹽植株，必將成為未來(lái)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的激素，作為信號(hào)分子，SA可通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)植物對(duì)各種逆境的反應(yīng)[3]。目前，SA 在鹽脅迫下對(duì)不同植物的保護(hù)作用已有大量報(bào)道：Ganege等[4]研究發(fā)現(xiàn)外源SA處理能誘導(dǎo)鹽脅迫下非洲菊(Gerberajamesonii)植株的抗氧化反應(yīng)；張林青[5]發(fā)現(xiàn)SA能顯著改善鹽脅迫下番茄(Lycopersiconesculentum)的多種生理指標(biāo)，從而提高番茄的耐鹽能力；王立紅等[6]在棉花(Gossypiumhirsutum)幼苗上也得到了一致的研究結(jié)果。此外，有研究表明，SA還可作為誘導(dǎo)子，影響東莨菪堿的合成與積累：虞珍珍[7]將SA 添加到東莨菪堿植物的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)東莨菪堿的含量提高；Kang等[8]發(fā)現(xiàn)水楊酸處理能顯著提高韓國(guó)山莨菪(Scopoliatangutica)的東莨菪堿含量，Lee等[9]也得出了相似的結(jié)果。因此，研究外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄的緩解效應(yīng)和對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累的影響，對(duì)選育高產(chǎn)莨菪堿、東莨菪堿的顛茄有重要意義。

本試驗(yàn)通過(guò)探究外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄生理生化、氮代謝及次生代謝的影響，為人工調(diào)控顛茄的耐鹽性、擴(kuò)大顛茄的種植范圍及氮代謝與次生代謝產(chǎn)物調(diào)控的相關(guān)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

顛茄種子來(lái)源于西南大學(xué)“三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，2015年6月種于該實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。選取健康、飽滿的種子，用50 mmol/L的赤霉素溶液浸泡2 d后，平鋪于濕潤(rùn)的濾紙上萌發(fā)，期間保持濾紙濕潤(rùn)。一周后將萌發(fā)的種子播種于裝有珍珠巖的營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)處理10缽，每缽3株。在人工培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，每天于7:00-19:00期間光照，光照強(qiáng)度為5000 lx；溫度為白天25 ℃，夜晚20 ℃；相對(duì)濕度：60%～70%。

2015年7月待顛茄幼苗長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。NaCl溶液濃度參考文獻(xiàn)[10-15] 研究結(jié)果，設(shè)定為100 mmol/L，澆灌量為5 mL。SA處理采用對(duì)葉片噴施SA溶液(內(nèi)含0.02% Tween-20)的方式，CK和僅NaCl組噴施等量蒸餾水。其中，NaCl溶液和SA溶液皆由1/2 Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液配制而成。第一批試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理：CK(無(wú)NaCl和SA)、100 mmol/L NaCl+0 mmol/L SA、100 mmol/L NaCl+0.25 mmol/L SA、100 mmol/L NaCl+0.5 mmol/L SA、100 mmol/L NaCl+0.75 mmol/L SA、100 mmol/L NaCl+1 mmol/L SA、100 mmol/L NaCl+1.25 mmol/L SA，試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)第15 天取樣測(cè)定逆境生理指標(biāo)，根據(jù)結(jié)果確定最佳SA濃度后再進(jìn)行第二批試驗(yàn)。第二批試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：CK、100 mmol/L NaCl、SA、100 mmol/L NaCl+SA，試驗(yàn)第15 天取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2方法

1.2.1逆境生理 脯氨酸(proline，Pro)含量采用酸性水合茚三酮顯示法測(cè)定[16]；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)檢測(cè)法測(cè)定[17]；可溶性糖含量的測(cè)定參照張志良等[18]的苯酚法；可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]；過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用紫外分光光度法測(cè)定[19]；過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[18]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性根據(jù)氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測(cè)定[20]。

1.2.2光合特性 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定利用 PAM-2100熒光儀(Walz，德國(guó))預(yù)先編好的測(cè)定程序Run 3進(jìn)行。晚上將待測(cè)樣品充分暗處理30 min，然后測(cè)定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量(Fs)、作用光打開(kāi)時(shí)的最大熒光產(chǎn)量(Fm′)、作用光關(guān)閉時(shí)的原初熒光產(chǎn)量(Fo′)、光合電子傳遞速率(ETR)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)，取3次數(shù)據(jù)的平均值分析；計(jì)算以下指標(biāo)：可變熒光(Fv)=Fm-Fo，PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)=(Fm-Fo)/Fo，PSⅡ激發(fā)能捕獲效率(Fv′/Fm′)=(Fm′-Fo′)/Fm′，實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)=(Fm′-Fs)/Fm′[21]；葉綠素含量的測(cè)定參照張憲政[22]的方法。

1.2.3氮代謝 硝態(tài)氮含量測(cè)定參照李合生[23]的方法；銨態(tài)氮含量的測(cè)定參照湯章程[24]的方法；谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)活性的測(cè)定參照王小純等[25]的方法；谷氨酸合成酶(glutamate synthetase，GOGAT)活性的測(cè)定參照湯章程[24]的方法；谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)活性的測(cè)定參照Majerowicz等[26]的方法。

1.2.4次生代謝產(chǎn)物 參照Z(yǔ)árate等[27]的方法，提取顛茄葉片的莨菪堿、東莨菪堿。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)采用日本島津(Shimadzu)LC-60A 高效液相色譜儀(泵：LC-20AD；控制器：SPD-20A；柱溫箱：CTO-10AS vp)；Ultimate XB-C18液相色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇∶醋酸緩沖液(20 mmol/L 醋酸銨，0.1%甲酸，pH 4.0)=1∶4；檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。精密稱取對(duì)照品進(jìn)行HPLC測(cè)定，繪制峰面積(Y)和濃度(X)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出莨菪堿、東莨菪堿的含量 。

1.3數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和方差檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1SA濃度的確定

研究不同濃度SA對(duì)100 mmol/L NaCl脅迫下顛茄幼苗逆境生理指標(biāo)的影響，以篩選本試驗(yàn)的最適SA濃度，結(jié)果顯示(表1)，鹽脅迫下，MDA含量升高，表明膜脂過(guò)氧化程度加劇。外施SA后顯著降低了MDA含量，其中0.75 mmol/L SA效果最好，較脅迫組減少了33.48%。抗氧化酶能自行清除自由基，鹽脅迫下，CAT、POD、SOD的活性均有所增強(qiáng)；添加不同濃度SA后，酶活性有不同程度的提升，其中0.75 mmol/L SA處理組的CAT、POD、SOD活性最高，升高幅度最大，分別為脅迫組的2.47、1.18和1.55倍，即0.75 mmol/L SA對(duì)鹽脅迫下顛茄的抗氧化能力提升效果最好。單純鹽處理，脯氨酸和可溶性糖的含量均呈上升趨勢(shì)，可溶性蛋白含量降低，說(shuō)明顛茄幼苗受到滲透脅迫。施加不同濃度的SA后，上升或降低的趨勢(shì)得到不同程度的緩解。其中0.75 mmol/L SA的效果最佳，脯氨酸、可溶性糖的含量較鹽脅迫組分別降低了30.14%、31.14%，可溶性蛋白含量較脅迫組升高了16.97%。因此，本試驗(yàn)選取0.75 mmol/L為SA處理濃度。

2.2外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片光合色素含量的影響

100 mmol/L NaCl處理使顛茄葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素含量均呈下降趨勢(shì)，較CK分別降低了40.46%、46.37%、44.79%和44.96%。施加0.75 mmol/L SA后，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量和類胡蘿卜素的含量分別較脅迫組顯著提高了79.58%、72.58%、68.93%、83.10%，說(shuō)明外源SA能有效改善鹽脅迫下顛茄的光合性能。與CK相比，單獨(dú)SA處理各指標(biāo)均有提高，只有葉綠素a達(dá)到顯著水平，可能是葉綠素a對(duì)SA比較敏感(表2)。

表1 外源水楊酸(SA)對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片逆境生理指標(biāo)的影響Table 1 Effect of salicylic acid (SA) on stress physiological index of A. belladonna leaves under NaCl stress

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)，下同。

Notes：Different lowercase letters within the same column show significant difference (Plt;0.05). The same below.

表2 外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片光合色素含量的影響Table 2 Effect of SA on photosynthetic pigment content of A. belladonna leaves under NaCl stress mg/g FW

2.3外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3.1外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片暗適應(yīng)熒光參數(shù)的影響 鹽脅迫下，F(xiàn)o顯著升高，為CK的1.71倍，添加0.75 mmol/L SA后降低了21.43%。鹽脅迫下，F(xiàn)m顯著降低，僅為CK的38.46%，添加外源SA后提高了20.41%。鹽脅迫下，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo較CK分別降低了43.80%、87.39%；加SA處理后，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo分別升高為脅迫組的1.35和2.07倍。僅SA處理組與CK無(wú)顯著差異。說(shuō)明100 mmol/L NaCl脅迫下，PSⅡ反應(yīng)中心的活性降低，光合作用受抑制，0.75 mmol/L SA能顯著緩解鹽脅迫對(duì)顛茄光合系統(tǒng)的傷害(表3)。

2.3.2外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片光適應(yīng)熒光參數(shù)的影響 100 mmol/L NaCl脅迫下，顛茄幼苗的Fv′/Fm′、ΦPSⅡ、ETR、qP較CK分別降低了79.63%、90.89%、33.76%、66.91%，qN升高為CK的2.28倍。添加SA后，F(xiàn)v′/Fm′、ΦPSⅡ、qP顯著升高為脅迫組的3.15、3.11和2.57倍，ETR提高了23.32%，qN降低了40.43%，縮小了與CK的差距。除qP外，僅SA處理與CK差異不顯著。說(shuō)明0.75 mmol/L SA能緩解鹽脅迫導(dǎo)致的PSⅡ反應(yīng)中心活性降低，減少熱耗散的份額(表4)。

表3 外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片暗適應(yīng)熒光參數(shù)的影響Table 3 Effect of SA on dark adaptation fluorescence parameters of A. belladonna leaves under NaCl stress

注：Fo表示初始熒光，F(xiàn)m表示最大熒光，F(xiàn)v/Fm表示最大光化學(xué)效率，F(xiàn)v/Fo表示PSⅡ的潛在活性。

Notes：Forepresents initial fluorescence，F(xiàn)mrepresents maximum fluorescence，F(xiàn)v/Fmrepresents maximal photochemical efficiency，F(xiàn)v/Forepresents potential activity of PSⅡ.

表4 外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片光適應(yīng)熒光參數(shù)的影響Table 4 Effect of SA on light adaptation fluorescence parameters of A. belladonna leaves under NaCl stress

注：Fv′/Fm′表示PSⅡ激發(fā)能捕獲效率，ΦPSⅡ表示PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率，ETR表示表觀光合電子傳遞速率，qP表示光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)，qN表示非光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)。

Notes：Fv′/Fm′ represents the efficiency of excitation energy capture by open PSⅡcenters，ΦPSⅡrepresents actual PSⅡ photochemical efficiency，ETR represents photosynthetic electron transport rate，qPrepresents photochemical quenching coefficient，qNrepresents non-photochemical quenching coefficient.

2.4外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片氮代謝的影響

100 mmol/L NaCl脅迫下，顛茄幼苗葉片GS、GOGAT活性較CK分別顯著降低了56.40%、48.19%，而GDH活性顯著升高60.8%；外源SA處理后，GS、GOGAT活性分別較脅迫組上升了52.00%、47.84%，GDH活性下降了13.5%。僅SA處理下，酶活性的變化均不明顯。說(shuō)明0.75 mmol/L SA能較明顯地逆轉(zhuǎn)鹽脅迫造成的氮代謝酶活性紊亂，使酶活性恢復(fù)正常水平(表5)。

100 mmol/L NaCl脅迫下，顛茄幼苗葉片NO3-含量較CK降低51.18%，用外源SA處理后，NO3-含量提高了57.69%，說(shuō)明0.75 mmol/L SA能促進(jìn)鹽脅迫下顛茄對(duì)硝態(tài)氮的吸收。鹽脅迫使NH4+含量顯著升高，是CK的2.13倍，NH4+的積累易使植物受氨毒害；用外源SA處理后，NH4+含量降低了31.74%。僅SA處理時(shí)，含量變化均不明顯。上述結(jié)果表明，外施0.75 mmol/L SA溶液能提高鹽脅迫下顛茄幼苗對(duì)氮素的利用，使氮代謝正常進(jìn)行(表5)。

2.5外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片次生代謝產(chǎn)物的影響

經(jīng)不同處理后，顛茄幼苗中的東莨菪堿、莨菪堿含量與CK相比均有提高。100 mmol/L NaCl處理下，東莨菪堿、莨菪堿含量分別為CK的1.38和2.10倍；添加0.75 mmol/L外源SA后，東莨菪堿、莨菪堿含量繼續(xù)上升，分別為CK的1.63和2.53倍；僅SA處理下，東莨菪堿、莨菪堿含量分別為CK的1.20和1.62倍(表6)。

表5 外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片氮代謝指標(biāo)的影響Table 5 Effect of SA on nitrogen metabolism index of A. belladonna leaves under NaCl stress

注：GS表示谷氨酰胺合成酶，GOGAT表示谷氨酸合成酶，GDH表示谷氨酸脫氫酶，NADH表示煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。

Notes：GS represents glutamine synthetase，GOGAT represents glutamate synthetase，GDH represents glutamate dehydrogenase，NADH represents nicotinamide adenine dinucleotide.

表6 外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片次生代謝產(chǎn)物含量的影響Table 6 Effect of SA on secondary metabolites content of A. belladonna leaves under NaCl stress mg/g DW

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)。

Notes：Different lowercase letters within the same row show significant difference (Plt;0.05).

3 討論

3.1外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗光合特性的影響

一般地，NaCl脅迫會(huì)誘發(fā)膜脂過(guò)氧化，破壞類囊體膜的超微結(jié)構(gòu)，從而引起葉綠體的解體，導(dǎo)致光合色素含量的下降[28]。本試驗(yàn)中，鹽脅迫下，葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著降低。葉綠素含量的降低導(dǎo)致捕獲的光能減少，光能轉(zhuǎn)化受阻；類胡蘿卜素含量降低使其在細(xì)胞內(nèi)吸收剩余能、淬滅活性氧的能力下降，膜脂過(guò)氧化加劇[29]。施加外源SA后，光合色素含量明顯升高，說(shuō)明外源SA能有效緩解顛茄由于鹽脅迫造成的光合色素含量下降，可能與外源SA緩解了膜脂的過(guò)氧化程度有關(guān)。這在夏枯草(Prunellavulgaris)[28]、黃連(Coptischinensis)[29]上也得到了證明。

許多研究已證明PSⅡ是光抑制的重要部位，鹽堿可以使光能利用效率下降，從而使植物更易受到光抑制的傷害[29]。本研究中，鹽脅迫下，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、Fv′/Fm′、ETR顯著下降，F(xiàn)o升高，表明鹽脅迫使顛茄遭受光抑制，顛茄PSⅡ反應(yīng)中心遭到破壞，光合電子傳遞受阻，光能轉(zhuǎn)化率降低。qP顯著降低，qN明顯升高，表明顛茄葉片PSⅡ熱耗散的份額增多，碳同化的能量來(lái)源不足。施加0.75 mmol/L SA后，F(xiàn)o、qN下降，F(xiàn)m、Fv/Fm、Fv/Fo，F(xiàn)v′/Fm′、ΦPSⅡ、qP、ETR顯著提高，說(shuō)明SA不是通過(guò)增多顛茄熱耗散的方式來(lái)保護(hù)光合機(jī)構(gòu)，可能是通過(guò)調(diào)整PSⅡ的能量分配，將捕獲的光能更多的用于光化學(xué)轉(zhuǎn)化，增大鹽脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心的開(kāi)放程度，加快原初電子受體QA(primary quinone electron acceptor of PSⅡ)還原態(tài)的氧化，促進(jìn)電子傳遞，從而緩解鹽脅迫對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的傷害，提高光能轉(zhuǎn)化效率應(yīng)對(duì)脅迫。孫德智等[30]的研究也得出了相似的結(jié)論。

綜上，0.75 mmol/L外源SA能提高鹽脅迫下顛茄的光合色素含量，緩解鹽脅迫對(duì)光合機(jī)構(gòu)的破壞，調(diào)整PSⅡ能量分配，緩解反應(yīng)中心的傷害，使更多能量用于光化學(xué)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)光合作用，以積累干物質(zhì)抵御逆境。

3.2外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄逆境生理的影響

鹽脅迫對(duì)植物的次生傷害為滲透脅迫[31]。植物體通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低滲透勢(shì)，使其在低滲透勢(shì)生境仍能吸收水分[31]。本試驗(yàn)中，鹽脅迫下，脯氨酸和可溶性糖含量上升，以維持細(xì)胞一定的含水量。外施SA后，兩者含量降低，表明SA可緩解NaCl引起的滲透脅迫，使水分代謝達(dá)到平衡，這與周旋等[32]、王寶增等[3]的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，鹽脅迫使顛茄幼苗葉片中可溶性蛋白含量降低，添加外源SA后能有效升高可溶性蛋白含量，這與姚俠妹等[33]對(duì)梔子(Gardeniajasminoides)幼苗的研究結(jié)果相似，表明0.75 mmol/L SA可增加鹽脅迫下蛋白質(zhì)的合成，提高顛茄葉片吸收水分的效率，減少了滲透調(diào)節(jié)的耗能，使顛茄的抗逆性增強(qiáng)。

MDA是膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一[34]。鹽脅迫下，MDA含量明顯上升，說(shuō)明膜系統(tǒng)受到一定程度的損傷，質(zhì)膜透性增大。外施SA后，MDA含量明顯降低，說(shuō)明SA能抑制膜脂過(guò)氧化，維護(hù)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，增強(qiáng)顛茄對(duì)鹽脅迫的抵抗能力，與在蕎麥(Fagopyrumesculentum)幼苗上的研究結(jié)果相似[34]。研究表明，在脅迫初期，植物體內(nèi)的活性氧清除系統(tǒng)被激活，表現(xiàn)為SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶活性的暫時(shí)升高，維持活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡[35]。本試驗(yàn)及樊瑞蘋等[36]的研究都證實(shí)了這一點(diǎn)。經(jīng)SA處理后，抗氧化酶活性顯著升高，說(shuō)明SA能有效促進(jìn)鹽脅迫下顛茄幼苗抗氧化能力的提升，減輕自由基積累造成的氧化損傷，提高顛茄的抗逆性。

綜上，0.75 mmol/L外源SA 可以通過(guò)調(diào)節(jié)鹽脅迫下顛茄幼苗的滲透物質(zhì)含量，誘導(dǎo)抗氧化酶活力維持在較高水平，降低細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化程度，提高顛茄的耐鹽能力，對(duì)顛茄抵抗鹽害具有重要意義。

3.3外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片氮代謝的影響

植物的氮代謝包括無(wú)機(jī)氮的還原、同化及有機(jī)含氮化合物的轉(zhuǎn)化、合成等過(guò)程，谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)循環(huán)是氨同化的主要途徑[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽脅迫下GS、GOGAT酶活性降低，NH4+含量顯著升高，與張揚(yáng)歡[38]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明鹽脅迫會(huì)使顛茄細(xì)胞內(nèi)銨態(tài)氮積累增加，易產(chǎn)生氨毒，抑制幼苗的正常生長(zhǎng)和代謝。孫菲菲等[39]認(rèn)為，鹽脅迫下，植物為使氨毒害作用降到最低，可能通過(guò)減少硝態(tài)氮的吸收，減緩硝態(tài)氮向銨態(tài)氮的還原而相應(yīng)造成硝態(tài)氮含量下降，是植物的自我適應(yīng)機(jī)制。另外，Cl-和NO3-的競(jìng)爭(zhēng)性抑制也會(huì)使植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收減少。本試驗(yàn)的結(jié)果與此一致。添加外源SA后，GS、GOGAT酶活性均明顯增強(qiáng)，NO3-含量升高明顯，NH4+含量顯著降低，說(shuō)明SA可能通過(guò)提升鹽脅迫下顛茄對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收，以減輕因氮源不足造成的傷害，并通過(guò)誘導(dǎo)GS、GOGAT酶活性的恢復(fù)，加強(qiáng)對(duì)銨態(tài)氮的同化，促進(jìn)氮代謝恢復(fù)正常。這與周萬(wàn)海等[40]對(duì)苜蓿(Medicagosativa)的研究結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)，暗處理、鹽脅迫或重金屬中毒等都會(huì)導(dǎo)致谷氨酸脫氫酶(GDH)活性的升高，而此時(shí)GS的活性是下降的，因此，推測(cè)GDH可能作為GS在不利情況下的一種補(bǔ)償[41]。本試驗(yàn)鹽脅迫下GDH、GS活性變化的趨勢(shì)與此一致。添加SA后，GDH酶活性降低，說(shuō)明SA能使顛茄幼苗抵御鹽脅迫的能力增加。

綜上，氮代謝失調(diào)是鹽脅迫下顛茄幼苗受傷害的原因之一。0.75 mmol/L外源SA能提升鹽脅迫下顛茄對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收能力，使氮代謝相關(guān)酶的活性恢復(fù)或增強(qiáng)，加速銨態(tài)氮同化，解除氨毒害，增強(qiáng)顛茄幼苗的抗逆能力。

3.4外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄幼苗葉片次生代謝的影響

植物的次生代謝是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中與環(huán)境相互作用的結(jié)果，次生代謝產(chǎn)物的積累與植物抗逆性的增強(qiáng)息息相關(guān)。目前普遍認(rèn)為，在植物正常生長(zhǎng)條件下，其體內(nèi)生物堿含量較低，而在一定的脅迫條件下，能量在次生代謝上的投入提高，生物堿含量增加[42]。本試驗(yàn)鹽脅迫下莨菪堿、東莨菪堿含量上升的結(jié)果與此一致。此外，梅興國(guó)等[43]、郭肖紅等[44]研究發(fā)現(xiàn)，添加外源物(誘導(dǎo)子)能夠有效促進(jìn)植物細(xì)胞中次生代謝物的合成，這往往伴隨著相關(guān)酶的合成或活性的提高。本試驗(yàn)施加外源SA后，顛茄次生代謝產(chǎn)物含量增加，氮代謝水平升高，而莨菪堿和東莨菪堿是一類含氮的有機(jī)物，其合成機(jī)制與氮代謝關(guān)系密切，推測(cè)氮代謝相關(guān)酶活性的改變影響了生物堿的積累。一方面，外源SA增強(qiáng)了GS、GOGAT等酶活性，促進(jìn)體內(nèi)吸收的無(wú)機(jī)氮向有機(jī)氮轉(zhuǎn)化，而這一循環(huán)產(chǎn)生的谷氨酰胺和谷氨酸是植物體內(nèi)合成氨基酸、核酸等含氮有機(jī)物的前體物質(zhì)[45]，谷氨酸在GOT等轉(zhuǎn)氨酶作用下形成的天冬氨酸[11]，最終可以參與到鳥(niǎo)氨酸循環(huán)中生成鳥(niǎo)氨酸，而鳥(niǎo)氨酸是托品烷類生物堿的底物。另一方面，鹽脅迫及外施SA后，GDH活性均比CK強(qiáng)，GDH可催化谷氨酸+NADP→α-酮戊二酸+NADPH+NH4+，合成的α-酮戊二酸是鳥(niǎo)氨酸的前體物，會(huì)在一定程度上促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成與積累；生物堿作為高含氮化合物，合成需大量的能量投入[42]，GDH脫氨形成的NAD(P)H，為體內(nèi)的生命活動(dòng)及次生代謝提供了能量[11]。因此，氮代謝的增強(qiáng)能為莨菪堿和東莨菪堿合成提供更多的代謝前體物及能量。

綜上，氮代謝與次生代謝關(guān)系密切，0.75 mmol/L外源SA能通過(guò)使氮代謝相關(guān)酶活性的恢復(fù)和增強(qiáng)直接或間接影響次生代謝產(chǎn)物的積累，期間合成的產(chǎn)物為顛茄葉片中莨菪堿、東莨菪堿的合成提供了底物和能量。

4 結(jié)論

100 mmol/L NaCl脅迫下，顛茄幼苗的自由基增多，使顛茄幼苗葉片的膜脂過(guò)氧化程度加劇，細(xì)胞膜及葉綠體等細(xì)胞器膜的穩(wěn)定性下降，光合機(jī)構(gòu)遭到破壞，光化學(xué)效率下降；Cl-和NO3-的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使無(wú)機(jī)氮吸收受阻，氮代謝紊亂，NH4+積累產(chǎn)生氨毒，顛茄的生長(zhǎng)受抑制。0.75 mmol/L外源SA能顯著緩解鹽脅迫對(duì)顛茄幼苗的傷害，提高了顛茄的耐鹽能力，通過(guò)提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)清除自由基的能力，以維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高了顛茄的滲透調(diào)節(jié)能力；通過(guò)調(diào)整光系統(tǒng)Ⅱ的能量分配，緩解光抑制；通過(guò)使氮代謝相關(guān)酶活性恢復(fù)或增強(qiáng)，為生物堿的合成提供更多的前體物質(zhì)和能量，從而直接或間接地促進(jìn)了次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。因此，葉面噴施SA溶液能為實(shí)際生產(chǎn)中緩解鹽脅迫對(duì)顛茄的傷害、提高東莨菪堿和莨菪堿的含量提供理論參考。

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EffectofexogenousSAonthephysiologicalbiochemistry,nitrogenmetabolismandsecondarymetabolismofAtropabelladonnaunderNaClstress

HU Xue-Huan1, NING Huan-Huan1, LIU Guang-Zhao1, WU Neng-Biao1，2*

1.School of Life Science, Southwest China University, Chongqing 400715, China； 2.Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing 400715, China

This study investigated the effect of exogenous salicylic acid (SA) on the physiology, biochemistry, nitrogen metabolism and secondary metabolism ofAtropabelladonnaseedlings under NaCl stress. We cultivatedA.belladonnaseedlings using soilless culture, treated with 100 mmol/L NaCl; 0.75 mmol/L SA was also sprayed onto the surface of the leaves. After application of SA, chlorophyll content increased and maximal photochemical efficiency (Fv/Fm), potential activity of PSⅡ (Fv/Fo), the efficiency of excitation energy capture by open PSⅡ centers (Fv′/Fm′), photosynthetic electron transport rate (ETR), actual PSⅡ photochemical efficiency (ΦPSⅡ) and photochemical quenching coefficient (qP) were all greatly enhanced, while initial fluorescence (Fo) and non-photochemical quenching coefficient (qN) significantly decreased. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) dramatically increased, while malondialdehyde (MDA) content decreased dramatically. Soluble protein content notably increased, while the contents of proline and soluble sugar decreased. The NO3-content increased, while the NH4+content decreased. The activities of glutamine synthetase (GS) and glutamate synthetase (GOGAT) increased, while glutamate dehydrogenase (GDH) activity decreased. The secondary metabolites, scopolamine and hyoscyamine, were increased significantly. The study indicated that exogenous SA could enhance photosynthesis inA.belladonna, adjust organic osmotic content, increase antioxidant enzyme activities and reduce the degree of membrane lipid peroxidation, alleviating the damage of NaCl stress. The recovery or enhancement of the enzyme activities of nitrogen metabolism promoted the synthesis and accumulation of secondary metabolites directly or indirectly by providing more precursors and energy for the synthesis of tropane alkaloids.

Atropabelladonna； NaCl stress； salicylic acid； nitrogen metabolism； secondary metabolism

10.11686/cyxb2017043http//cyxb.lzu.edu.cn

扈雪歡, 寧歡歡, 劉光照, 吳能表. 外源SA對(duì)鹽脅迫下顛茄生理生化、氮代謝及次生代謝的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(11): 147-156.

HU Xue-Huan, NING Huan-Huan, LIU Guang-Zhao, WU Neng-Biao. Effect of exogenous SA on the physiological biochemistry, nitrogen metabolism and secondary metabolism ofAtropabelladonnaunder NaCl stress. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 147-156.

2017-02-16；改回日期：2017-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500041)和國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510635010)資助。

扈雪歡(1995-)，女，廣西柳州人，本科。E-mail: hu_xuehuan@foxmail.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: wunb@swu.edu.cn